分子进化工程_李满文

基础 科 学
分 子进 化 工 程
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李满 文
贺 福初 ( 军 事 医 学 科 学 院放 射 医 学 研 究所
北京
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分子 进 化 工 程 是 继 蛋 白 质 工 程 之 后 的 第 三 代 因 基 工程 它 通 过 在 试管里 对 以 核 酸 为 主 的 多 分子 体 系 施 以 选 择 压 力 模 拟 自然界 中 生 物 的 进 化 历 程 以 达 到 创 造新 的 基 因 新 的 蛋 白 质 的 目 的 ” 达 尔 文 用 适 者生 存 不 适 者 被 淘 汰 的 自然选 0 年代 以 择学 说 阐 述 了 生 物 进 化 的 原 因 本世 纪 6 来 实 验表 明 这 种 生 物 自 然 种 群层 次 式 的 进 化 机 理 可 在 试管里 分 子层 次 上 模 拟 实 现达 尔 文式进 化 的 必 备条 件是 增 殖 突 变 和 选择 任 何具备 前 两 者 的 实 体不 论 在 整 体 层 次 还 是 在 分 子 层 次 只 要 有 选 择 作 用 其群 体 必定产 生 达 尔 文式 进 化 并 最 终 出 现 最适 应 所 处环 境 的 类 型
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r 该 i 匕o z y m e 进 化 十 代 后 裂解 O N A 的 能 力 提 高 了 ; 0 0 倍 进化 2 1 7 代 后 提高 了 1 0 万倍 乔伊斯 等 还 e y r i 匕 m L 一2 ( 1 型 ) 进 化到 第 九 代 所 使从 四 膜虫 z o 得 到 的 R N A 变 异型 的 模 板 在 大肠 杆 菌 中 表 达 结 3 病毒 的 人 侵 此外 该酶 作 用 的 底 果发 现 能 抗 M 1 物 由 R N A 变 为 O N A 具有重 大 的 医 疗 价 值 例 如 用 它 来 切 除 人 侵病 毒 中 的 有 害 O N A 达 到 彻 底 消 灭 人 侵病 毒 的 目 的 1 9 9 3 年 乔 伊 斯 等还 用 同 样 方 法 获 得 了 底 物 不 变 但 反 应 条 件 改 变 的 ir 匕o Z y m e 变异 e 型 他 们 得 到 的 ir 匕o z y m 由 原 来催 化反 应 必 需 有 + Mg + 和 M n 变 为 只 要有 C a 而 无 M g 和 M n 均 可 r 匕。 Z y m e i 一 直是 试 管 进 化 研 究 的 热 点 1 9 9 2 r e e n ) 和 索 斯达 克 ( S z o s t a k ) 用 试 管 进 化 年 格林 ( G 方 法 改善 了 S u n y ir 匕o z y m e 缺失 型 的 功 能 他们 用 的 S u n y ir 匕。 z y m e 来 自一 种 自我 切 割 的 R N A I 型 内 含 子 这 种 ir 匕o z y m e 分 子量 很 小 虽 然 可 进一 步 缺 失 非必 需 区 域 但 片 段 缺 失 后 酶 活 性 严重 下 降 他 们 用 试 管进 化 方 法 得 到 了 分 子量 更 小 的 突 变 体 这 些 突 变 体 比 原来 的 ir 匕o z y m e 在 R N A 多 聚 酶活 性 和 自我 复 制 速 率 方 面 都 有 很大提 高 随 后 索斯 达 克 等 又 从 R N A 碎 片 组 成 的 巨 大 分 子 库 中 分离 出 一 种 新 z 的 r i b o y m e 这 种 酶 通 过 催 化结 合 在 模 板 上 的 两 个 ’ ’ RN A 分 子 的 3 一 经 基 和 5 一 磷 酸 根 反应 而 把 两 个 RN A 分 子 连 接 起来 就 象 我 们 所 熟 知 的 蛋 白 类 酶催 RN A 的 化 合成 一 样 该酶 还 可 以 催化 3 一 5 双磷 酸 键 的 形 成 实 验 表 明 这 种 新 ir 匕o Z y m e 的 催化 效率 比 未 经 进 化 的 ir 匕 o z y m e 提高了 7 0 。 万 倍 目前 普 遍 认 为 索 斯达 克等 用试 管 进 化 方 法 获得 具有 模 板 和 复 制 酶 功 能 的 R N A 分 子 的 工 作 对 生命 起 源 的 “ ” r t ) 的 “ R N A 世界 说 原 基 因 说 和 吉 尔 伯 特 ( iG l匕 e 将 是 极大 的 支 持 达 尔 文 的 重 复 选 择 增 殖 和 突 变 的 法则 已 成 为 科学 家手 中 的 有 力 工 具 包括 索 斯达克 在 内 的 一些 学者 正 利 用 它 重 建分 子进 化 的 过 程 人 们 推 测 在 几 十亿 年 的 进 化历 程 中 R N A 曾 具 有 过 一 些 酶 的 性 质 如 O N A 酶 活性 R N A 多 聚 酶活性 A T户 酶 活性 等 后 来 丢 失 了 现 在 人 们 正 通 过分 子 进 化 工 程 方 法 重 新 使其 获 得这 些 性 质 希 望 以 此 产 生 更 多 新 的 有 益 性 状 并真 正重 视 生 命起 源 与 生物 进 化 的 分 子
19 67
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就 获 得 目 标 分子 因 此也成 为 生 物 工 程 的 一 种 全新 技术 实 现 试 管 里 的 达 尔 文 式 进化 需 要三 个 连续 往 复 的 化 学 过 程 扩 增 突 变 和 选择 扩增 可 产 生 携带 ; 有 遗 传信 息 的 分 子 的 众 多 拷 贝 突 变 是 在 基 因 型 水 ; 平上 引 进 变 异 这 种 变 异 为 选 择 提供 原 材 料 选 择 是在 表 型 水 平 上通 过 适 者生 存 不 适 者 淘 汰 的 方 式 固 定 变异 这三 个 过 程必 须 紧 密 相 联 以 便 使 那 些 被选 择 的 分 子 得 以 扩 增 并 不 断 引 进新 的 变 异 进 而 进 行新 的 选 择 试 管进化 体 系 的 建 立 包 括 两 个 阶 段 选 择 与 扩 增 的 结合 和 扩 增 与 突 变 的 结合 1 9 8 7 年 奥 利 芳 特 i p 卜a n t ) 和 (o 一 斯特拉 尔 ( S t r u h l ) 认为 在 试 管里 将 选 择 与 扩 增 相 结 合会 极 大 地加 强 选 择 的 分 离 和 富 集 t o k S o ) 估 计 有 可 能从 1 0 5 个不 1 作 用 索斯 达 克 ( z s 同 分 子 中 选 出 一 个 目 标分 子 1 9 8 0 年 金 斯勒 ( K i n z e l l s t ie n r ) 和 沃 格 尔 斯坦 V ) 首 次 实 现 了 这一 设 ( oge 19 90 们 用 确 想 年 他 又 此 法 定 了人类 G U 蛋 白质 O N A 在 顺 序 上 的 结 合 部 位 1 99 0 年 埃 林 顿 n t o E 日i g ( 5 种 随 机顺 序 的分 1 n ) 等 对含化 学 合 成 的 1 0 子群 进 行 了 五轮选 择 与 扩 增 得 到 了 与 几 种 有机染 料专 一 性 结 合 的 日 N A 并 确 定 了 R N A 顺 序上 与 有 机 染 料 专 一 结 合 的 部 位 1 9 9 2 年 乔伊 斯 ( J o y c e ) 等 借 改 变反应 条 件 使 p C R 伴 有 突 变发 生 不 仅 使 试 管 中选择与 扩增 相 结合 而且使扩增 与 突 变相 结 1 型)的 合 由 此 他 们 建立 了 四 膜 虫 ir 匕o z 丫m e ( L一2 “ ” 试 管里 进 化 体系 并 称 之 为 试 管 里 的 定 向 进 化 “ 这种 在 1 9 8 7 一 1 9 9 2 年 间 建 立 起 来 的 试 管 里 ” 的 定 向 进 化 的 基本 方法 是 1 用 化 学 方 法 合 成 含 诸 核昔 酸 序 列 变 异 体 的 分 子 库 分 子 库 越 大 ( 所 含 分 子 数 受 目前 实 验条 件 限制仅为 1 0 5 ) 涉 及 功 能 的 序 列 变 异越 多 样 则 越 理 1 ; 想 2 给 分子库 施 加 压 力 以 选择 出 功 能 符合 实 验 ; 者要 求 的分 子 3 对选 择 出 来 的 数量 极 微 的 顺 序 进行 扩 增 其
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二 试管 进 化 研 究 的 现 状
美 国 国 家 航 空 和 航 天 局 在 星 际 探 险 和 搜 索生 命 时 对 生 命 所 下 的 定 义 是 生 命 是 能 够 经历 达 尔 文 式 进化 的 一 种 自 我 维 持 的 化学 系 统 在生 命 的 化学 系 统 中 起 决 定 作 用 的 是 四 种 生 物 大 分 子 核酸 蛋 白 质 多 糖 和 脂 类 生 命 体 奏 的 自复 制 自 组 装 和 自 调 节 无 不 与 之 相 关 试 管 里 的 定 向 进化 即 分 子 进 化 工 程 就 是模 拟 这 些 生 物 大 分 子 的 进 化 历 程 以 获 得 新 型 的 催化 剂 酶 和 新 药 近 年 来 的 研 究 主 要 限 于 核 酸 尤 其 是 r i 匕o Z yme L RN A 的 定 向 进化 实 现 R N A 定 向 进 化 首 先 要解 决 R N A 的 增 殖 问 题 目前 通 用 的 方 法 是 建 立 逆 转 录一 转 录 系 统 该 系 统涉 及 两 种 酶 即 逆 转 录 酶 和 R N A 聚 合酶 需 要 ; 有一 对 引 物 其 中 一个 引 物 附 加有 转 录 启 动 子 另 外 还 要 加 人 合成 R N A 的 四 种 N 丁户 和 合 成 O N A 的 四 种 d N T 户 这种 定 向 进 化 系 统一 开 始 就 要有 足 够 的 异质 性 并且 在 增 殖 中 不 断 引 进 变 异 否 则 选 择 就无对 象 建立 异质性 群 体 目前 有三 种 方法 (1 ) 鸟 枪法 使 大 分 子 的 所 有 位 点 发 生变 异 适 用 于 寻 找 新 的 特 性 分 子 但 要 选择 的 分 子库 往 往 过 大 ( 2 ) 覆 盖 法 使 随 机 变 异 仅 发 生 在 所选 定 的 区 内 域 此 法 需 对 大 分 子结 构 与 功 能 有 较 多 了 解 其 选择 目 的 要 十 分 明 确 (3 ) 集 中 法 当 希望 获 得 已 知 大 分 子 的 某种 改 进 性能 时 可 用 这 种 分 子 的 一 组 突 变 体 该 方 法最 为常用 改 变 实 验 条件使 增 殖 中 总 伴有 变 异发 生 由 于 的 新 变 异 是 在 原 有 经 选择 的 基 础上 发 生 的 因 而 具 有 倾 向 性 重复 随 机 突 变是 在 实 验 体 系 内 实 现 达 尔 文 式 进 化 的 关键 增 殖 和 突 变 方 法在 建立 后 就 可 用 多 种 选 择 方法 来研 究 R N A 的 定 向 进 化 1 9 92 年 乔 伊 斯 的 实 验 室 建 立 了 四 膜 虫 ir o z e y L b m ( 一 2 1 型 ) 的 进化体 系 乔 伊 斯等 以 其 1 0 个变 异 株 为 起 始 群 体 通 过与 O N A 靶序 列 接 触 获 得 能 与 其结 合 的 R N A 分 子 经 过 选择 性 扩 增 并 且 改 变 正 常 的 反 应 条 件 以 在扩增 中 引 人新 的 变异 产 生 具 有 更 强 结 合 和 分解 能 力 的 分 子 进 化 九 代 后 就 从原 来 仅 在 5 0 ℃ 对 O N A 有 极 微弱 剪切 作 用 的 ir e 匕o 7 ℃ 对 O N A 有剪 切 作 用 其 活 Z y m 中 得到 在 3 r i 匕 0 倍的 性 提高 3 z y m e 变异 体 随 后 研 究 表 明 o
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科技 导 报
6
/1995
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通 过 户 R 扩 增 R N AA 通 过 由 CC O N A 而 来 的 ds ON A 的 转 录而 扩 增 这 些 扩 增 方 法适 用 于 任何 顺 序 而 米 尔 斯 等 建立 的 体 系 中 用 O 阳 N A 复 制 酶 受 顺 序 特 点 的 限 制 因 此 新 体 系 使 试管 进化 的 研 究 和 应 用 范 围 大 为 扩大
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一 试管 进 化 体 系 的 建 立
M ll s ) 等 首次 在 试管 里 实 现 了 年 米 尔斯 ( i 达 尔 文 式 分 子 进 化 他 们 曾 研究 一 种 称 为 O p 的 RN A 噬 菌 体 建 立 了 含 有 Q 阳 N A O 阳 N A 复 制 酶及 四 种 合成 R N A 的 底 物 核昔 三 磷 酸 的 多 分 子 体 系 由 于 复 制 酶 时 很容 易 产 生 差 错 因 此 复 制 中 总 伴 有 突 变 发 生 米 尔 斯 的 办法 是 每 当 O 阳 N A 在 试 管里 复制 到 2 0 分钟 时 就取 出 一 定 量反 应 混 合 物 转 移 到 另 一 试 管 中 再 补 充 酶 和 底 物 后 继续 复 制 如 此 往复 以求 试管 里 多 分子 体 系 不会 因 扩 增 而 不 稳 定 另 外 通过缩 短复 制 时 间 作 为 选 择压 力 使 产 生 的 R N A 分 子越变越 短 到 第 7 4 次复 制 时 它 的 链 长 R N A 两端 以 作为 复 制 酶 7 % 只 剩下 仅 为 原来 的 1 识 别 并 控 制 起 始复 制 所 必 需 的 序 列 同 时 其复 制 速 5 倍 从对 实 验 全过 程 的 跟踪 分析 中 发 率提 高 了 1 现 变 异 型 的 产 生 过程 与 达 尔 文强 调 的 由 于 选 择 保 存 和 积 累 有 利 变 异而 引 起 的 渐 进 适应 过程 相 符 因 ” 此称 之 为 试 管 里 的 达 尔 文式 分子 进 化 该 实 验 启 迪 人 们 借 改 变 多 分 子 体 系 的 条 件来 设 计 不 同 的 选 择 作 用 以 获 得 具 有 预 期 功 能 的 变 异 型 从 而 使试 管 进化不 仅 提供 了 分 子 进化 机理 的 模 型 而 且 由 于 是在 事先 不 必 知 道 任 何 结 构 和 功 能 关 系 的 基 础 上