植物组织培养技术第四章：植物离体培养体系2
04第四章植物组织培养技术(二)
（1）环境要求远离污染源 （2）水电、交通 （3） 工艺流程 （4）节能（5）无菌
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3.商业化生产的配套设施
相应配套设施包括过渡培养室和露地炼苗场。
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4.商业化生产的工艺流程
试管苗商业化生产的工艺流程是以其快繁程 序为基础建立起来的，如最成熟的草莓脱毒苗生产 流程和葡萄试管快繁流程。通过茎尖脱毒建立起来 的草莓商业化试管苗生产，除必须配备的培养和驯 化等条件外，还应增加病毒鉴定室。
导不定芽产生，再以芽繁殖芽的方式进行增殖；兰 科植物、百合等则采用原球茎增殖途径，以保障繁 殖材料的遗传稳定性。
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2.增殖培养基
增殖率是植株快速繁殖特别是商业性繁殖的重要 指标。外植体在每次继代培养中，应能产生最大数量 的有效繁殖体。
基本培养基一般与启动生长培养基相同，而细胞 分裂素和矿物元素的浓度水平则高于启动生长培养基。 一般MS+BA 1~3 mg/ml+NAA0.1~1 mg/ml。
①繁殖速度较快。②遗传性不稳定，已产生变异。③愈伤组织 是遗传转化、细胞培养或原生质体培养的良好材料
• 器官发生型也是许多植物快繁的主要方式。由于不 定芽形成的数量与腋芽数目无关，其增殖率高于丛 生芽发生型。 • 但经过愈伤组织途径或者多次继代培养后，容易导 致细胞分裂不正常，增加变异植株发生频率。如香 蕉继代次数控制在8代之内，再生植株的变异率则 可控制在3%左右。
• 根系结构不完善的试管苗移栽后不易存活。要求根 系结构完整，具根毛，再生根的吸收能力强。 • 叶表皮组织不发达的试管苗也不易移栽存活。移栽 要求打开瓶口驯化2-3天；或在瓶内添加一些生长延 缓剂如PP333、CCC等培育壮苗。
植物组织培养技术 四
（二）离体胚形态发生及影响因素
1. 离体胚形态发生 （1）正常胚胎发育：成熟胚在适宜的培养条件下，
维持胚的生长进行正常的胚胎发育过程，直至 形成再生植株。 （2）胚性发育：幼胚生长增大至正常胚大小甚至 超过正常胚，但不能萌发成幼苗。可通过提高 培养基渗透压进行调整，也可以用生长素或天
（3）早熟萌发 ：幼胚在培养中越过正常胚发育阶 段，在未达到生理和形态成熟时迅速萌发长成幼 苗，这一现象称为早熟萌发。这样产生的苗往往 畸形、细弱、难易成活。因此，幼胚培养应防止 早熟萌发。
• 花粉培养来说，需制备花粉外植体： ①自然释放法。 ②研磨过滤收集法。 ③机械游离法。 ④磁拌法。
二、植株再分化 （一）脱分化培养
1. 培养方式的选择 2. 基本培养基的选择 3. 培养温度的选择 4. 生长调节物质的选择 5. 碳源的选择 6. 其他添加成分
1. 培养方式的选择
（1）固体平板培养：固体培养基上进行培养 （2）液体培养：在液体培养基表面进行培养 （3）双层培养 ：在固体——液体双层培养基进行
内发发育时不见光的，但是到萌发时器需要光。 光有利于胚芽生长，黑暗有利于胚根生长，因此， 以光暗交替培养更佳。 （4）培养材料
材料基因型不同，胚培养的难易程度也不同。 发育阶段以越幼嫩的胚越难以培养。 （5） 胚乳的看护培养
三、植物胚乳培养
（一）胚乳培养方法和培养后代特 征
1. 胚乳培养方法
（1）外植体取材：取待胚乳细胞的种子（或果实） 表面灭菌后，无菌条件下剥离胚乳组织接种。
3. 染色体数目鉴定 采用涂片法(或压片法)和去壁低渗法，通过检
查根尖或茎尖染色体数目，排除嵌合体的干扰， 可同时对根尖以外的细胞，如嫩叶细胞、花粉母 细胞等的染色体进行观察。
植物组织培养技术(四)
三、叶的培养
很多植物（非洲紫罗兰、香叶、天竺葵、 秋海棠等）的叶片具有很强的再生能力， 由于取材方便，数量多且均一性较强， 可以作为适宜的外植体。
基本培养过程
取叶片 表面消毒 平放在固体培养基上培养
大多植物的叶组织在离体培养条件下先形成愈伤 组织，再分化出胚状体、茎、叶和根。
1.将叶表面洗干净，70％乙醇浸泡30秒表面消毒， 用0.1％升汞浸泡数分钟。 2.叶片在培养基上的生长状况大多依赖于离体时 的成熟程度，幼叶比近成熟的叶生长潜力大。
图示茎段培养过程
去叶片用自来水冲洗 健康植株上选健壮的枝梢
0.1%升汞
MS培养基 再生 培养
75%酒精1分钟1Biblioteka 次氯酸钠4、茎的培养发育方向
腋芽萌发 脱分化后产生胚状体（原球茎） 离体繁殖
脱分化后直接产生不定器官
•脱分化后形成愈伤组织 建立悬浮系或 分化胚状体及 不定芽
蝴蝶兰腋芽萌发
5、影响发育方向的因素
第八章
器官培养
器官培养（Organ culture ）定义：
植物某一器官的全部或部分或器官原基的离体 培养，包括根、茎、叶、花、果实、种子等。 特点：
能保持器官所具有的特征性结构。
一、茎的培养
1、类型
茎尖培养： 10-100m的茎尖分生组织（脱毒） 茎段培养：带有腋(侧)芽或叶柄、长几厘米的
茎节段进行离体培养（快繁）
举例：非洲紫罗兰嫩叶离体培养的过程
叶片诱导丛生芽生根培养移栽。
非洲紫罗兰嫩叶，70％酒精略蘸一下，再0.1％升 汞溶液消毒5-8 min，无菌水冲洗数次，切成0.5-1 cm的小块接种于 MS + 1 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA
植物组织培养实验离体培养技术
植物组织培养实验离体培养技术植物组织培养实验离体培养技术是一种在无菌条件下，通过分离和培养植物细胞、组织和器官，使其在人工培养基上生长和发育的方法。
该技术可用于繁殖、育种、细胞学和分子生物学等方面的研究。
下面将介绍植物组织培养实验离体培养技术的步骤和应用。
一、实验步骤1. 消毒处理：将实验所需的工具、试剂、培养基等进行消毒处理，以保证实验的无菌条件。
2. 材料准备：准备植物材料，根据实验需要选择适合的植物种子、芽、茎段或叶片等。
3. 材料表面消毒：使用适当的消毒剂对植物材料进行表面消毒，以杀灭携带在材料表面的细菌、真菌等微生物。
4. 组织分离：将消毒后的植物材料进行切割、研磨等处理，将细胞、组织分离出来。
5. 培养基制备：根据实验需求，配置适当的培养基，包括基础培养基、激素、糖等成分。
6. 培养条件控制：将分离的植物细胞、组织置于培养基中，控制适宜的温度、光照、湿度等条件，促进细胞分化和生长发育。
7. 培养周期管理：定期更换培养基，检查细胞、组织的生长情况，及时调整培养条件，防止细菌、真菌污染。
二、技术应用1. 植物繁殖：通过植物体外培养技术，可以快速大量繁殖植物种子、芽、茎段等，加快繁殖速度，扩大繁殖规模。
2. 植物育种：利用离体培养技术，可以进行杂交、选择、突变等方法，对植物进行育种改良，获得对病虫害抗性强、产量高的新品种。
3. 细胞学研究：通过离体培养技术，可以对植物细胞进行融合和遗传转化等技术操作，从而探究细胞的形态、结构、代谢等方面的基本规律。
4. 分子生物学研究：离体培养技术可用于植物基因工程研究，如构建转基因植物、表达外源蛋白等。
5. 植物营养生理研究：通过离体培养技术，可以灵活控制培养基的成分，从而研究植物的营养需求、代谢物的合成和转运等问题。
6. 药物生产：某些药用植物可通过离体培养技术进行规模化生产，如对黄连、黄芩等中草药的快速繁殖和有效成分的提取。
总结起来，植物组织培养实验离体培养技术是一种重要的生物学研究方法，应用广泛且前景广阔。
植物组织培养
无菌条件下利用人工培养基对植物器官（organ）、 组织（tissue）、细胞（cell）、原生质体 （protoplasm）等进行培养，使之长成完整的 植株。
5
培养条件：离体无菌条件、人工培养 基
培养对象（培养材料）：器官、组织、 细胞、原生质体等
5. 植物原生质体分离和培养、体细胞的杂交技术， 体细胞无性系变异的诱导与筛选，植物细胞的 再生体系的建立和遗传转化。
4
三、植物组织培养的概念及其分类
1. 什么是植物组织培养？
植物组织培养（plant tissue culture）又称 为植物细胞组织培养（plant cell and tissue
1. 起始阶段
十九世纪30年代德国的植物学家Schleiden和动物 学家Schwann提出细胞学说，其主要观点：细胞是生物 体的基本结构单位，由它构成整个生物个体；同时认为植 物细胞又是在生理上，发育上具有潜在的全能性功能单位。
1858年Virchow在《细胞病理学》一书中所提出“一 切生命来自细胞”的观点和证据，有力的支持细胞是生命 的结构和功能的单位的学说。
1939年，法国的Gauthere、Nobecourt连 续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。
1952年，Morel和Martin首次通过茎尖分生 组织培养获得大丽花的无病毒植株。
1958年，Steward等报道在胡萝卜根韧皮部 细胞培养中形成了体细胞胚，并使其发育成完整 植株，第一次证实了植物细胞全能性。
1922年，美国的Kotte和Robbins分别获得离体根尖 培养的某些成功，能生长很长的一断时间，并进行继代培 养。
1925年，Laibach进行亚麻种间杂种幼胚培养也成功 地获得杂种植株。
植物组织培养技术
植物组织培养技术第一章绪论第二章植物组织培养实验室组成、仪器设备及无菌操作技术第三章植物组织培养基本原理第四章器官培养技术第五章植物胚胎培养第六章花粉及花药培养第七章细胞及原生质体培养第八章组培培养技术在中药学上的应用第一章绪论一、植物组织培养的概念1. 概念植物组织培养（Plant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。
2.主要特征（1）在培养容器中进行；（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。
（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。
二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。
1、根据培养材料不同分为：（1）完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。
（2）胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。
（3）器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。
（4）组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。
（5）细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。
（6）原生质体培养（Protoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。
2、根据再生途径分为：（1）器官发生途径（Organogenesis）：直接器官发生途径：植物器官可以直接由外植体上诱导。
如茎尖培养。
间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化（dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）过程而形成新的组织和器官的过程。
植物组织培养技术
植物组织培养技术1. 概念概念2. 发展与成果例证发展与成果例证3. 培养基的组成和配制培养基的组成和配制 4. 培养条件培养条件5. 培养材料及处理方法培养材料及处理方法 6. 技术流程技术流程1. 概念概念2. 发展与成果例证发展与成果例证3. 培养基的组成和配制培养基的组成和配制and and Skoog Skoog ）培养基配方为最常用的一种基本培养基，其特点是有利于一般植物组织和细胞的快速生长。
的快速生长。
4. 培养条件培养条件温度：温度： 对大多数植物组织20～28℃即可满足生长所需，其中26～27℃最适合℃最适合光：光： 组织培养通常在散射光线下进行。
光的影响可导致不同的结果。
有些植物组织在暗处生长较好，而另一些植物组织在光亮处生长较好，而另一些植物组织在光亮处生长较好，但由愈伤组织分化成器官时，但由愈伤组织分化成器官时，但由愈伤组织分化成器官时，则每日必须则每日必须要有一定时间的光照才能形成芽和根。
有些次生物质的形成，光是决定的因素。
要有一定时间的光照才能形成芽和根。
有些次生物质的形成，光是决定的因素。
渗透压：渗透压： 渗透压对植物组织的生长和分化很有关系。
在培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。
通常1～2个大气压可促进植物组织生长，2个大气压以上时，出现生长障碍，6个大气压时植物组织即无法生存。
个大气压时植物组织即无法生存。
酸碱度：酸碱度： 一般植物组织生长的最适宜pH 为5～6．5。
在培养过程中pH 可发生变化，加进磷酸氢盐或二氢盐，可起稳定作用。
磷酸氢盐或二氢盐，可起稳定作用。
通气：通气： 悬浮培养中植物组织的旺盛生长必须有良好的通气条件。
小量悬浮培养时经常转动或振荡，可起通气和搅拌作用。
大量培养中可采用专门的通气和搅拌装置。
或振荡，可起通气和搅拌作用。
大量培养中可采用专门的通气和搅拌装置。
5. 培养材料及处理方法培养材料及处理方法 从低等的藻类到苔藓、蕨类、种子植物等高等植物的各类、种子植物等高等植物的各类、各部分都可采用作为组织培养各部分都可采用作为组织培养的材料。
28841植物组织培养课程考试说明
28841 植物组织培养课程考试说明一、本课程使用的教材、大纲植物组织培养课程指定使用的教材为《植物组织培养》，由王蒂主编，中国农业出版社，2004年版。
二、本课程的试卷题型结构及试题难易度试卷分别针对领会、掌握、重点掌握三个认知和能力层次命制试题，三个不同能力层次在试卷中所占的比例大致是：“领会”20%，“掌握”40%，“熟练掌握”为40%。
3. 试题难易程度大致可分为：容易、中等偏易、中等偏难、难四个等级，试卷中不同难易度试题所占的比例，大致为容易占20%，中等偏易占30%：中等偏难占30%：难占20%。
三、各章内容分数的大致分布根据自学考试大纲的要求，试卷在命题内容的分布上，兼顾考核的覆盖面和课程重点，四、考核重点及难点第一章绪论（1）植物组织培养的学科基础；（2）植物组织培养的基本概念、特点、研究领域和应用。
第二章实验室及基本操作（1）植物组织培养培养基构成原理和组织培养的理论基础；（2）植物组织培养的实验室构成、重要设备的操作方法；（3）各种器具和材料的洗涤和灭菌方法；培养基的组成和配制，以及灭菌技术。
第三章植物组织培养的基本原理（1）植物组织培养的原理和组织分化的途径；（2）离体条件下器官的发生的途径，离体条件下植物形态形成的条件；（3）植物细胞的全能性；分化、脱分化、再分化、愈伤组织等名词的含义。
第四章植物器官和组织培养（1）离体条件下植物形态发生和植株再生的途径；（2）无菌外植体的获得过程，植株再生的途径，培养产物的观察记载和统计方法，植物茎段培养、叶和种子培养各自的产物的异同。
第五章植物胚胎培养及离体授粉（1）植物胚胎培养和离体授粉的应用；（2）植物胚培养的类型、应用和影响因素，植物胚乳培养的应用。
第六章植物花药和花粉培养（1）花粉小孢子的发育途径，（2）植物花粉和花药培养的概念和应用。
第七章植物细胞培养（本章不作考核要求！）第八章植物体细胞无性系变异（1）植物体细胞无性系变异的影响因素；（2）植物体细胞无性系变异的概念及其在育种中的应用。
第四章 植物组织培养拓展技术
4.6.3 人工种子的结构
4.6.3.1
体细胞胚 4.6.3.2 人工胚乳 4.6.3.3 人工种皮
人工种子结构示意图
4.6.4 人工种子包埋方法
4.6.4.1 干燥包理法
23℃，相对湿度为70％土5％，黑暗条件下逐 渐干燥。
4.6.4.2 液胶包理法
将胚状体悬浮在一种黏滞的流体胶中，直接插 入土壤。
机械分离法和酶解分离法的比较
机械法 1. 细胞不受到酶的伤害； 2. 机械法不用质壁分离； 3. 细胞产量低； 4. 细胞易破。 1. 细胞受到酶的伤害； 2. 要质壁分离； 3. 细胞产量高； 4. 细胞不易破。
酶解法
4.1.2 单细胞的培养 4.1.2.1 看护培养法
含义：用一块活跃生长的愈伤组织块来看 护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 用途：诱导形成单细胞系。 要求：看护愈伤组织处于活跃生长状态； 愈伤组织和所要培养的细胞可以是同一个 物种也可以不同。
先将植物叶片取下经过无菌处理后，在研钵 中轻轻研碎，经过一定孔径的纱布或不绣钢 滤网过滤，取出过滤后的研磨介质经过低速 离心等其他处理使细胞得到纯化。
4.1.1.2 酶解分离
用纤维素酶和果胶酶等酶液处理适合植物外 植体即可得到所需要的单细胞。
4.1.1.3 由组织培养物分离
离体培养的愈伤组织分离单细胞。
4.3 花药和花粉培养
4.3.1 花药培养
4.3.1.1 花药材料的选择
选择大致处于所需要时期的花蕾。由于 花粉发育时期和植株的某些外部形态特征 之间的大致相关性，因此利用这些外部标 志，选择符合条件的花蕾，经镜检确定花 粉发育的准确时期。
4.3.1.2 培养基的选择
园艺植物离体培养
（0721）《园艺植物离体培养》网上作业名词解释1．外植体用于组织培养（离体培养）的植物材料，如根、茎、叶、花药、胚珠等。
2．离体培养指从植物体分离符合需要的组织，器官或细胞（包括去壁后的原生质体、离开花药的花粉细胞等）等作为外植体，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养，以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他生物产品的一种技术。
3．不定芽在植物离体培养中，由外植体脱分化形成愈伤组织，继而形成一些分生细胞，分化形成一些芽丛，这些芽即是不定芽。
4．细胞全能性一个完整的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，植物细胞在适宜条件下具有发育成完整植株的潜在能力。
5．胞质杂种所谓胞质杂种（Cybrid）是指一个物种的细胞质（不包括核基因组）基因与另一个物种的细胞质和胞核基因融合为一体的体细胞杂种产物。
6．继代培养组织培养中，培养物培养一段时间后，为了防止培养的细胞团老化，或培养基养分利用完而造成营养不良及代谢物过多积累毒害等的影响，要及时将其转接到新鲜培养基中进行培养。
7．胚状体所谓胚状体（embryoid）：指在组织和细胞培养中产生的在形态结构上与合子胚相类似的结构。
对称体细胞胚（Somatic embryo），简称体胚。
8．原生质体培养原生质体就是除去细胞壁后的裸露细胞，经分离纯化的原生质体作为外植体，在适当的培养基和培养条件下进行组织培养的方法。
9.体细胞杂交体细胞杂交（Somatic hybridisation），或称原生质体融合，是以植物体细胞原生质体为亲本进行融合而获得杂种后代的一种细胞工程技术10. 愈伤组织培养答：是一团没有分化的可以持续旺盛分裂的细胞团，是组织培养过程中经常出现的一种组织形态。
有致密和疏松两类之分。
11. 单倍体育种答：通过花药或花粉培养获得的单倍体植株，经过秋水仙素等加倍成纯合二倍体。
12. 灭菌答：组织培养中，器皿和培养基可以分别采用干热灭菌和湿热灭菌。
植物组织培养技术第四章：植物离体培养体系
• 其他物质
– 玻璃纤维 滤纸桥 海绵等
辅助性物质
• 抗生素类物质
– 种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等 – 用量：5－20mg/L。 – 作用：防污染，减少材料损失 – 注意：抗生素对组织生长有抑制作用，使用要慎重。
• 抗氧化物
– 常用抗氧化剂：半胱氨酸、PVP、VC – 用量：50－200mg/L – 作用：防止氧化褐变 – 注意：可用抗氧化剂洗涤外植体伤口表面。
MS 有机物
C6H12O6 ·2H2O NH2 ·CH2·COOH C12H17ClN4OS ·HCl C8H11O3N ·HCl NC5H4COOH
激素类—培养基的关键性物质
• 激素影响到植物的细胞分化、分裂、发育 • 激素影响到植物的形态建成、开花、结实、
成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等的生理 生化活动 • 所以植物生长调节物是培养基的关键物质， 对植物组织培养起着决定性作用
植物离体培养体系建立的五大技术模块
• 植物离体培养的营养条件----培 养基的配制
• 外植体的选择 • 外植体的灭菌与接种 • 外植体的培养技术 • 炼苗移栽技术
第一节：植物离体培养的营养条件 —培养基
• 主要内容
– 培养基的营养组成 – 常用培养基的类型与筛选 – 培养基母液的配制 – 培养基的配制、消毒与保存
生长素
• 诱导愈伤组织形成 • 诱导根的分化 • 促进根、茎、芽的生长
组培中常用的生长素类调节剂
• 种类：NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；IBA(吲哚 丁酸)；2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)。
• 活性强弱与活性比：2，4-D>NAA>IBA>IAA； 活性比：IAA∶ NAA∶2，4-D = 1∶10∶100。
植物组织培养技术
植物组织培养技术植物组织培养是70年代快速发展并趋成熟的现代生物技术，是在含有营养物质及植物生长调节物质的培养基中离体培养植物组织(器官或细胞)的技术。
它的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每一个细胞都有分化成一个完整植株的潜在能力。
该技术在品种选育、名特优品种的快速繁殖、自然资源的保护、品种质量的提高、濒危植物种质保存等诸方面都表现出巨大的应用前景，取得了明显的经济效益。
组织培养前景广阔植物组织培养技术一诞生就表现了强大的生命力和美好的前景。
它在细胞学、遗传学、农学、生理学、生物化学等学科的基础理论研究中，成了一种常用的生物学技术;在实际应用中也发挥了巨大作用，取得了显著的经济效益和社会效益。
育种：通过组织培养技术，结合诱变育种技术，成功地培育出许多优良品种。
如抗黄化叶病的大麦品种;培育出脱病毒的马铃薯、甘蔗品种，使马铃薯产量增加十多倍;选育出早熟(比母本提早15天)、优质(含糖量9.5%)、高产(单果平均重106克)的京早三号桃(中科院植物所培育)等等，这些例子不胜枚举。
快速繁殖：应用组织培养技术可使某一个优良品种得到快速繁殖，可在一年内从一个芽或一张叶片，培养与繁殖成几十万或上百万株小苗，使得该优良品种很快得以推广。
如浙江省金华婺东葡萄良品场，1990年将日本引进的葡萄品种栽培成功后，我们通过快速繁殖，使每月的增殖系数达到6～9，可使一个芽在一年之内产生100万个芽。
快繁技术在花卉、果树等经济植物的优良品种繁育中，取得了良好的经济效益。
名、特、优、稀植物品种的保存与繁殖：许多名贵植物(如兰花)由于繁殖慢或困难，数量不多;而众多的野生植物(如花卉、药材)由于人们过度的采伐，变成濒危植物。
这些品种的保存与繁殖越来越显得重要与紧迫。
应用组织培养技术，不仅可以在实验室条件下保存种质，还可以进行工业化生产，大量繁殖来满足人类生活的需求。
无土栽培：现代正在快速推广的无土栽培技术，就是建立在组织培养的基础理论之上的，特别是无土栽培中的营养液成分，与组织培养的培养基配制基本相似。
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修剪外植体
接种
盖好瓶塞
外植体的灭菌处理
• 外植体灭菌流程 • 常用灭菌剂 • 灭菌关键性问题
– 适当的搭配 – 适当的浓度 – 适当的时间
外植体灭菌流程
材料的预处理 (剪切、清洗)
75%酒精 (20 s)
0.1%升汞 (15 min)
无菌水冲洗 （6次）
沥干
接种
外植体的预处理
对外植体进行修整,去掉不要的部分,在 流水下冲洗干净.
化的方法与技能。
一、外植体的种类与选择
1、外植体的种类
– 外植体是指植物离体培养中的各种接种材料。 包括植物体的各个器官、组织、细胞和原生质 体等。因此，可以作为培养对象的所有植物器 官、组织、细胞、原生质体等均是可选择的对 象。
常见外植体类型
• 茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高， 不易发生遗传变异，但取材有限）
消毒注意事项
1、表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒 剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。
2、在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以 除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。
3、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其 切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质 的吸收。
第二节： 无菌外植体的选择与处理
本节主要内容
• 外植体的种类与选择 • 外植体的消毒 • 外植体的接种 • 外植体的初代培养与观察
–培养条件 –外植体的污染及其防治 –外植体的褐化及其防治 • 外植体的继代培养 –培养物的分化诱导培养：愈伤组织的诱导与分化；不
定芽的诱导与分化。 – 试管苗的增殖与生根诱导培养 – 试管苗的玻璃化与防治
4、若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或 先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组 织培养。
5、HgCl2效果最好，但对人的危害最大，用后要用水 冲洗至少5次。
灭菌关键性问题
• 适当的灭菌剂搭配 • 适当的灭菌剂浓度 • 适当的灭菌时间
注意接种操作
• 防止污染 • 分布均匀 • 注意根据培养对象选择接种方法
易 易 易 较难 易 最易 易 较难 中
5-30 5-30 5-30 2-10 0.2-2 5-15 2-10 5-30 30-Байду номын сангаас0
很好 很好 很好 最好 好 好 很好 好 较好
常用的灭菌方法
(1)茎尖、茎段及叶片等的消毒：用清洁剂清洗---75%酒 精浸泡10-20min---无菌水洗2-3次或Naclo或升汞溶液泡 10-15min---无菌水洗3-4次
工作人员接种前应做的准备工作
• 个人卫生，穿工作服 • 洗手 • 用70% ~75%酒精擦手
酒精擦拭手
接种器皿、用具的灭菌
• 用具先用70%~75%酒精浸泡，后于酒精 灯外焰灼烧或用接种灭菌器灭菌。
酒精灯灼烧
器械消毒
酒精擦拭培养皿
外植体接种全过程
外植体消毒
浸泡5min
酒精擦拭
旋转灼烧
取外植体
– 选择健壮的植株：选取发育正常的器官或组织， 再生能力强，组培易成功。
– 选择最适的时期：一般按植物生长的最适时期选 取材料。
– 选择适宜的大小：根据不同的植物而异，太大容 易污染，太小，多形成愈伤组织甚至难于成活。 一般在0.5-1.0cm之间。
– 考虑发生途径：
外植体的选择与发生途径密切相关
作好接种前准备
（一）接种室的灭菌 （二）工作人员接种前应做的准备工作 （三）接种器皿、用具的灭菌 （四）超净工作台的灭菌 （五）材料的灭菌
接种室的灭菌
• 接种室的地面，墙壁要擦洗干净 • 接种前一夜用甲醛熏蒸10ml/m2 • 接种室还可以采用紫外灯灭菌
超净工作台的灭菌
• 开风机前将紫外灯打开30分钟以上 • 之后开风机15分钟 • 操作前用70%~75%酒精洗工作台面
• 茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） • 叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产
生植株，取材容易，操作方便，但易发生变异）； • 花球和花蕾 • 种子、根、块根、块茎、花瓣等。
常用的培养部位
茎尖
叶片
茎段
2、外植体的选择
• 选择原则
– 选择优良的种质：材料的选择要有目的,具有一定 的代表性,提高成功率,增加实用性。
外植体的表面灭菌
• 原则：
– 充分灭菌，但不伤外植体 – 不同的外植体，灭菌的要求也不一样
常用灭菌药剂的使用和效果：
消毒剂 次氯酸钠 次氯酸钙 漂白粉
升汞 酒精 过氧化氢 溴水 硝酸银 抗菌素
使用浓/%
2 9-10 饱和溶液 0.1-1 70-75 10-12 1-2
1 4-50mg/L
清除难易 消毒时/min 灭菌效果
• 微型扦插法：带一叶的单芽茎段 • 丛生芽增殖法：茎尖或腋芽 • 器官发生法：根、茎、叶或花器官的各部分 • 胚状体发生法：胚性分生组织或生殖器官
二、外植体的消毒与接种
掌握一个原则：杜绝一切可能的污染 • 明确污染来源 • 作好接种准备 • 注意接种操作 • 监测接种效果
人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。
学习目标
• 掌握外植体选择、消毒及接种的方法与技能 • 熟悉外植体初代培养与观察的方法与过程 • 理解外植体污染与褐化的原因，掌握防治外植体
污染与褐化的方法与技能。 • 掌握培养物的分化诱导培养的方法与技能 • 掌握试管苗的增殖与生根诱导培养的方法与技能 • 理解试管苗玻璃化的原因，掌握防治试管苗玻璃
污染来源
物品因素
器 培养皿：洗→热压 皿 和 玻璃器皿：洗→干热（干热箱）或晾干 用 接种用具：用CCL4布擦→湿布擦→ 具
泡75%~95%酒精→烧
培养基：湿热
外部细菌：用水冲洗→化学药剂处理 培
养
材
茎尖培养 内部细菌
料
加抗生素：青霉素、利福平
操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸（甲醛或者甲醛： 高锰酸钾=10:1)
（2）果实和种子的消毒：自来水冲洗10-30min---70%酒 精漂洗---2%Naclo液浸10min---无菌水2-3次---取出种子 培养 （3）根及地下部器官的消互毒：自来水冲洗---纯酒精 漂洗---升汞浸5-10min或2%Naclo液浸10-15min---无菌水 洗3次 （4）花药的消毒：自来水冲洗 70%酒精浸泡数秒钟--无菌水洗2-3次---漂白粉上清液浸10min---无菌水洗2-3次