大肠杆菌、沙门氏菌和志贺杆菌PFGE标准操作

1、 确保电泳槽是水平的。如果不水平，调整槽底部的旋钮。 注：不要触碰电极。 2、 加入 2-2.2L 0.5×TBE,关上盖子。 3、 打开主机和泵的开关，确保泵设在－70（这时缓冲液的流速约 1L/分钟）和 缓冲液在管道中正常循环。
4、 打开冷凝机， 确保预设温度在 14℃ （缓冲液达到该温度通常约需要 20 分钟） 。 5、 打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶， 小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。 6、 设置电泳参数。 （1）沙门菌属以 XbaⅠ或 AvrⅡ（BlnⅠ）酶切，电泳条件相同。 CHEF Mapper: Auto Algorithm 30kb ——low MW（最小分子量） 700kb ——high MW（最大分子量） 按“enter”选择程度默认值 run time（电泳时间）改为 18-19h （默认值： initial switch time （初始转换时间） =2.16s； final switch time（终末转换时间）=63.8s） CHEF DR-Ⅲ： Initial switch time: 2.2s Final switch time: 63.8s Voltage: 6v Included Angle: 120° Run time：18-19h （2） 大肠杆菌 O157 和宋内志贺菌 XbaⅠ或 AvrⅡ （BlnⅠ） 酶切， 电泳条件相同。 CHEF Mapper: Auto Algorithm 30kb ——low MW（最小分子量） 600kb ——high MW（最大分子量） 按“enter”选择程度默认值 run time（电泳时间）改为 18-19h （默认值： initial switch time （初始转换时间） =2.16s； final switch time（终末转换时间）=54.17s） CHEF DR-Ⅲ：
1、 打开水浴箱，温度调至 55-60℃。 2、 配制 2200ml 的 0.5×TBE。 3、 用 0.5×TBE 配制 1%SeaKem Gold(SKG)胶。 14cm 宽电泳胶框（10-15 加样孔） ：1.0gSKG 胶溶于 100ml0.5×TBE 中； 21cm 宽电泳胶框（≥15 加样孔） ：1.5gSKG 胶溶于 150ml0.5×TBE 中。 4、 熔化时，微波加热 60 秒，混合；每隔 15-30 秒重复一次，直到胶完全熔化。 放在 55-60℃水浴箱备用（温度至少平衡 30 分钟以后使用） 。 5、 调整梳子高度， 使梳子齿与胶槽的底面相接触。 用水平仪调整胶槽使其水平。 6、 从 37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。 7、 用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。 8、 每管加入 200µl 0.5×TBE，室温平衡 3 分钟。 9、 把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。把标准菌株 H9812 上样在第 1、 5、10 个齿上（10 齿梳子）或第 1、5、10、15 个齿上（15 齿梳子） 。 10、用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约 3 分钟。 11、把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面相接 触。从胶槽的下部中央缓慢到入 100ml 熔化的在 55℃－60℃平衡的 1％SKG。避 免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固 30 分钟。 10、 步骤 6 记录加样顺序。 电泳
注：缓冲液要置于冰上。不同试剂供应商，相同试剂供应商的不同酶切缓冲液是 不通用的，所以应根据产品说明来配制缓冲体系，这里以 TaKaRa 为例。 3、 在每个 1.5ml 微量离心管中加入 200µl 缓冲液。 4、 小心地从 TE 中取出胶块放在干净的培养皿上。 5、 用刀片切下约 2mm 宽的胶块放入 1.5ml 微量离心管中。 确保胶块在液面下面。 将剩余的胶块放回原来的 TE 中。 6、将试管放在 37℃水浴中孵育 10-15 分钟。 7、在用稀释缓冲液孵育的过程中，以 XbalI 为例按照以下比例配制酶切反应体 系，混匀。 试剂 纯水 Buffer M BSA 酶（15U/µl） 总体积 µl/胶块 157µl 20µl 20µl 3µl 200µl µl/11 胶块 1727µl 220µl 220µl 33µl 2200µl
3）Dade Microscan Turbidity Meter：0.48-0.52（以 Falcon 2054 管测量） 0.68-0.72（以 Falcon 2057 管测量） 注：在 4.0~4.5 该范围内细菌的浓度都可得到较满意的实验结果，但过大的浓度 差距会造成同一块胶上的条带亮度差异，影响条带的识别。 6、 取 400µl 细菌悬浊液于相应的 1.5ml 微量离心管中，置于 37℃水浴中孵育 5 分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备完毕。 7、 从水浴箱中取出微量离心管， 每管加入 20µl 蛋白酶 K （储存液浓度 20mg/ml） 混匀，使其终浓度为 0.5mg/ml，蛋白酶 K 置于冰上备用。 注：蛋白酶 K 的终浓度是指在加入 400µl 琼脂后的浓度。 8、 加入 400µl 的 1%Seakem Gold：1%SDS 到上述装有 400µl 细菌悬液的微量离 心管内，用枪头轻轻混匀，避免有气泡产生。 （此时 1%Seakem Gold：1%SDS 需 置于 56℃水浴中） 注：没有用完的 Seakem Gold agarose 可放于室温，并可重复使用 1-2 次。再溶 时，加热时间缩短到每 10-15 秒一次，直至完全溶解。 9、 迅速将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固 10-15 分钟。为节省 时间也可以在 4℃下凝固 5 分钟。 10、记录好模具内对应样品的名称。 步骤 2 细菌的裂解
福氏志贺菌
NotI
XbaI
SpeI
(50 U/sample) (50U/sample) (30U/sample)
8、用枪头吸出缓冲液 M，避免损伤胶块。 9、每管加入 200µl 混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的 下面。 10、在 37℃水浴中孵育至少 2 小时。 步骤 5 加样
1、 在 1.5ml 离心管上标记好相应的样品及 H9812 的名称。 注：H9812 为国际标准株，其 XbaI 酶切片断可用于分子量标准 2、 按照下面的比例配制缓冲液 M 的缓冲体系，并混匀。 试剂 纯水 Buffer M BSA 总体积 µl/胶块 160µl 20µl 20µl 200µl µl/11 胶块 1760µl 220µl 220µl 2200µl
5、 将离心管放在 54℃水浴摇床中孵育 2 小时，转速约 130 转/分钟。确认水浴 箱内液面高于离心管内裂解混合液的液面。 6、 将纯水和 TE 放在 50℃水浴箱中预热。 步骤 3 清洗胶块
1、 调低水浴摇床的温度至 50℃。 2、 从水浴摇床中拿出装有胶条的离心管，盖上滤盖，轻轻倒掉 CLB，在实验台 上轻磕管底使胶块落在管底。 注： 可将离心管倒置在吸水纸上， 使管内液体被尽量排净。 随后的操作中也如此。 3、 每管中加入 10ml 预热的 TYPE ONE WATER。确保胶块在液面下而不在管壁或 盖子上。 注：TYPE ONE WATER 是水质达到 18.2M 欧的纯水经高压灭菌后得到的，清洗胶 块以及配置 TE 缓冲液时均需使用 TYPE ONE WATER。 4、 放回 50℃水浴摇床中，转速约 130 转/分钟，摇 10 分钟。 5、 倒掉水，用 TYPE ONE WATER 再洗一次。 6、 倒掉水，加入 10ml 预热的 TE，在 50℃的水浴摇床中摇 15 分钟。 7、 倒掉 TE，用 TE 重复洗三次，每次 10－15 分钟。 8、 倒掉 TE，加入 10ml TE，放在 4℃冰箱保存备用。 注：要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。 第二天 步骤 4 胶块内 DNA 的酶切
1、 在 50ml 离心管上做好样品标记。 注：相同菌株的胶条可以同时放于同一个管中裂解，最多不要超过 4 条。 2、 配制细胞裂解液 CLB（配制方法见附件） ， 然后向每 5ml 细胞裂解液加入 25µl 蛋白酶 K（20mg/ml） ，使其终浓度为 0.1mg/ml，然后颠倒混匀。 注：蛋白酶 K 要置于冰上，配制好的蛋白酶 K/CLB 混合液也要置于冰上。建议配 制总量后进行分装。 3、 每个离心管加入 5ml 蛋白酶 K/CLB 混合液。 4、 如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。打开可重复利用 模具， 用小铲将胶块推入上述裂解混合液中。 保证胶块在液面下， 而不在管壁上。 注：剩余的菌液以及其它使用过的器具应丢弃并消毒。可重复利用模具需要浸于 泡腾片消毒液中 15 分钟，然后清洗干净。
注：将酶置于冰上，用后立即放在－20℃保存。病原菌使用的限制性内切如表： 病原菌 第一种酶 （浓度） 大肠杆菌 O157 第二种酶 （浓度） 第三种酶 （浓度）
XbaI
(50U/sample)
BlnI/AvrII
SpeI
(30U/sample) (30U/sample)
非 O157 产志贺毒素 大肠杆菌 沙门氏菌
大肠杆菌O157、沙门菌和痢疾杆菌脉冲场凝胶电泳实验步骤
提前准备 从检测培养基上挑取单菌落，接种于含 5%去纤维蛋白羊血的胰化大豆琼脂 （TSA-SB）平板（或相当的培养基）上培养，37℃孵育箱培养 14-18 小时；用同 一个接种针/环，穿刺或接种于小螺帽管中的 TSA、HIA 或相似培养基，以保证必 要时重复检测同一个克隆。同时接种标准株 H9812。 第一天 步骤 1 细菌的包埋 1、打开水浴摇床（54℃） 、水浴箱（56℃） 。 2、 用 TE 缓冲液（具体试剂配制方法见附件）制备 1%Seakem Gold：1%SDS 琼脂 糖，以配制 25ml 体积为例说明，方法如下： 1） 准确称取 0.25g SeaKem Gold agarose, 放入 250ml 的蓝色瓶内。 2） 加入 22.5ml TE 缓冲液，轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开。 3） 微松瓶盖，将玻璃瓶放于微波炉内高火加热 30 秒，取出轻柔摇荡，再次 加热 30 秒，重复操作直至琼脂彻底溶解（无颗粒物、悬浮物，透光均一，无 明显异常折光，无气泡） 。 4） 将溶解的 SeaKem Gold agarose 放入 56℃（55-60℃均可）水浴箱内至 少 15 分钟， 再加入预热到 56℃的 10%SDS 溶液 2.5ml， 置于 56℃水浴箱备用。 3、 在 Falcon 2054 管 （或其他相当的管） 上标记样品名称和空白对照； 在 1.5ml 微量离心管上标记好对应样品的名称。 4、 在 Falcon 2054 管中分别加入约 2ml 细胞悬浊液 CSB（配制方法见附件） 。 注：使用测定细菌浓度的容器不同加入 CSB 的量也不同。 5、 用 CSB 湿润棉签，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于 CSB 中。通过加入 CSB 稀释或增加菌液浓度，调整细胞悬液浓度至指定范围。 1） 用比浊仪（bioMerieux Vitek colorimeter）测其浓度，并调整浓度至 4.0-4.5 麦氏单位。 2） 用分光光度计时，在 610nm 波长吸光度应在 1.3-1.4。