限制性内切酶酶切反应的标准操作规程
实验十二 DNA的限制性内切酶酶切分析
实验十二 DNA的限制性内切酶酶切分析实验目的：通过限制性内切酶酶切分析，了解DNA的结构和特性，掌握限制性内切酶的使用方法，以及掌握DNAGel电泳技术。
实验原理：限制性内切酶是一类可切割DNA分子的酶，可特异性地识别DNA的特定核苷酸序列并切割它们。
限制性内切酶可以将DNA切割成特定大小的DNA片段，这些片段可以进一步用于基因克隆、DNA指纹分析、DNA测序、DNA杂交等。
将DNA和内切酶一起反应一段时间后，可以通过电泳将酶切后的DNA片段按大小分离，从而得出不同DNA序列的长度和特征，达到对DNA结构特点进行研究的目的。
实验步骤：1. 从实验室提供的细菌菌株中提取DNA样品。
2. 将DNA样品用水稀释到适当浓度。
3. 按照所选内切酶的说明书，将相应量的酶加入DNA样品中。
混匀并放在37℃的水浴中进行反应1-2小时。
4. 制备1%的琼脂糖凝胶。
5. 将酶切后的DNA和DNA加载缓冲液混合后，放入琼脂糖凝胶槽中。
6. 进行DNAGel电泳，根据DNA片段的大小，将DNA分离开。
7. 取出凝胶进行染色，直接观察或用紫外线透射方式扫描成像。
实验注意事项：1. 在实验室中需要严格遵守生物安全措施，避免污染。
2. 在进行内切酶酶切反应时，需要严格按照酶的使用方法进行操作，以保证反应质量和结果准确。
3. 在制备DNA样品时需要避免DNA的降解或氧化。
4. 在进行DNAGel电泳时需小心操作，以避免凝胶破损或电流过强，影响实验结果。
实验结果分析：通过限制性内切酶酶切分析后，可以得到DNA片段的长度和特征，从中了解到DNA的特性和结构。
实验结果需要根据实验方法、酶的选择等进行分析和总结，以便进一步推进科研工作。
酶切操作技巧
酶切操作技巧实验材料实验耗材：枪头（10μl、200μl）、EP管(200μl)试剂：限制性内切酶及buffer、ddH2O准备工作：冰，37˚C水浴、质粒或PCR产物实验操作步骤：酶切反应体系成分体积（µL）质粒或PCR产物<1µgBuffer2限制性内切酶1 1限制性内切酶2 1ddH2O Up to 2037˚C水浴2h。
注意事项：1. 尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的buffer，以及各酶在公用buffer里的效率。
2. 双酶切时间及其体系：一般酶切2个小时，酶切效率低的可适当延长时间，酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul 体系中酶解1ug DNA。
3. 两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。
4. 双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表，如果有一种buffer 能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer；如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和；任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20 ul。
如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同则必须分别做酶切。
第1种酶切后要考虑用酚抽、电泳后胶回收或加热等方法使酶失活后再进行下一次酶切反应。
厂家目录一般都会有相应的附录以供查阅各种酶的反应温度。
有的酶可以用加热使之失活，如CIAP；有的则不行。
5. 酶量的问题：不同公司的酶活力单位不同，按说明书的酶切体系添加酶量，按反应条件进行酶切反应。
限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验原理及步骤、注意事项
实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。
许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。
例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。
5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。
限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。
根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。
根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。
小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。
本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。
在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。
在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。
二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。
2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。
DNA限制性内切酶酶切反应
一、核酸限制性内切酶
• II型酶就是通常基因工程中使用的DNA限制性内 切酶。II型酶限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶 组成。II型限制酶需要Mg2+作为催化反应辅助因 子，能识别双链DNA的特定序列，一般为4-6个碱 基的反转重复序列。II型限制酶一般在识别序列内 进行切割，产生特异的DNA片断。
切割下来，装入1.5ml微量离心管中。 ⑦ 置-20℃保存。
• 本周实验报告： 1. 实验原理 2. 实验步骤 3. 实验结果 4. 实验结果分析 • 下周请预习：离心吸附柱法从琼脂糖凝胶
中回收DNA
0.5μl
④ Xho I (10Units/μl)
0.5μl
2. 混匀试剂。将离心管置37℃水浴，反应1小 时。
三、实验步骤
3. 琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段
① 制备1%琼脂糖凝胶。 ② 在每个酶切反应管中加入1/10体积10X上样缓
冲液，混匀。 ③ 将样品平均加入2个加样孔内，每个孔加样
27.5μl。 ④ 135V衡压电泳30-40分钟。 ⑤ 在紫外灯下观察酶切条带。 ⑥ 将酶切完全的质粒大片断、PCR产物从凝胶中
二、限制性内切酶酶切反应
2. 酶切温度及时间：根据产品说明确定最佳反应 温度。反应时间不宜太长，以免内切酶产生星 活性。
– 星活性（Star Activity）：是指限制性内切酶在某 些反应条件产生的识别并切割非特异序列位点的现 象。其结果是酶切条带增多。
– 星活性除了与酶本身的性质有关外，与酶过量、甘 油浓度过高，pH值不合适、离子浓度过低、酶切 时间过长等有关。酶切时间比增加酶量更易产生星 活性。
DNA限制性内切酶酶切分析
DNA限制性内切酶酶切分析一、原理限制性内切酶和基因载体是DNA重组技术中的两个极其重要的方面。
限制性内切酶是首先在大肠杆菌中发现的能够分解外来DNA的核酸酶。
与核酸外切酶相比，该酶可从DNA双链内部特异的核苷酸序列处将DNA双链切断，产生带有粘性或平头末端的DNA片段。
把要克隆的外来DNA和载体DNA用同一种限制性内切酶切割，即可产生带有相同粘性末端的DNA片段。
如果同时用两种不同的酶切割，则可产生带不同粘性末端的片段，通过电泳分离出所需要的目的基因片段。
把目的基因与切开的载体DN A混合，再经过DNA连接酶处理，转化和筛选即可得到希望的重组子。
进行DNA酶切时，根据具体情况可用单酶切或双酶切。
特定的酶有其配套的缓冲液。
进行双酶切时，应选用两种酶都适合的缓冲液；如果两种酶要求的温度不同时，先在较低温度下酶切，然后在较高的温度下酶切。
二、目的了解限制性内切酶的特性和DNA分子的结构，掌握DNA限制性内切酶酶切的图谱的分析方法。
三、材料、试剂与器具1、DNA样品。
2、限制性内切酶。
3、10×限制性内切酶反应缓冲液。
4、无菌双蒸水。
5、0.5M EDTA (pH 8.0)溶液。
6、10×TBE buffer。
7、琼脂糖。
8、溴化乙锭溶液。
9、上样缓冲液（40%蔗糖，0.25%溴酚兰）。
10、微量离心管、微量加样器、水浴锅、台式高速离心机、电泳仪、水平电泳槽。
11、10mg/ml Rnase。
四、操作步骤1、将在－20℃保存的DNA样品和10×限制性内切酶反应缓冲液取出，放在冰浴上融化待用。
2、取一干净无菌的微量离心管,按顺序加入以下组分：DNA样品 0.1-2mg10×内切酶反应缓冲液 1ml内切酶1 1ml内切酶2 1ml加无菌水至 10ml3、离心1秒钟，使管壁上的溶液集中到管底。
用手指轻弹管底部位使之混合，再离心一次，使管壁上的溶液集中到一起。
4、在37℃温育60－120分钟。
实验三 限制性内切酶酶切反应
+
AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶 16º C
GA A T T C CTTAA G A GATCT TCTAGA
重组体
三、实验操作流程
37℃
四、操作过程
酶切体系建立
ddH2O DNA 10×buffer 内切酶 总体积 10ul 7ul 2ul 1ul 20ul
酶切 （37℃）
电泳检测
ddH2O DNA 10×bufferM HindⅢ 总体积
10ul 7ul 2ul 1ul 20ul
ddH2O DNA 10×bufferH EcoRⅠ 总体积
10ul 7ul 2ul 1ul 20ul
实验结果与分析
载体与目的DNA片段的双酶切及连接
Xba1切割位点
GAATTC CTTAAG
BamH1切割位点
AGATCT TCTAGA
GA A T T C CTTAA G A GATCT TCTAGA
Xba1+BamH1双酶切
AATTC G A TCTAG
Xba1+BamH1
AATTC G GATCT A
双酶切
实验三 限制性内切酶酶切反应
一、实验目的
了解常用限制性内切酶的特性； 掌握酶的使用方法。
Hale Waihona Puke 二、实验原理
限制性内切酶与连接酶的配合使用为重组 DNA技术奠定了酶学基础。 限制性内切酶是基因工程中用于体外剪切 基因片段的重要工具酶，这类酶的特点是具有 能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的 能力，并能在这个特异性核苷酸序列内，切割 能产生平端或粘性末端，切口处有固定的序列， 所以可方便的连接到载体的特定的位点处并可 以方便地切下，进行DNA片段的改造工作。
实验六-酶切
三、酶切效率影响因素
DNA纯度 缓冲液 温度条件 限制性内切酶本身 大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响
四、使用限制酶注意事项
当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进 一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸 管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各 自的最适盐浓度。
3．DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力； ②存在第二种限制性内切酶污染；③样品DNA中含有其它 DNA。
2000bp
1000bp 750bp
不完全酶切
2000bp
1000bp 750bp 500bp
完全酶切
Marker-PUM
2686bp 2050bp 1507bp 1119bp 878bp 500bp
二、限制性内切酶类型
第一类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附 近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的 核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
第二类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内 的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别 和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸 顺序的DNA片段。
酶切反应体系(50μl)
模板DNA：5μl 限制性内切酶10×Buffer：10μl (2×) 酶：各0.5 μl 去离子水：34 μl
双酶切
同步双酶切 分步酶切
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶 切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要 求，然后加入第二种酶完成双酶切反应
1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失 活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限 制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不 存在该酶的识别顺序。
DNA的限制性内切酶酶切
DNA的限制性内切酶酶切实验目的1.掌握DNA限制性内切酶酶切的原理与实验方法。
2.了解限制性内切酶的特点。
实验原理限制性内切酶是基因工程中剪切DNA分子常用的工具酶，它能识别双链DNA分子内部的特异序列并裂解磷酸二酯键。
根据限制性内切酶的组成、所需因子及裂解DNA的方式不同可分为三类，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。
重组DNA技术中所说的限制性内切酶通常指Ⅱ型酶。
绝大多数Ⅱ型酶识别长度为4～6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列5′-G↓AATTC-3′），有少数酶识别更长的序列或简并序列。
实验器材移液器、移液器吸头、1.5ml离心管、离心管架、水浴锅、离心机、制冰机、漂浮板等。
实验试剂（1）DNA样品：质粒pUC19和基因3055。
（2）限制性内切酶、BamH I和EcoR I。
（3）通用型DNA纯化回收试剂盒（试剂盒组成见本篇“实验四DNA片段的纯化与回收”）。
实验操作（1）取2支离心管，在冰上按以下顺序分别配制酶切反应体系（50μl）：质粒pUC19/基因3055 43μl限制性内切酶5μlBamH I 1μlEcoR I 1μl（2）加完反应体系后，用手指弹管壁混匀，短暂离心，使反应液甩入离心管底部。
（3）将离心管插入漂浮板上，放置于水浴锅中，37℃水浴15min，然后80℃加热20min终止反应。
（4）使用通用型DNA纯化回收试剂盒回收酶切产物。
注意事项（1）注意要在冰上操作。
（2）加入限制性内切酶时，移液器吸头应贴着离心管壁沿着液面加入。
实验意义限制性内切酶是重组DNA技术中常用的工具酶，在体外构建重组载体时，用于特异性切割载体及目的基因。
思考题如何根据载体和目的基因选取合适的限制性内切酶？。
酶切操作流程
酶切操作流程酶切是分子生物学领域中常用的一种技术，它可以通过切割DNA 分子中的限制性内切酶切位点来获得所需的DNA片段。
本文将介绍酶切的操作流程，包括DNA制备、酶切反应、凝胶电泳和回收纯化等步骤。
一、DNA制备首先需要从细胞或组织中提取DNA，常用的方法包括CTAB法、盐法、商用DNA提取试剂盒等。
在DNA提取过程中需要注意以下几点： 1. 样品的选择：样品的选择应根据实验需要进行，如想要提取植物DNA，则需要选择新鲜的植物材料。
2. 细胞破碎：细胞破碎是DNA提取的关键步骤，可以采用机械破碎、化学破碎、超声波破碎等方法。
3. DNA纯化：提取的DNA需要经过纯化处理，如使用酚/氯仿法、硅胶柱等方法。
二、酶切反应在DNA制备完成后，需要将DNA加入限制性内切酶反应体系中进行酶切。
酶切反应需要注意以下几点：1. 选用合适的酶：根据实验需要选择合适的酶，如EcoRI、BamHI、HindIII等。
2. 反应体系的配制：反应体系包括酶、DNA、缓冲液和水，需要按照酶的使用说明书进行配制。
3. 反应条件的控制：酶切反应需要控制反应时间、反应温度和反应缓冲液pH值等条件，以保证反应的效果。
三、凝胶电泳酶切反应完成后，需要进行凝胶电泳检测，以确定所得DNA片段的大小和纯度。
凝胶电泳需要注意以下几点：1. 凝胶的选择：凝胶的选择应根据所需检测的DNA片段大小进行，如需要检测100bp以下的DNA片段，则需要选择1%琼脂糖凝胶。
2. 电泳条件的控制：电泳条件包括电场强度、电泳时间和电泳缓冲液pH值等，需要根据凝胶的选择和实验需要进行调整。
3. 显色染色：电泳结束后需要进行显色染色，如使用乙溴酸溶液染色，以显示DNA片段的大小和数量。
四、回收纯化通过凝胶电泳可以确定所需的DNA片段，需要将其从凝胶中回收并进行纯化处理。
回收纯化需要注意以下几点：1. 切割凝胶：可以使用切割刀或针头将所需的DNA片段从凝胶中切割出来。
双酶切连接反应之全攻略
双酶切连接反应之全攻略一、实验原理：1.首先，将待连接的两个DNA片段通过限制性内切酶酶切，产生两个具有互补末端的DNA片段。
2.再利用DNA连接酶，以这些互补末端为引导，将两个DNA片段连接在一起。
3.最后，通过热激励反应，将连接酶不活性化。
二、实验步骤：1.设计引物：根据待连接的两个DNA片段的序列，设计合适的引物，使得限制性内切酶切割后的末端具有互补性。
2.DNA酶切：将待连接的两个DNA片段与限制性内切酶一同反应，根据内切酶的适宜反应条件进行酶切反应。
3.酶切产物纯化：将酶切产物进行电泳分离，通过切胶取带的方式将目标片段分离出来，然后进行片段纯化。
4.连接反应：将纯化后的两个DNA片段与DNA连接酶一同反应，根据连接酶的适宜条件进行连接反应。
一般而言，反应体系中还需要包含ATP供能和缓冲液等。
5.连接产物纯化：对连接反应的产物进行纯化，一般选择柱层析法（如凝胶过滤法、离心柱法等）或酸酶消化法（如酚氯仿法）等方法。
6.验证连接效果：通过DNA测序等方法验证连接效果，确保连接成功。
三、实验注意事项：1.引物设计要合理：引物的设计要充分考虑到限制性内切酶的切割位点和连接效率。
合理选择引物长度和碱基组成，避免引物之间产生非特异性连接。
2.内切酶酶切条件的选择：根据所使用的内切酶的反应条件和切割位点，合理选择反应温度和反应时间，确保内切酶可以有效切割DNA片段。
3.DNA连接酶的选择和反应条件：根据实验需要，选择合适的DNA连接酶，考虑到连接效率和连接酶的活性等因素。
同时需要注意反应缓冲液的pH和温度等条件。
4.连接产物纯化：选择合适的纯化方法，确保连接产物的纯度和浓度。
同时注意纯化过程中的温度和pH等条件，避免产物降解或损失。
5.连接效果的验证：通过DNA测序方法验证连接效果，并且需要对连接的序列进行分析，确保连接正确。
四、实验应用：1.基因克隆：用于将外源基因克隆到载体上，以便于大规模扩增和表达。
生物化学--实验十五DNA的限制性内切酶酶切分析
实验十五 DNA的限制性内切酶酶切分析【目的要求】1.掌握限制性核酸内切酶的基本概念、作用特点及作用原理2.熟悉DNA的限制性内切酶酶切分析操作技术及其影响因素3.了解DNA酶解技术生物研究领域的应用【实验原理】限制性内切酶(restriction endonuclease，RE)是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸顺序(一般具有双重对称的回文结构)，并以内切方式水解水解双链DNA的核酸水解酶。
它主要分布于细菌体内，目前已发现1800多种。
根据酶的组成、辅助因子及水解DNA的方式不同，可将限制性内切酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型，而Ⅱ型限制性内切酶是重组DNA技术中常用的限制性内切酶，如Eco RⅠ、BamHⅠ等，它们被誉为分子生物学家的手术刀。
临床上某些遗传病由于基因突变发生在限制性内切酶切割位点，因此当用一定的限制性内切酶切割时，产生的酶切DNA片段大小就会与正常人酶切DNA片段发生差异，因而发生DNA限制性酶切图谱改变，据此可达到基因诊断的目的。
实验选用价格低廉、酶切效果较好的Eco RⅠ(识别位点G↓AATTC)对λDNA进行酶切分析，观察限制性内切酶的特定切割作用及其限制性图谱，理论上可产生21226bp，7421bp，5804bp，5604bp，4878bp和3530bp等不同分子量的DNA片段。
经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外扫描仪下摄影即可观察到λDNA的Eco RⅠ限制性酶切图谱。
【实验准备】一、器材1.恒温水浴箱2.电泳仪和电泳槽3.紫外扫描分析仪4.台式高速离心机5.微波炉6.加样枪、EP管及试管架等二、试剂1．DNA底物λDNA或质粒DNA或制备的肝组织DNA。
2．限制性内切酶Eco RⅠ及其缓冲液购自华美生物工程公司，每种限制性内切酶均配有2种缓冲液，在配套的缓冲液中该限制性内切酶均可获得100%酶切活性。
3．10×TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml，加蒸馏水至500ml。
限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒作业指导书
限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒作业指导书实验目的掌握单、双酶切的技术，理解酶切法进行重组质粒进行鉴定的原理。
实验原理(一)酶切各种限制性内切酶能专一地识别碱基顺序，例如，Eco R Ⅰ酶的识别顺序为：GAATTC；Scal I酶的识别顺序为：AGTACT，用Eco R I和Scal I同时酶解含有这两个单一酶切位点的环状双链DNA分子，就产生两条带有相应酶切位点的线性DNA分子。
当Eco R I和Scal I同时酶切一个质粒DNA时，酶切反应必须完全。
不同酶切反应都需要Mg2+并要求一定的盐离子浓度，但不同的酶达到最佳酶切效率所需的盐浓度不同。
因此生产厂商在销售酶的同时往往附带专门的缓冲液。
如果盐离子浓度使用不当，会使酶的识别位点发生改变，例如当盐离子浓度低于50mmol／L时，Eco R I内切酶的专一性就降低，只能识别中间的4个核苷酸序列(称该酶为Eco R I*)。
绝大多数酶的反应温度是在370C，酶切反应时间需30min、60min以至2h以上。
一般来说，如酶的纯度不佳，酶切时间不能太长。
终止酶切反应时，大多数可在65℃水浴中，保温10min，就可使大部分酶失活。
Eco R I酶置65℃水浴中，保温10min，丧失95％的酶活性。
内切酶一般都保存在50％甘油的缓冲液中。
当保存在10％甘油中时，酶活力丧失更快。
少数较耐热的酶，在加热前先加pH7.5的EDTA，至终浓度为10mmol／L。
EDTA螯合了反应系统中所有的二价阳离子，就更便于终止酶切反应。
酶切要完全，酶解的数量也要适当。
设计酶解DNA的数量时，除了根据连接与转化的要求外，还要按照DNA浓度的高低，酶液单位的高低等具体情况而定。
同时还要考虑到DNA每经一步处理，就得重新纯化，这样DNA浓度的损失量几乎达到50％。
并且每经一步操作后，都要取一定量的DNA样品进行电泳鉴定或作为电泳对照样品。
因此，在设计酶解数量时，不能用量太少，但是酶解数量过多，势必要消耗大量限制性内切酶和DNA，这也是不必要的。
实验五 质粒DNA酶切(质粒限制性内切酶消化酶切)
AccⅠ识别序列
AccⅠ
能切割 T CCGG AGA
不能切割 T ×CCGG 6mATC
注意此处的区别
dam甲基化酶识别序列
采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA 的甲基化。
③ 酶的星活性 (star activity)
又称第二活力，是指改变了酶切反应条件后特异序列识别特性降低的 一种现象。由于识别特异性的降低，可能对原识别序列相似的序列也产生 切割反应。
第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源 基因的插入。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源 DNA片段。 一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即：启动子——核糖体结合位点——克隆 位点——转录终止信号。 这是用来区别克隆载体与表达载体的。克隆载体中加入一些与表达调控有 关的元件即成为表达载体。
Eco RV (10442)
35S prom oter UTR
多克隆位点 pUC18 MCS lacZ promoter
35S prom oter
Eco RV (8842)
绿色荧光蛋白基因 GFP NOS 终止子加尾信号
T-DNA right border
HPT 潮霉素抗性基因
加尾信号，终止位UT点R T-DNA left border
10549 bp
Kan
Eco RV (6218)
pBNA中由于有较多的EcoR Ⅴ识别位点，因此，经 EcoR Ⅴ酶切后产生大小不一的条带，电泳后整个泳道呈现均一 的亮带。
酶切前的DNA
酶切后的DNA
实验材料和试剂
限制性内切酶的一般原则和建议
限制性内切酶的一般原则和建议1．如何做酶切反应？该问题看似什么简单：DNA中加上酶，然后保温一段时间就可以了。
但是在实际操作过程中，我们不断听到：切不动，装不上。
问题在什么地方？能系列生产限制性内切酶的公司国际上，就那么几个，位列前3 的是NEB, Fermentas, SibEnzyme。
这些公司提供酶的品质一般都能得到保证。
您可以怀疑酶的质量问题，但是更多的问题来源于模板是否合适酶切要求。
下面几点对你的酶切是有帮助的。
1) 成功酶切的关键是准备好模板DNA。
DNA样品中不能含有有机溶剂（会使酶变性或产生星号货性），不能含有干扰酶活性的污染物质，不能含有高浓度的EDTA (TE中的EDTA 浓度较低，对Mg的浓度影响较小)；同时要对DNA甲基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。
2) 选用合适的酶。
根据酶切序列选用，特别注意选用甲基化对酶活性的干扰。
3) 正确使用和保存酶。
酶需要保存在-20度的低温环境中，只是在需要用酶才从冰箱中取出来。
运输和临时存放时需要将酶至于冰上。
手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分，移酶时尽可能用长TIP, 避免污染。
用完后需要及时送回原处。
注意：酶通常是最后加。
所有4) 反应体积需要根据实验目的定，常规的酶切一般要维持在10-50ul，酶切鉴定10-20ul就可以了。
5) 模板浓度问题：浓度过高，溶液黏度过大，酶不能有效扩散，酶切效果不会好。
浓度过低，也会影响酶活性。
6)注意模板用量和反应体积的关系。
对酶用量，模板用量，反应体积等要素的确定需要的是时间和经验的积累。
7) 酶切反应的各个组分加完后，需要用TIP小心混匀几次，short spin 一下就可以保温了。
一般不能使用振荡器混匀。
8) 反应温度的选择。
一般反应都用37度，但是Sma I 的最适合温度是25度，37度时酶仍表现出活性，但是效率下降50%。
部分从耐热菌制备的酶需要在37度以上的温度反应，如Taq I的最适温度为65度，37度保温，效率仅为前者的1/10。
2.实验二-质粒DNA的限制性内切酶酶切
取实验一中提取的质粒，向其中加入10μL灭菌的双蒸水使其充分 取实验一中提取的质粒，向其中加入10μL灭菌的双蒸水使其充分 10μL 溶解，测定其dsDNA浓度。然后按下表进行操作： 溶解，测定其dsDNA浓度。然后按下表进行操作： dsDNA浓度
实验组 Buffer EcolⅠ Ⅰ Hind Ⅲ 质粒 ddH2O 总体积 4 3 3 X 10-X 20
是体外剪切基因片段的重要工具所以常常与核酸聚合酶是体外剪切基因片段的重要工具所以常常与核酸聚合酶连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶
质粒DNA DNA的限制性内切酶酶切 实验二 质粒DNA的限制性内切酶酶切
一 实验目的
了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 DNA
二 实验原理
型酶识别的DNA序列一般含有4 个核苷酸。 DNA序列一般含有 Ⅱ型酶识别的DNA序列一般含有4～6个核苷酸。有的在识别顺序 的对称轴上对双链DNA同时切割产生平末端； 的对称轴上对双链DNA同时切割产生平末端；有的在识别顺序的双侧末 DNA同时切割产生平末端 DNA双链产生粘性末端 双链产生粘性末端。 型限制性内切酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ Mg2+激活 端DNA双链产生粘性末端。Ⅱ型限制性内切酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ 型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。 型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。 质粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列， 质粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列，可 DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列 被相应限制性内切酶切出相应数量的切口， 被相应限制性内切酶切出相应数量的切口，从而产生相应数量的酶切 片断。 片断。 本实验采用PMD18- 质粒具有EcoRⅠ Hind的识别序列和酶切位 EcoRⅠ和 本实验采用PMD18-T质粒具有EcoRⅠ和Hind的识别序列和酶切位 PMD18 点分别为 GAATTC CTTAAG 和 AAGCTT TTCGAA
限制性内切酶酶切注意事项
一、限制性内切酶酶切注意事项在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。
根据各种不同的条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题：1. 大多数限制酶贮存在50%甘油溶液中，以避免在-20 C条件下结冰。
当最终反应液中甘油浓度大于 12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。
因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。
2. 浓缩的限制酶可在使用前用1邓艮制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活，用水稀释的酶不能长期保存。
3. 反应体系中Mg2+是限制酶仅有的共同因子，当用其它二价阳离子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA时，酶活性会被抑制，或改变酶的特异性，导致星型反应。
4. 多种因素可引发星型反应：①非最适的pH;②Co2+、Mn2+、2n2+取代 Mg2+;③酶浓度大于25u/ug ；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在（＞12%）；⑥有机溶剂的存在。
5. 反应混合物中 DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。
建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul 。
6. 酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定，对不同的限制酶，各厂家均有一最大的消化量指标可参考。
7. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA然后加入适量 NaCl及第二种酶，继续反应;②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。
8. 用同一种酶切割不同的DNA时，所需酶量不同，可根据DNA底物上酶切位点的多少与ZDNA 存在位点的数目比较后，决定用酶量。
实验八_DNA的限制性内切酶酶切和鉴定
5´GAATTC EcoRⅠ CTTAAG 5´
AAGCTT HindⅢ 5´ TTCGAA5 5´
质粒pUC18的物理图谱 的物理图谱 质粒
三、材料
重组质粒； EcoRI酶及其酶切缓冲液: 购 买成品； HindⅢ酶及其酶切缓冲液: 购 买成品;琼脂糖(Agarose) 。 四、仪器 移液器及吸头，水平式电泳装置,电泳仪, 台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液 枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪。
五、试剂
1、 5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。 2、 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 3、 溴化乙锭(EB)溶液
六、操作步骤 1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml) 编号,用微量移液枪分别加入质粒DNA （5---14 µl）和 相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2µl,再加入重蒸水 使 总 体 积 为 18µl, 将 管 内 溶 液 混 匀 后 加 入 EcoRI 和 HindⅢ 各1µl,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量 d 离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验 成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应 尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 2、 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支 持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1-3小时, 使酶切反应完全。 3、 每管加入2µl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停 止反应,置于冰箱中保存备用。
酶切原理及步骤
酶切原理及步骤酶切是分子生物学实验中常用的技术手段，用于切割DNA或RNA分子。
酶切的原理是利用特定的限制性内切酶识别特定的DNA序列，然后在该DNA序列的特定位置切割，从而获得特定大小的DNA片段。
以下将详细介绍酶切的原理及步骤。
**酶切的原理**：1. 内切酶的特异性：内切酶是一种酶类蛋白质，具有识别特定DNA序列的特异性。
不同的内切酶可以识别不同长度的DNA序列，例如EcoRI内切酶识别并切割5'G↓AATTC3'序列。
2. 切割方式：内切酶在识别特定DNA序列后，会在特定的酶切位点上切割DNA分子，形成切割后的DNA片段。
3. 切割后的DNA片段：切割后的DNA片段可以被用于分子克隆、DNA测序、PCR等分子生物学实验。
**酶切的步骤**：1. 选择内切酶：根据实验的需要选择合适的内切酶，考虑DNA序列的长度和酶切位点的特异性。
2. 切割DNA：将DNA样品与选择的内切酶一起反应，使酶识别特定的DNA序列并切割DNA分子。
酶切反应通常在特定的温度和时间下进行。
3. 酶切后的处理：酶切后的DNA片段可以通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和分析，也可以直接用于后续的实验操作。
4. 实验验证：为了验证酶切反应的成功，可以通过琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段的大小和数量，判断酶切的效果。
5. 存储酶切后的DNA片段：酶切后的DNA片段可以在-20℃或更低的温度下保存，避免酶切片段的降解。
酶切技术的应用非常广泛，包括DNA分子的定位、DNA序列的测定、DNA 的连接和修饰等领域。
酶切的原理和步骤的掌握对于分子生物学实验的顺利进行非常重要，希望以上的介绍能够帮助您更好地理解酶切技术的原理及实验操作步骤。
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限制性内切酶酶切反应的标准操作规程（编号：007）
1、目的及适用范围
利用限制性内切酶在特异性的识别位点上或附近切割双链DNA分子，用于特定基因的克隆等分子生物学研究。
2、主要试剂及仪器
微量移液器、恒温水浴锅、限制性内切酶 EcoR I, BamH I 等、通用缓冲液10× Buffer
3、操作步骤
按顺序加入下列反应物，放入37℃水浴锅内反应2h。
反应物体积（μL）
灭菌水3
DNA40
10× Buffer K 5
EcoR I1
BamH I1
总体积50
4、问题向导
4.1 建立一个标准的酶切反应：目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。
通常，一个50μL的反应体系中，1μL的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1h即可降解1μg已纯化好的DNA。
如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16h）也可完全反应。
4.2 选择正确的酶：选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。
识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。
假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。
内切酶的产物可以是粘端的（3\'或5\'突出端），也可以是平端的片段。
粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。
4.3 内切酶：内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。
酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。
酶的用量视在底物上的切割频率而定。
例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。
21。