真核基因在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌表达系统
大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。
表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。
大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。
据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。
与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。
常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。
该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。
宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。
其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。
真核基因在大肠杆菌中表达
增强子：特殊的序列元件，能显著增强外源 基因的表达效率。
翻译终止子：必须存在终止密码子。
✓ 构建表达载体时通常装上全部的三个终止密码子 (UAA,UGA,UAG)，以阻止核糖体的跳跃现象。
✓ 大肠杆菌最偏爱的密码子：UAA ✓ 当为四联核苷酸UAAU时，终止效率进一步增强。
真核基因在大肠杆菌中表达
翻译起始序列：决定mRNA翻译起始效率。
未鉴定出其保守结构，只能采取一些方法降 低mRNA 5’-末端二级结构的形成，增加RBS中A、 T含量，碱基定点突变等。
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
目前常用的表达系统
细菌（大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植物 和哺乳动物细胞等
真核基因在大肠杆菌中表达
大肠杆菌表达系统的优越性
➢ 背景清楚，特别是对其基因表达调控的分子机 理研究的比较深入。
➢ 安全(被FDA批准为安全的基因工程受体生物)， 且有多种不同的菌株和质粒载体。
➢ 已有许多真核基因在大肠杆菌中实现高效表达。 ➢ 培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进
物使外源基因获得表达，如IPTG、温度等。
真核基因在大肠杆菌中表达
转录终止子（TT）
✓ 上游启动子会抑制下游启动子 的转录功能(启动子封堵作用)， 因此需要在克隆基因编码区的 3’-末端接上一个有效的转录终 止子。
✓ 转录终止子能增强mRNA分子 的稳定性，从而提高蛋白质产 物的水平。
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中的表达
真核基因在大肠杆菌中表达
内容提纲
基因工程问答题
探针（probe）：核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。
16.Southern杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。
被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。
17.Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交。
被检对象为RNA,探针为DNA 或RNA。
18. Western杂交: Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方20.基因文库：将所有的重组DNA分子都导入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为基因文库。
21. cDNA文库：从组织细胞中分离得到纯化的mRNA，然后以mRNA为模板，利用逆转录酶合成其互补DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后导入受体菌内，扩增，构建cDNA 文库。
36. 末端转移酶: 一种从小牛胸腺组织中分离得到的酶 可使dnTp添加剂加到DNA分子的3’—oH末端上 不要求模板 但需Co2+的存在基因克隆载体 通过不同途径能将外源DNA片段载入受体细胞 并在其中得以维持的DNA分子称为基因克隆载体或DNA克隆载体2.限制性核酸内切酶的活性受那些因素的影响？ 1样品的纯度 2 DNA样品的甲基化程度 5 酶的纯度 3 缓冲液性质 6 DNA分子的构型 4酶切反应的温度与时间 7 限制性核酸内切酶的星号活性说明使用切口位移法进行说明使用切口位移法进行DNA标记的原理及其步骤: 原理：在Mg2+存在时，用低浓度的DNA酶I（DNaseI）处理双链DNA，使之随机产生单链断裂，这时DNA聚合酶I的5′→3′外切酶活性盒聚合酶活性可以同时发生。
外切酶活性可以从断裂处的5′端除去一个核苷酸，而聚合酶则将一个单核苷酸添加到断裂处的3′端。
由于大肠杆菌DNA聚合酶I不能使断裂处的5′－P和3′—OH形成磷酸二酯键二连接，所以，随着反应的进行，即5′端核苷酸不断去除，而3′端核苷酸同时加入，导致断裂形成的切口沿着DNA链按合成的方向移动，这种现象就成为切口平移。
提高真核基因在大肠杆菌中的表达效率
提高真核基因在大肠杆菌中的表达效率摘要：对于基因工程，无论是在原核生物中，还是在真核生物中，外源基因的表达效率一直是人们关注的问题。
这篇综述简要的从启动子、质粒、mRNA转录本、密码子的偏好性、宿主选择、培养条件方面论述如何提高真核基因在大肠杆菌中的表达效率。
关键词：真核基因大肠杆菌表达效率前言：基因工程越来越被广泛应用，人们可以利用基因工程获得高产,稳产和具有优良品质的农作物,培育出各种具有抗逆性的作物新品种。
利用基因技术还可以高效率的生产各种高质量，低成本的药品，如：胰岛素、干扰素和乙肝疫苗等。
通常要把目的基因导入大肠杆菌进行表达，因为大肠杆菌表达系统相对于其它，比如酵母细胞表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、哺乳动物细胞表达系统有一定的优越性：对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机制有深刻的了解；拥有各类适用的寄主菌株和不同的载体；许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌中有效、高水平的表达；大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。
但也有缺点，比如说真核基因的转录信号同原核不同，细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子，外源基因可能含有大肠杆菌终止子序列，表达产物音折叠错误或缺少翻译后修饰而没有生物活性，本身含有内毒素或毒性蛋白等。
所以真核基因在大肠杆菌中表达可能会遇到如下问题：●缺乏拼接机制：由于原核基因无内含子，目的基因表达后的mRNA内含子无法去除；●缺乏翻译、加工：不能对蛋白质进行糖基化、磷酸化等；●容易降解：细菌对外源蛋白有排斥作用。
正文：一、目标蛋白在大肠杆菌中表达首先要构建表达载体，表达载体包括以下几个部分：★复制起始位点★选择标记基因★启动子★核糖体结合位点★多克隆位点★转录终止序列用图表示即为：二、影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素有：●启动子●质粒●mRNA转录本●密码子的偏好性●宿主选择●培养条件（一）启动子在基因的表达调控中，转录的起始是个关键某个基因是否能正常的表达常常决定于特定启动子的起始过程，启动子是DNA分子与RNA聚合酶相结合的部位，是转录的基本信号。
生物技术制药复习知识点
生物技术制药复习知识点第一章绪论1.生物制药的研究内容包括基因工程制药, 细胞工程制药, 酶工程制药和发酵工程制药。
2.生物技术制药, 是采用现代生物技术人为地创造一些条件, 借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。
3.生物技术药物, 是采用DNA 重组技术、单克隆抗体技术或其它生物新技术研制的蛋白质、治疗性抗体或核酸类药物。
4.生物药物, 指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体的某一组成部分, 甚至整个生物体用作诊断和治疗的医药品。
5.现代生物药物四种类型: ①应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂。
②基因药物, 如基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。
③来自动植物和微生物的天然生物药物。
④合成与部分合成的生物药物。
6.生物药物按功能用途分为三类: 治疗药物, 预防药物和诊断药物。
7.生物技术药物的特性：分子结构复杂, 具种属特异性, 治疗针对性强、疗效高, 稳定性差, 基因稳定性, 免疫原性、重复给药会产生抗体, 体内半衰期短, 受体效应, 多效性和网络效应, 质量控制的特殊性, 生产系统的复杂性。
8.生物技术制药特征：高技术, 高投入, 长周期, 高风险, 高收益。
9.基因诊断: 指采用分子生物学的方法在DNA水平或RNA水平对基因的结构和功能进行分析从而对特定的疾病进行诊断。
第二章基因工程制药1.利用基因工程技术生产药品的优点: （1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等）, 为临床使用提供有效的保障；（2）可以提供足够数量的生理活性物质, 以便对其生理、生化和结构进行深入的研究, 从而扩大这些物质的应用范围；（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处, 可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；（5）利用基因工程技术可获得新型化合物, 扩大药物筛选来源。
分子生物学答案
分子生物学答案分子生物学答案一、名词1、鸟枪法（Shotgun method）：使用基因组中的随机产生的片段作为模板进行克隆的方法。
使用限制性内切酶将带有目的基因的DNA链切成若干小段，再使用DNA连接酶将其整合到载体的基因中，并使其表达。
2、色氨酸操纵子（tryptophane operon）：负责色氨酸的生物合成，当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，trp基因表达，色氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。
3、酶切图谱（Macrorestriction Map）：描述限制性内切酶的酶切点的位置和距离信息的图谱。
4、原位杂交（in situ hybridization）：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。
5、结构域（domain）：是构成蛋白质三级结构的基本单元，是指生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，是蛋白质生理功能的结构基础，这种相对独立的区域性结构就称为结构域。
6、DNA杂交（Southern blotting）：又称为Southern杂交，即用放射性标记的探针与靶DNA进行杂交的技术。
7、基因组文库（genomic library）：用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。
这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库（短答案：是指采用基因组克隆的方法，克隆的一套基因组DNA片段。
）8、粘性末端（cos site-carring plasmid）：当一种限制性内切酶在一个特异性的碱基序列处切断DNA时，就可在切口处留下几个未配对的核苷酸，叫做粘性末端。
9、一致序列（又称保守序列：conserved sequence）：遗传物质里的片段极少发生突变而且在不同生物中广泛存在。
生物技术制药复习知识点
生物技术制药复习知识点第一章绪论1.生物制药的研究内容包括基因工程制药，细胞工程制药，酶工程制药和发酵工程制药。
2.生物技术制药，是采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。
3.生物技术药物，是采用DNA 重组技术、单克隆抗体技术或其它生物新技术研制的蛋白质、治疗性抗体或核酸类药物。
4.生物药物，指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体用作诊断和治疗的医药品。
5.现代生物药物四种类型：①应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂。
②基因药物，如基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。
③来自动植物和微生物的天然生物药物。
④合成与部分合成的生物药物。
6.生物药物按功能用途分为三类：治疗药物，预防药物和诊断药物。
7.生物技术药物的特性：分子结构复杂，具种属特异性，治疗针对性强、疗效高，稳定性差，基因稳定性，免疫原性、重复给药会产生抗体，体内半衰期短，受体效应，多效性和网络效应，质量控制的特殊性，生产系统的复杂性。
8.生物技术制药特征：高技术，高投入，长周期，高风险，高收益。
9.基因诊断：指采用分子生物学的方法在DNA水平或RNA水平对基因的结构和功能进行分析从而对特定的疾病进行诊断。
第二章基因工程制药1.利用基因工程技术生产药品的优点：（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障；（2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；（5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
2.基因工程技术就是将目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。
生物制药复习题（有答案）
生物制药复习题（有答案）《生物技术制药》习题（课后作业）一、下列概念：⑴生物制药：⑵生物药物：包括生物技术药物，天然生化药物，微生物药物，海洋药物和生物制品。
(3)生物技术制药：采用现代生物技术,借助某些微生物、植物、动物生产医药品。
(4)生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。
（5）现代生物技术：以现代生命科学为基础, 把生物体系与工程学技术有机结合在一起，按照预先的设计，定向地在不同水平上改造生物遗传性状或加工生物原料, 产生对人类有用的新产品(或达到某种目的)之综合性科学技术。
（6）基因表达：⒈转录：在RNA聚合酶的催化下以DNA为模板合成mRNA的过程。
2、翻译：以mRNA为模板,tRNA作为运载工具,将活化的氨基酸在核糖体上合成蛋白质的过程（7）质粒的分裂不稳定：基因工程菌分裂时产生一定比例不含质粒的子代菌的现象,即重组分子从受体细胞中逃逸。
（8）质粒的结构不稳定：DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
重组DNA分子某一区域发生变异，导致表观生物学功能的丧失；（9）显微注射：显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。
经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。
（10）悬浮细胞：（11）补料分批培养：是指分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。
（12）连续培养行下去的一种培养方法。
（13）接触抑制：细胞在生长分裂时达到相互接触而停止分裂的现象,称为接触性抑制（14）单克隆抗体：由一个抗原决定簇刺激的、单一的B细胞和骨髓瘤细胞融合增殖后所产生的、高度均一的抗体。
（15）多克隆抗体：一种抗原具有多个抗原决定簇,每个抗原决定簇都能刺激一个B细胞产生一种抗体。
这样所获得的免疫血清是多种抗体的混和物。
基因工程综合练习题
一、单项选择题1. 生物工程的上游技术是( )A. 基因工程及分离工程B. 基因工程及发酵工程C. 基因工程及酶工程D. 基因工程及细胞工程2. 基因工程的单元操作顺序是( )A. 增，转，检，切，接B. 切，接，转，增，检C. 接，转，增，检，切D. 切，接，增，转，检3. 下列哪种克隆载体对外源DNA 的容载量最大?( )A. 质粒B. 黏粒C. 酵母人工染色体(YAC)D. λ噬菌体E. cDNA 表达载体4. 同一种质粒DNA以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是()A. OC DNA>SC DNA>L DNAB. SC DNA>L DNA>OC DNAC. L DNA>OC DNA>SC DNAD. SC DNA>OC DNA>L DNA5. 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是( )A. 修复自身的遗传缺陷B. 促进自身的基因重组C. 强化自身的核酸代谢D. 提高自身的防御能力6. 基因工程的三大理论基石是（）A. 经典遗传学、细胞生物学、微生物学B. 分子遗传学、分子生物学、生化工程学C. 动物学、植物学、微生物学D. 生物化学、生化工程学、化学工程学E. 生理学、仿生学、免疫学7. 基因工程作为一种技术诞生于（）A. 上世纪 50 年代初B. 上世纪 60 年代初C. 上世纪 70 年代初D. 上世纪 80 年代初E. 上世纪 90 年代初8. 下述对DNA聚合酶的描述哪些是错误的（）。
A. 具有5’→3’外切酶活性B. 具有3’→5’外切酶活性C. 具有5’→3’聚合酶活性D. 具有3’→5’内切酶活性9. 下列关于酵母和哺乳动物的陈述错误的是（）A．大多数酵母基因没有内含子，而大多数哺乳动物基因有许多内含子B．酵母基因组的大部分基因比哺乳动物基因组的大部分基因小C．大多数酵母蛋白比哺乳动物相应的蛋白小D．尽管酵母基因比哺乳动物基因小，但大多数酵母蛋白与哺乳动物相应的蛋白大致相同10. 下列哪一种不是产生星号活性的主要原因？( )A. 甘油含量过高B. 反应体系中含有有机溶剂C. 含有非镁离子的二价阳离子D. 酶切反应时酶浓度过低11. 下面关于细菌人工染色体(BAC)的特征描述，除了( )外都是正确的。
基因工程智慧树知到答案章节测试2023年山东师范大学
第一章测试1.基因是存在于DNA上的核苷酸序列，具有特定的结构、功能以及遗传特征。
（）A:对B:错答案:A2.1944年Avery首次证实了（）是遗传物质。
A:蛋白质B:糖类C:DNAD:脂类答案:C3.Hind Ⅲ是第一个分离到的限制性核酸内切酶。
（）A:错B:对答案:A4.基因组工程的主要优势是能修改一个特定区域的DNA,从而增加了校正或外源基因插入的精度，重现性好，将成为今后基因工程主要的发展方向。
（）A:对B:错答案:B5.基因工程具有（）特征。
A:可在不同物种之间转移基因B:载体起着重要作用C:中心法则是必需遵守的准则D:真核生物基因可在大肠杆菌中表达答案:ABCD第二章测试1.DNA链的Tm值主要取决于核酸分子的（）A:T－C含量B:A－T含量C:G－C含量D:A－G含量答案:C2.用CTAB方法提取植物基因组DNA 时，使用PVP(聚乙烯吡咯烷酮)与多酚结合形成复合物，从而可有效防止DNA降解。
（）A:对B:错答案:B3.在Southern印迹中常用的核酸变性剂是( )A:氢氧化钠B:盐酸C:乙醛D:甲醛答案:A4.具有碱基互补区域的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称（）A:复杂性B:复性C:变性D:杂交答案:B5.用碱法分离质粒 DNA时，染色体 DNA之所以可以被除去，是因为：( )A:染色体变性后来不及复性B:染色体未同蛋白质分开而沉淀C:染色体 DNA分子量大，而不能释放D:染色体 DNA断成了碎片答案:A第三章测试1.下列( )酶作用时需要引物?A:末端转移酶B:限制酶C:反转录酶D:DNA连接酶答案:C2.Ⅱ型限制性内切核酸酶具有（）特征。
A:有核酸内切酶和甲基化酶活性,且经常识别回文序列B:有外切核酸酶和甲基化酶活性C:仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供D:仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供答案:D3.末端脱氧核苷酸转移酶是合成酶类，( )。
吉大20年4月课程考试《生物制药学》离线作业考核试题
吉林大学网络教育学院2019-2020学年第一学期期末考试《生物制药学》大作业学生姓名专业层次年级学号学习中心成绩年月日作业完成要求：大作业要求学生手写，提供手写文档的清晰扫描图片，并将图片添加到word 文档内，最终wod文档上传平台，不允许学生提交其他格式文件（如JPG，RAR等非word 文档格式），如有雷同、抄袭成绩按不及格处理。
一、名词解释（每小题2分，共20分）1、生物技术药物又称基因工程药物。
以DNA重组技术和蛋白质工程技术生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞因子类药物及上述产品的修饰物，以及应用生物技术研究开发的反义药物及用于基因治疗的基因药物和核酶等.2、基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品3、高密度发酵又称高密度培养。
一般指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态的培养技术4、离子交换层析离子交换层析分离蛋白质是根据在一定pH 条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。
5、疏水层析疏水层析也称疏水作用下层析从分离纯化生命物质的机制来看，也属于吸附层析一类。
疏水层析和反相层析分离生命物质的依据是一致的，利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离。
6、生物反应器生物反应器，是指利用自然存在的微生物或具有特殊降解能力的微生物接种至液相或固相的反应系统7、接触抑制接触抑制是将多细胞生物的细胞进行体外培养时，分散贴壁生长的细胞一旦相互汇合接触，即停止移动和生长的现8、原代培养原代培养是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养9、外植体植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段10、密度抑制密度抑制，细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。
基因工程原理练习题及其答案
基因工程复习题题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。
第一章绪论1.名词解释：基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。
包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。
狭义：基因工程。
克隆：无性(繁殖)系或纯系。
指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。
2．什么是基因克隆及基本要点?3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。
A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用；C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。
4.基因工程研究的主要内容是什么？基础研究：基因工程克隆载体的研究基因工程受体系统的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技术的研究应用研究：基因工程药物研究转基因动植物的研究在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究第二章基因克隆的工具酶1.名词解释：限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。
同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。
同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。
平末端：DNA片段的末端是平齐的。
大肠杆菌在分子生物学与生物技术中的应用
大肠杆菌在分子生物学与生物技术中的应用大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于动物肠道中的杆菌。
由于其生长速度快、操作简便，以及其成熟的遗传学和基因工程技术，大肠杆菌成为了分子生物学和生物技术领域中的重要研究对象。
一、大肠杆菌在基因克隆中的应用大肠杆菌的遗传学研究始于20世纪40年代，随着现代分子生物学和基因工程技术的发展，大肠杆菌成为了最常用的基因克隆宿主。
大肠杆菌的基因组是一个圆形双链DNA分子，包含了约4,500个基因。
大肠杆菌的基因组大小适中，便于操作；并且绝大部分基因已经被注释，可以用于数据挖掘、基因分析和改造等应用。
在大肠杆菌中可以克隆各种带有启动子、编码区、反义密码子等功能区域的外来DNA分子，可以通过分子克隆技术的方法，将所需基因克隆到质粒或染色体上，进而实现目的基因的表达和功能研究。
二、大肠杆菌在表达蛋白的应用大肠杆菌是常用的表达蛋白宿主，可以通过在其基因组中插入外源基因，并将其发挥于目的蛋白的生产。
这是一种简单、高效的生产蛋白的方法。
大肠杆菌表达系统已成为工业化生产重要蛋白的主要方法之一。
目前，大肠杆菌表达体系主要分为原核和真核两类。
原核表达是指将外源基因插入质粒，导入大肠杆菌中进行表达。
真核表达是指将外源基因插入真核细胞质粒中，将其转化为蛋白，再将蛋白导入大肠杆菌中进行后续处理。
三、大肠杆菌在基因编辑和基因改造中的应用大肠杆菌作为常见的细胞工厂，在基因编辑和基因改造中发挥着重要的作用。
通过大肠杆菌的基因编辑，可以有效抑制或改变其特定的基因表达。
所谓基因编辑，是指通过介导靶向去除或替换基因片段，引发突变或修复突变，从而实现特定基因的功能破坏或修复。
使用大肠杆菌进行基因编辑的优点是：操作简单；高效性、不依赖于携带外界基因的载体；可靠性好、操作风险较低；适用于单个、多个或整个基因谱系的编辑。
四、大肠杆菌在制药领域中的应用大肠杆菌被广泛应用于生产制备各种生物制品，如抗生素、酶、质粒、疫苗、抗体和蛋白类产品等。
生物工程制药之基因工程制药7
基因工程制药
3.3.2.2、互补DNA第一链的合成
mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡 聚脱氧胸苷酸为引物，在反转录酶的催化下，开始互补 DNA的合成。在合成反应体系中加入一种放射性标记的 dNTP，在反应中以及反应后可通过测定放射性标记的 dNTP掺入量，计算出互补DNA的合成效率，在凝胶电泳 后，进行放射自显影分析产物的分子大小，探索最佳反应 条件。
3、不致病、不产生内毒素；
4、发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高，产物容易提取。
基因工程制药
3.4.1 宿主细胞的选择 宿主可分为两大类： 原核细胞—大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌； 真核细胞—酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞。
基因工程制药
3.2基因工程药物生产的基本过程
•目的基因的克隆； •构建DNA重组体；
•将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌；
•工程菌的发酵； •外源基因表达产物的分离纯化； •产品的检验等。
基因工程制药
3.2.1制备基因工程药物的一般程序：
获得目的基因 组建重组质粒 构建基因工程菌
培养工程菌
产物分离纯化 除菌过滤 半成品检定 成品检定 包装
生物制药工艺（基因工程制药）
基因工程技术就是将重组对象的目的基因 插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成 工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的 基因在工程菌内进行复制和表达的技术。
基因工程制药
3.1基因工程技术生产药物的优点：
1、大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床 使用提供有效的保障； 2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生 化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围 3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； 4、内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处， 可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除； 5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
五年高考题专题讲解之选修3：现代生物科技专题
（2）转化 外壳蛋白（噬菌体蛋白） 细菌（3）蛋白酶缺陷型 蛋白酶
7.2018全国卷Ⅱ第38题
[生物——选修3：现代生物科技专题]（15分）
某种荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光,这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达,某科研团队将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5’末端,获得了L1-GFP融合基因（简称为甲）,并将其插入质粒P0,构建了真核表达载体P1,其部分结构和酶切位点的示意图如下,图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是__________（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、________________。
菌落类型平板类型
【答案】 (1). 能保持植物原有的遗传特性，繁殖速度快 (2). 有利于胚状体进行呼吸作用
矿质元素 糖 (3). 茎尖 (4). 含目的基因的细胞 愈伤组织 小植株
3.2019全国卷Ⅲ第38题
[生物——选修3:现代生物科技专题](15分)
培养胡萝卜根组织可获得试管苗，获得试管苗的过程如图所示。
回答下列问题。
真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。回答下未得到蛋白A，其原因是_____________________。
（1）EcoRV酶切位点为 ，EcoR V酶切出来的线性载体P1为___________未端。
第六章真核基因在大肠杆菌中的表达
分离功能的启动子：
将大肠杆菌基因组的酶切片断，克隆在pOK1质 粒载体的MCS区的单克隆位点上；
将体外连接的DNA重组分子，转化给具GalE＋、 GalK－的大肠杆菌寄主细胞，避免内源半乳糖激酶 的干扰；
将它们涂布在麦氏培养基（含有PH值指示剂的 中性红和结晶紫，检测碳水化合物）上，筛选转化 子（重组子产生红色的菌落）。
质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道质粒扩增时序的控制pcp33拥有一个温度可诱导型的复制子在28时每个细胞的质粒拷贝数为60在42时拷贝数迅速增至300600在此温度下受体细胞染色体上的ci基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活因此用一种手段同时控制质粒拷贝数和基因的表3mrna转录本的分子特性对基因表达效率的影响转译起始序列对表达效率的影响mrna的稳定性对表达效率的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响sd序列的影响
大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段。
5. 转译终止子 mRNA转译终止必须存在终止密码子。
大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA，尤其是 在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下， 转译终止的效率便会得到进一步的增强。
二、功பைடு நூலகம்启动子的分离
一般程序：
1、选用一种适当的核酸内切酶，消化切割大肠杆菌的染 色体DNA，
第六章 真核基因在大肠杆菌中的表达
真核基因的大肠杆菌表达体系 大肠杆菌的表达载体 克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达 影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素
大肠杆菌表达体系 克隆基因正确表达的基本条件 克隆基因表达活性的检测
真核基因在大肠杆菌中的表达形式
大肠杆菌被内膜和外膜隔成3个腔：胞内、周质和胞外，表达的蛋白定位于这3个腔内。
真核基因在大肠杆菌的表达形式根据表达产物的定位一般可分为两类：胞内表达和蛋白分泌表达。
胞内表达是最主要的表达形式，表达产物以可溶性蛋白和/或不溶性的包涵体形式存在于大肠杆菌细胞内。
而根据表达产物本身的性质又分为融合表达和非融合表达。
一、胞内表达1、非融合表达非融合表达即直接表达天然蛋白，所表达的真核生物蛋白肽链的N端不含有任何原核肽段。
真核基因通常缺乏能被原核生物的转录和翻译系统识别的序列，包括启动子、有效地核糖体结合位点，有时还缺乏ATG起始密码子和转录终止子，因此必须插入带有这些调控序列的表达载体方能表达。
有时，非融合表达不能产生目的蛋白，尤其是目的蛋白的氨基酸含有甲硫氨酸时。
由于甲硫氨酸是由ATG编码的，在大肠杆菌中，氨基端的甲硫氨酸会被不同程度地去除。
此外，非融合蛋白易被宿主蛋白酶破坏，产生无活性的蛋白，这是影响表达效率的重要因素。
克服的方法有：①采用Ion-营养缺陷型宿主。
大肠杆菌蛋白酶的合成主要依赖于黄嘌呤核苷（Ion），用Ion-宿主，使蛋白酶不能合成，从而保护真核蛋白；②克隆Pin基因。
T4噬菌体Pin基因产物为细菌蛋白酶抑制剂，将Pin基因克隆到质粒上，并转化大肠杆菌，可保护真核蛋白。
2、融合表达融合表达即表达的真核蛋白肽链N端含原核生物肽段，融合表达的方法是将真核基因插入启动子后已证实能高效表达的原核结构基因的下游，以产生融合蛋白的方式表达目的基因。
由于融合基因5'端为表达载体中的原核基因序列，已优化的翻译起始区的二级结构不受插入外源基因的干扰，因此，融合表达的效率高。
需要注意的是，插入基因的转录方向和阅读框架必须与原核片段的阅读框架相吻合，不能产生移码，否则不能表达。
融合蛋白需经处理后方能释放出真核蛋白，常用的后处理方法有溴化氰和蛋白酶裂解，这就要求融合蛋白在其原核肽段与目的蛋白间应含有能被溴化氰和蛋白酶裂解的序列，而且目的蛋白内部不能含有溴化氰和蛋白酶切割位点。
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功能启动子的分离： 一般程序： 1. 选用一种适当的核酸内切酶，消化切 割大肠杆菌的染色体DNA， 2. 接着将切割产生的DNA限制片断群体， 同一种无启动子的质粒载体重组，按 实验设计要求使克隆的片断恰好插入 在紧邻报告基因的上游位置 3. 随后把此重组混合物转联反应测定法 使DNA模板在细菌无细胞体系中， 进行转录－转译偶联反应。经过改 良的这种体系中，可以使克隆在细 菌质粒或噬菌体基因组上的外源片 断进行体外表达，就可以比较容易 的确定多肽片断是由编码模板上的 哪个小片段指导合成的。
优点： 1. 放射性标记参入到蛋白质的效率， 比体内标记法高的多，而且这个系 统十分敏感。经35S标记的多肽分子， 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自 显影若干小时后可被迅速检出； 2. 应用这个体系，其它原核生物的基 因也能够得到有效的表达。
大肠杆菌中表达体系的不足： 1. 真核基因，在结构上同原核基因之间 存在着很大的差别。 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。 细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启 动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转 录终止信号功能的核苷酸序列。 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的 有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。
通过蔗糖梯度离心将微细胞与 正常细胞分开，含有质粒载体的 微细胞是适于检测重组子质粒所 携带的外源基因表达状况的理想 体系。
Example:
ColE1的衍生质粒（缺失了106dal）, 在微细胞中不能合成出56103dal、 42103dal、30103dal、 28103dal四种多 肽。其中3种多肽是大肠杆菌E1的降解产物。 当一段含有EcoR1甲基化酶的DNA片断插 入到卡那霉素基因内部时，便能在微细胞 中合成EcoR1甲基化酶和另外2种其它的多 肽分子。
3. 转译起始序列 5’-末端结构特征，决定mRNA的转 译起始效率。 在核糖体结合位点（RBS）的序列 结构中，增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脱 氧核苷残基含量的比例，诱发碱基 发生定点突变；或使用转译偶联系 统进行克隆基因表达
4.转译增强子 显著的增加异源基因在大肠杆菌中 的表达效率。 5. 转译终止子 mRNA转译终止必须存在终止密码 子。 大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA， 尤其是在其后加上U形成UAAU四联 核苷酸的情况下，转译终止的效率 便会得到进一步的增强。
4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要 经过转译后的加工修饰（正确折叠 和组装），而大多数的这类修饰作 用在细菌细胞中并不存在； 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真 核基因所表达的蛋白质分子，并把 它们降解掉。
克隆基因正确表达的基本条件
最基本条件：应该能够进行正常的 转录和转译，以及在正常情况下还 与转译后加工及新生多肽在细胞中 的分布有关。
第三 这种启动子应是诱导型的，能通 过简单的方式使用廉价的诱导物而 得以诱导。 （IPTG）
2. 转录终止子 启动子封堵作用：由一个上游启动 子驱动的转录作用，当其通读过下 游启动子时，便会使该启动子的功 能受到抑制，将这种由一个启动子 的功能活性抑制另一个启动子转录 的现象，叫做启动子封堵作用。 转录终止子还能增强mRNA分子 的稳定性，从而提高蛋白质产物的 水平。
巨细胞检测法 1. 经紫外线照射的大肠杆菌recA uvrA细 胞，DNA停止合成，而质粒载体则可以 继续合成，在紫外线照射后6小时，细 胞内质粒DNA的数量增加了10倍左右， 在紫外线照射后的几个小时内，加入经 放射性标记的氨基酸，此时合成的蛋白 质绝大部分是质粒基因所编码的。
2. 将含有外源基因的λ噬菌体重 组子，感染到事先经过紫外线严格 照射的大肠杆菌细胞上。由于细胞 经紫外线照射使DNA受到了损伤， 自身基因的表达受到了严重的抑制。 通过同λ噬菌体载体编码的蛋白质 种类作比较，就可以鉴定出克隆基 因编码的蛋白质产物。
大肠杆菌表达载起点
组成部分
1.启动子： 最佳启动子具备的条件 第一 必须是将启动子，能够克隆基因的 蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%30%以上 第二 这个启动子应能呈现出一种低限的 基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或 是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下， 使用高度抑制型的启动子是一种极为重要 的条件
报告基因（reporter gene）：特指那些 编码产物可以被快速测定的功能核苷酸 编码单元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸 酶基因、萤光素酶基因、半乳糖激酶基 因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。 追踪某种特定的DNA结构（重组质粒） 是否已经导入寄主细胞、抑或是器官和 组织；也可用来同任何一种目的启动子 连接，因此其表达活性可作为检测启动 子功能的依据。
重要条件：编码的蛋白质产物应能 维持正常的稳定性。
具有核糖体结合位点； 具有克隆基因的功能（强）启动子； 插入序列的正确取向。
真核基因在大肠杆菌中的表达
克隆基因表达活性的检测
1.微细胞检测法； 2.巨细胞检测法； 3.偶联反应测定法。
微细胞检测法： 这是一种适于检测质粒基因表达的 体内检测法。 微细胞：指由某些细菌突变体菌株 在其生长期间连续产生的一类微小 的圆形的无核细胞。
第四章 真核基因在大肠杆菌中的表达
• • • • 真核基因的大肠杆菌表达体系 大肠杆菌的表达载体 克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达 影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因 素
• 大肠杆菌表达体系 • 克隆基因正确表达的基本条件 • 克隆基因表达活性的检测
真核基因的大肠杆菌表达体系
大肠杆菌表达体系
优越性：
1. 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因 表达调控的分子机理有深刻的了解； 2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥 有各类适用的寄主菌株和不同类型的载 体； 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆 菌细胞中实现有效、高水平的表达； 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本 低廉，易用于批量生产。