鱼精蛋白

鱼精蛋白改性磷酸钙和共沉淀法制备的磷酸钙粒径大小分析

研究纳米颗粒转染时，粒径是十分重要的一个指标。为进一步研究鱼精蛋白增加磷酸钙转染效果，提高稳定性的原因，我们用原子力显微镜观察了PS-CaP和CaP颗粒。如图3所示。发现PS-CaP 的粒径比CaP粒径小。可能是PS-CaP比CaP效果好的重要原因。

图3 原子力显微镜观察鱼精蛋白改性磷酸钙。实验室共沉淀法合成的磷酸钙颗粒转染同样质量的质粒作对照。

鱼精蛋白改性磷酸钙的细胞毒性研究。

为进一步研究和应用鱼精蛋白改性磷酸钙，我们研究了其细胞毒性。将0.5倍、1倍、2倍浓度PS-CaP和CaP分别处理HEK293细胞24h，用MTT法检测其对细胞活性的影响。如图4所示，PS-CaP和CaP的MTT吸收值没有明显区别。

图4一系列不同浓度（0.5-2倍转染浓度）的PSAN-MMT被用于处理HEK 293细胞，然后检测MTT吸收值来衡量其对细胞增殖活力的抑制作用。

讨论

20世纪90年代以来，基因治疗作为一种全新的生物治疗方法蓬勃兴起。成功的基因治疗既依赖于基因转移载体有效地转运外源基因至目的细胞，又依赖于外源基因在细胞内充分的表达，后者可通过改造基因表达载体，如赋予其高效的启动子和增强子来实现，这方面的研究已相当成熟(Anderson, 1984)，如基因转移载体以及与载体相关的安全性、毒性等问题成为基因治疗能否成功的关键。

纳米生物技术的发展为解决基因载体问题及与载体相关的细胞毒性、安全性等问题提供了新的材料和方法。纳米粒具有小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应(Peng, 1999)以及较强的吸附性和化学、生物活性。由于具有很强的表面能和较大的比表面积及较多的结合位点，纳米粒吸附DNA、聚合物、抗体或配体等生物大分子的能力远较普通基因载体强，且无毒、无免疫原性，有望成为理想的基因载体。近年来，越来越多的有机、无机材料及有机和无机复合材料纳米粒作为基因载体被成功地用于哺乳动物细胞的基因转染实验中，取得了满意的结果(Crystal, 1995; Leong et al., 1998)。

磷酸钙作为一种生物医用材料，具有良好的生物相容性和生物活性，在医学上有着广泛的用途。而鱼精蛋白改性后纳米级的磷酸钙比普通的磷酸钙有更佳的理化性质和生物学性能。从理论上并结合无机纳米粒成功的应用于基因转染的经验出发(Leong et al., 1998; Roy et al., 1999)，磷酸钙有可能被改造成理想的基因载体。

本课题成功的制备了粒径更小的磷酸钙纳米颗粒（图3），鱼精蛋白修饰的磷酸钙颗粒，经试验证明具有比普通磷酸钙更佳的转染效果（图1），并且能够增加磷酸钙颗粒的稳定性，

使得放置一段时间后的磷酸钙颗粒仍然具有较好的转染能力（图2）。

除转染效率外，基因载体对受体细胞的毒性也是衡量载体优劣的一项重要指标。脂质体及阳离子聚合物载体因其表面的阳离子同带负电荷的细胞膜作用，可使细胞膜不稳定进而损伤细胞膜，甚至导致细胞死亡(Cortesi et al., 1996).。尽管磷酸钙颗粒生物相容性好，对正常细胞几乎无毒性，但由于带正电荷的鱼精蛋白修饰，故也存在不利因素。据研究，所测试物质作用于体外细胞达24小时而未显示毒性时，可认为该物质相对无针对该细胞的毒性，故本研究选在转染复合物加入细胞培养液中孵育24小时后进行MTT比色实验。实验结果是鱼精蛋白改性的磷酸钙与普通磷酸钙一样没有明显的影响细胞活性（图4）。但MTT法对转染复合物是否导致短暂的、轻度的某些细胞代谢功能的改变却难以反映，这里有待今后进一步研究。

结语

非病毒载体是基因治疗载体正被广泛的研究，而使用有机改性无机物作为载体，结合两者优势的方式是今后的发展趋势。

本论文探讨了鱼精蛋白改性磷酸钙作为转染载体使用的情况，得出如下结论：鱼精蛋白改性磷酸钙比普通磷酸钙有更好的转染效果，能够增加颗粒的稳定性，一个可能的原因是鱼精蛋白改性磷酸钙比普通磷酸钙有着更小的粒径。另外，鱼精蛋白改性并没有增加磷酸钙颗粒的细胞活性抑制作用。本工作发现鱼精蛋白改性磷酸钙是一种有效的非病毒基因转染载体。

Anderson, W., 1984. Prospects for human gene therapy. Science. 226, 401-409.

Anderson, W., Blaese, R., Culver, K., 1990. The ADA human gene therapy clinical protocol: points to consider response with clinical protocol. Hum Gene Ther. 1, 331-362.

Cortesi, R., Esposito, E., Menegatti, E., Gambari, R., Nastruzzi, C., 1996. Effect of cationic liposome composition on in vitro cytotoxicity and protective effect on carried DNA. International Journal of Pharmaceutics. 139, 69-78.

Leong, K., Mao, H., Truong-Le, V., Roy, K., Walsh, S., August, J., 1998. DNA-polycation nanospheres as non-viral gene delivery vehicles. Journal of Controlled Release. 53, 183-193.

Peng, K., 1999. Strategies for targeting therapeutic gene delivery. Molecular medicine today. 5, 448-453.