蛋白质的分离纯化方法一
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蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的 通性（布朗运动，丁达尔现象，不能通过半透膜）。 透析：将含小分子杂质的蛋白质放入透析袋中，置水溶液中， 小分子杂质不断从袋中出来，大分子蛋白质仍留在袋中。
蛋白质在水中溶解度依赖于多肽链氨基酸残基侧链基团的相对 极性，离子化基团数量越多，溶解度越大。
（三）蛋白质的扩散和扩散系数
扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。扩散的热 力学驱动力是熵的增加。 扩散系数 D：等于当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟 内通过1cm2面积所扩散的溶质量。 扩散系数随Mr的增加而降低，但对Mr的变化不敏感。对 球形的大分子来说，扩散系数与Mr的立方根成反比。
楚雄师范学院化学与生命科学系
沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降 的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰 冻切片采样分析。
蔗糖密度梯度
聚蔗糖密度梯度
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范树国
3.凝胶过滤
交联葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P ）；琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A）
洗脱： 低盐高pH
非离子型去污剂（triton x-100) 脂肪醇（丁醇、乙二醇）
（五）利用对配体的特异生物学亲和力的纯 化方法
配基： 酶的底物、辅酶、抑制剂、 效应物及其结构类似物， 激素与受体蛋白，抗原与 抗体，生物素与亲和素 （抗亲和素蛋白），凝集 素。 免疫亲和层析 凝集素亲和层析 金属螯和层析 染料配体层析
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（四）沉降分析法测定相对分子量
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1.沉降速率法
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2.沉降平衡法
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（五）凝胶过滤法测定蛋白质相对分子量
（六）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子量
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
（一）蛋白质的胶体性质
4、浓缩与保存 浓缩方法： 保存方法： ①晶体保存： 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯 度 的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高， 溶液越浓，越容易结晶。 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加 有机溶剂、调节pH、接入晶种。 ②冻干粉保存： ③溶液保存： 加入抗冻剂（50%甘油）后-20～-70℃保存。
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交联葡聚糖（Sephadex）
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（二）利用溶解度差别的纯化方法
1.等电点沉淀和pH控制
在等电点条件下，蛋白质 的电导性、溶解度最小， 粘度最大。
在 pI 时，分子电荷为零， 蛋白质分子间的静电排斥 消失，从而蛋白质出现聚 集沉淀。
③如果提取膜蛋白： 超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。
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2、粗分级（rough fractionation) 一般用选择性沉淀法。 ①（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析） ②等电点选择性沉淀法 ③有机溶剂分级沉淀法 ④热处理选择性沉淀法 ⑤生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法
3、细分级（fine fractionation) ①透析除盐 ②sephdex G-25凝胶过滤除盐 ★层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层 析、疏水层析（反相HPLC） ★电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜 电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、盘状电泳、等电聚焦、双向 电泳 ★密度梯度离心
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（二）渗透压法测定相对分子量
用半透膜将蛋白质溶液与纯水隔开，当渗透达平衡时，测 定其渗透压，计算分子量：
Mr ＝
c→0 c
lim π
RT
C：浓度（g/m3） R：气体常数（8.314J/(K· mol)) T：绝对温度（K） ：以大气压表示的渗透压(N/m2)
五、蛋白质的分离纯化方法
（一）根据分子大小不同的纯化方法
1.透析和超滤
透析：半透膜阻留蛋白质分子，而让小的溶质分子和水通 过，以除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。
超滤：施以一定的压力
使小分子溶质通过半透
膜，而按半透膜的筛孔 大小截留相应的蛋白质 分子
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2.密度梯度（区带）离心
天然球状蛋白质的可解离基团大部分可被滴定，而某些天 然蛋白质中有一部分可解离基团由于埋藏在分子内部或参 与氢键形成而不能解离。
等电点：在某一pH，它所带的正电荷与负电荷相等。蛋白 质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基 的比例有关。 等离子点：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体解离出 的质子数与质子受体结合的质子数相等时的pH值称等离子 点，是每种蛋白质的特征常数。
二、蛋白质分子的大小与形状
（一）根据化学组成测定最低相对分子量
如Mb含铁量为0.335%，其最低相对分子质量为：
铁的原子量 Mb最低相对分子质量＝ 铁的百分含量
×100
＝55.8/0.335 ×100＝16700
Hb最低相对分子质量＝16700×4 牛血清白蛋白含Trp0.58% 最低Mr=35200，实际为69000，含2个Trp
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六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
（一）蛋白质含量测定
总蛋白含量分析： 凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、考马斯 亮蓝法、紫外吸收法。 特定蛋白组分的含量分析： 酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性） 其它蛋白：抗原抗体反应(western blot)
四、蛋白质分离纯化的一般原则
纯化的实质：增加制品(preparation)的纯度或比活性。 ①蛋白与非蛋白分开，②蛋白质之间分开 一般程序：前处理、粗分级、细分级、浓缩与保存
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前 处 理
生物组织
破碎、溶 解、差速离心
无细胞提取液
粗 分 离
选择性沉淀法
离子交 换层析 疏水 层析 吸附 层析
范树国
（四）利用选择性吸附的纯化方法
极性：硅胶、氧化铝、岩藻土（离子吸引和氢键） 非极性：活性炭（范德华力、疏水作用） 最广泛最有效：羟基磷灰石（ hydroxyapatite) ，即结晶磷 酸钙 [Ca10 （ PO4 ） 6 （ OH ） 2] ，可分离蛋白质、核酸，与 DNA 的亲和力最高
层析介质：苯基琼脂糖（phenyl-sephadex) 辛基琼脂糖(octa-sephadex)
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2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
3.毛细管电泳
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4.等电聚焦电泳
等电聚焦电泳法测定蛋白质pI
5.SDS-PAGE
6.离子交换层析
离子交换纤维素： 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖：
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与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中 的溶解度显著降低。在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质 沉淀，而且伴随者变性。
在一定温度、pH和离子强度条件下，引进蛋白质沉淀的有机溶剂 的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分离蛋白质。 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变介质的介电常数； 另一重要方式可能与盐析相似，与蛋白质争夺水化水，致使蛋白 质聚集体的形成并沉淀。
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（二）纯度鉴定（均一性）
基本手段：电泳分析：单条带。 N端测定：1种N端氨基酸。 选用手段：沉降分析、溶解度分析、结晶分析（能结晶的一般 比较纯，具有活性） 其它鉴定工作： 1.分子量的测定； 2.等电点测定； 3.N-末端AA测定； 4.C-末端AA的测定（肼解法）； 5.分子中糖链：①血球凝集反应；②糖蛋白电泳（甲苯胺兰、 R山兰、schiff试剂）；③糖组分分析（层析、液相色谱） 6.含脂成分：苏丹黑预染、电泳。 7.光吸收：全波长扫描。找出它的吸收峰位置和最大吸收值。 8.AA组分分析。
稳定蛋白质胶体溶液的主要因素 ①蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开， 不会互相碰撞凝聚而沉淀。 ②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，互相排斥不致聚集 而沉淀。
一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从溶液 中析出沉淀。
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（二）蛋白质的沉淀
①盐析法 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4）2SO4、 Na2SO4、NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。 ②有机溶剂沉淀法 破坏水化膜，降低介电常数。 ③重金属盐沉淀 pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与 重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀 ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法 pH小于等电点时，蛋白质 带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。 生物碱试剂：是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸、 苦味酸、钨酸。酸 类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 ⑤加热变性沉淀 往往是不可逆的。
水溶性非离子聚合物如聚乙二醇（PEG）也能引起蛋白质沉淀。 聚乙二醇的主要作用可能是脱去蛋白质的水化层。聚乙二醇与蛋 白质亲水基团发生相互作用并在空间上阻碍蛋白质与水相接近。 蛋白质在聚乙二酵中的溶解度明显地依赖于聚乙二醇的分子量。
4.温度对蛋白质溶解度的影响
在一定的温度范围内，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升 高而增加。
第七章 蛋白质的分离、纯化与表征
一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质分子的大小与形状
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
四、蛋白质分离纯化的一般原则 五、蛋白质的分离纯化方法
六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
一、蛋白质的酸碱性质
蛋白质是一类两性电解质，能与酸或碱发生作用。在蛋白 质分子中，可解离基团主要是侧链基团，及少数 N 端 -NH2 和C端-COOH。
电泳
凝胶 过滤
亲和 层析
细 分 离 精制后的蛋白质
1、前处理： ①将组织和细胞破碎 动物组织和细胞：电动捣碎机（waring blender) 匀浆器（homogenizer) 超声波处理（ultrasonication) 植物组织和细胞：石英砂+提取液，研磨 纤维素酶处理 细菌： 超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌 酶处理（分解肽聚糖） ②差速离心法收集细胞的某一组分（differential centrifugation)： 在不同离心力下沉降的细胞组分
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普通电泳、等电聚焦、 双向电泳、脉冲电泳、 毛细管电泳 从电泳结果分：自由界 面电泳、区带电泳、盘 状电泳 从装置上分： 圆盘电 泳（柱状）、水平板电 泳、垂直板电泳。 从支持物分： 自由界 面电泳、纸电泳（或薄 膜电泳）、凝胶电 泳（ PAGE ，琼脂糖胶， 淀粉胶等）
大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操 作一般都在0℃或更低的温度下进行。
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（三）根据电荷不同的纯化方法
1.电泳
在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋 白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称 电泳(electrophoresis)或离子泳(ionphoresis)。 电泳不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要于 段，而且也是研究蛋白质性质很有用的一种物理化学方法。
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2.蛋白质的盐溶和盐析
盐溶：低盐浓度时，蛋白质溶 解度增加。 盐析：高盐浓度时，使蛋白质 溶解度降低析出。 盐析多用溶解度大的中性盐， 如 (NH4)2SO4 、 NaCl 、 MgCl2 、 NH4Cl、KCl等的饱和溶液。
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3.有机溶剂分级分离法
蛋白质在水中溶解度依赖于多肽链氨基酸残基侧链基团的相对 极性，离子化基团数量越多，溶解度越大。
（三）蛋白质的扩散和扩散系数
扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。扩散的热 力学驱动力是熵的增加。 扩散系数 D：等于当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟 内通过1cm2面积所扩散的溶质量。 扩散系数随Mr的增加而降低，但对Mr的变化不敏感。对 球形的大分子来说，扩散系数与Mr的立方根成反比。
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沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降 的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰 冻切片采样分析。
蔗糖密度梯度
聚蔗糖密度梯度
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3.凝胶过滤
交联葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P ）；琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A）
洗脱： 低盐高pH
非离子型去污剂（triton x-100) 脂肪醇（丁醇、乙二醇）
（五）利用对配体的特异生物学亲和力的纯 化方法
配基： 酶的底物、辅酶、抑制剂、 效应物及其结构类似物， 激素与受体蛋白，抗原与 抗体，生物素与亲和素 （抗亲和素蛋白），凝集 素。 免疫亲和层析 凝集素亲和层析 金属螯和层析 染料配体层析
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（四）沉降分析法测定相对分子量
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1.沉降速率法
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2.沉降平衡法
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（五）凝胶过滤法测定蛋白质相对分子量
（六）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子量
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
（一）蛋白质的胶体性质
4、浓缩与保存 浓缩方法： 保存方法： ①晶体保存： 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯 度 的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高， 溶液越浓，越容易结晶。 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加 有机溶剂、调节pH、接入晶种。 ②冻干粉保存： ③溶液保存： 加入抗冻剂（50%甘油）后-20～-70℃保存。
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（二）利用溶解度差别的纯化方法
1.等电点沉淀和pH控制
在等电点条件下，蛋白质 的电导性、溶解度最小， 粘度最大。
在 pI 时，分子电荷为零， 蛋白质分子间的静电排斥 消失，从而蛋白质出现聚 集沉淀。
③如果提取膜蛋白： 超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。
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2、粗分级（rough fractionation) 一般用选择性沉淀法。 ①（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析） ②等电点选择性沉淀法 ③有机溶剂分级沉淀法 ④热处理选择性沉淀法 ⑤生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法
3、细分级（fine fractionation) ①透析除盐 ②sephdex G-25凝胶过滤除盐 ★层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层 析、疏水层析（反相HPLC） ★电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜 电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、盘状电泳、等电聚焦、双向 电泳 ★密度梯度离心
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（二）渗透压法测定相对分子量
用半透膜将蛋白质溶液与纯水隔开，当渗透达平衡时，测 定其渗透压，计算分子量：
Mr ＝
c→0 c
lim π
RT
C：浓度（g/m3） R：气体常数（8.314J/(K· mol)) T：绝对温度（K） ：以大气压表示的渗透压(N/m2)
五、蛋白质的分离纯化方法
（一）根据分子大小不同的纯化方法
1.透析和超滤
透析：半透膜阻留蛋白质分子，而让小的溶质分子和水通 过，以除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。
超滤：施以一定的压力
使小分子溶质通过半透
膜，而按半透膜的筛孔 大小截留相应的蛋白质 分子
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2.密度梯度（区带）离心
天然球状蛋白质的可解离基团大部分可被滴定，而某些天 然蛋白质中有一部分可解离基团由于埋藏在分子内部或参 与氢键形成而不能解离。
等电点：在某一pH，它所带的正电荷与负电荷相等。蛋白 质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基 的比例有关。 等离子点：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体解离出 的质子数与质子受体结合的质子数相等时的pH值称等离子 点，是每种蛋白质的特征常数。
二、蛋白质分子的大小与形状
（一）根据化学组成测定最低相对分子量
如Mb含铁量为0.335%，其最低相对分子质量为：
铁的原子量 Mb最低相对分子质量＝ 铁的百分含量
×100
＝55.8/0.335 ×100＝16700
Hb最低相对分子质量＝16700×4 牛血清白蛋白含Trp0.58% 最低Mr=35200，实际为69000，含2个Trp
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六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
（一）蛋白质含量测定
总蛋白含量分析： 凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、考马斯 亮蓝法、紫外吸收法。 特定蛋白组分的含量分析： 酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性） 其它蛋白：抗原抗体反应(western blot)
四、蛋白质分离纯化的一般原则
纯化的实质：增加制品(preparation)的纯度或比活性。 ①蛋白与非蛋白分开，②蛋白质之间分开 一般程序：前处理、粗分级、细分级、浓缩与保存
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前 处 理
生物组织
破碎、溶 解、差速离心
无细胞提取液
粗 分 离
选择性沉淀法
离子交 换层析 疏水 层析 吸附 层析
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（四）利用选择性吸附的纯化方法
极性：硅胶、氧化铝、岩藻土（离子吸引和氢键） 非极性：活性炭（范德华力、疏水作用） 最广泛最有效：羟基磷灰石（ hydroxyapatite) ，即结晶磷 酸钙 [Ca10 （ PO4 ） 6 （ OH ） 2] ，可分离蛋白质、核酸，与 DNA 的亲和力最高
层析介质：苯基琼脂糖（phenyl-sephadex) 辛基琼脂糖(octa-sephadex)
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3.毛细管电泳
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等电聚焦电泳法测定蛋白质pI
5.SDS-PAGE
6.离子交换层析
离子交换纤维素： 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖：
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与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中 的溶解度显著降低。在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质 沉淀，而且伴随者变性。
在一定温度、pH和离子强度条件下，引进蛋白质沉淀的有机溶剂 的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分离蛋白质。 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变介质的介电常数； 另一重要方式可能与盐析相似，与蛋白质争夺水化水，致使蛋白 质聚集体的形成并沉淀。
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（二）纯度鉴定（均一性）
基本手段：电泳分析：单条带。 N端测定：1种N端氨基酸。 选用手段：沉降分析、溶解度分析、结晶分析（能结晶的一般 比较纯，具有活性） 其它鉴定工作： 1.分子量的测定； 2.等电点测定； 3.N-末端AA测定； 4.C-末端AA的测定（肼解法）； 5.分子中糖链：①血球凝集反应；②糖蛋白电泳（甲苯胺兰、 R山兰、schiff试剂）；③糖组分分析（层析、液相色谱） 6.含脂成分：苏丹黑预染、电泳。 7.光吸收：全波长扫描。找出它的吸收峰位置和最大吸收值。 8.AA组分分析。
稳定蛋白质胶体溶液的主要因素 ①蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开， 不会互相碰撞凝聚而沉淀。 ②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，互相排斥不致聚集 而沉淀。
一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从溶液 中析出沉淀。
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（二）蛋白质的沉淀
①盐析法 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4）2SO4、 Na2SO4、NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。 ②有机溶剂沉淀法 破坏水化膜，降低介电常数。 ③重金属盐沉淀 pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与 重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀 ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法 pH小于等电点时，蛋白质 带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。 生物碱试剂：是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸、 苦味酸、钨酸。酸 类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 ⑤加热变性沉淀 往往是不可逆的。
水溶性非离子聚合物如聚乙二醇（PEG）也能引起蛋白质沉淀。 聚乙二醇的主要作用可能是脱去蛋白质的水化层。聚乙二醇与蛋 白质亲水基团发生相互作用并在空间上阻碍蛋白质与水相接近。 蛋白质在聚乙二酵中的溶解度明显地依赖于聚乙二醇的分子量。
4.温度对蛋白质溶解度的影响
在一定的温度范围内，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升 高而增加。
第七章 蛋白质的分离、纯化与表征
一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质分子的大小与形状
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
四、蛋白质分离纯化的一般原则 五、蛋白质的分离纯化方法
六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
一、蛋白质的酸碱性质
蛋白质是一类两性电解质，能与酸或碱发生作用。在蛋白 质分子中，可解离基团主要是侧链基团，及少数 N 端 -NH2 和C端-COOH。
电泳
凝胶 过滤
亲和 层析
细 分 离 精制后的蛋白质
1、前处理： ①将组织和细胞破碎 动物组织和细胞：电动捣碎机（waring blender) 匀浆器（homogenizer) 超声波处理（ultrasonication) 植物组织和细胞：石英砂+提取液，研磨 纤维素酶处理 细菌： 超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌 酶处理（分解肽聚糖） ②差速离心法收集细胞的某一组分（differential centrifugation)： 在不同离心力下沉降的细胞组分
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大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操 作一般都在0℃或更低的温度下进行。
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（三）根据电荷不同的纯化方法
1.电泳
在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋 白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称 电泳(electrophoresis)或离子泳(ionphoresis)。 电泳不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要于 段，而且也是研究蛋白质性质很有用的一种物理化学方法。
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2.蛋白质的盐溶和盐析
盐溶：低盐浓度时，蛋白质溶 解度增加。 盐析：高盐浓度时，使蛋白质 溶解度降低析出。 盐析多用溶解度大的中性盐， 如 (NH4)2SO4 、 NaCl 、 MgCl2 、 NH4Cl、KCl等的饱和溶液。
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