关于冰冻切片的若干问题

1.

问：本人将样品固定过后冲洗过后，放入蔗糖溶液，因有事耽搁，放了一个星期了，不知是否还可切片．还有固定过后冲洗用普通蒸馏水冲洗可以吗？我是做免疫组化

答：1、不知道你放置的蔗糖浓度是多少，如果是30%最好是三天之内，50%的浓度可以方久一点，一两个月应该没什么问题。因为蔗糖是高渗环境，不会影响实验结果。祝好运吧！

2、我认为组织在20％蔗糖放一周还是可以切片的，至于固定后的冲洗，可以免掉，也可用0.01MPBS涮洗一下，蔗糖液的量要多加一些

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问：请拟准备做免疫荧光的标本,经前固定灌注后取全脑,后固定4小时后,30%的蔗糖脱水过夜,再用OCT包埋后保存在-80的冰箱,冰冻切片后HE染色,发现整个视野都是大小不等的圆形洞洞,不知道是什么原因.

答:1、个人认为可能是以下几个方面的问题: 30%的蔗糖脱水过夜---- 一般我所采取的是灌注固定后取脑,然后放入30%蔗糖的多聚甲醛溶液中,待脑下沉到底后(大约2天)再切片,用这样的高渗糖既可以防止冰晶又可以继续后固定.单纯的蔗糖过夜应该是不够的.

从30%蔗糖的多聚甲醛溶液中捞出脑后应放入液氮迅速冷冻然后进行切片,不建议用-80度冰箱,曾经用过-80度冰箱结果脑片出现许多冰晶孔.

2、用0.01M的PBS配置的4%多聚甲醛灌注固定后，20%蔗糖（沉底）→30%蔗糖（沉底），然后直接进冰冻切片机急冻15~20min，我们实验室的技术员曾说过，脑标本千万不能用OCT 包埋、液氮冷冻。只要蔗糖脱水彻底，是不会形成冰晶的；而用OCT包埋、液氮冷冻，你没做过，时间不好把握——时间长了，组织会冻裂；时间不够，冷冻效果不好，切片不好切。

3、这个就是实验室和实验室操作方法有所区别了,我说的方法肯定是没有问题的,我们都是这样操作没有出现过冰晶,不用OCT包埋,但确实用液氮,冻10秒,不会冻裂,效果良好.

4、液氮速冻可以防止组织冰晶的形成

冰冻切片心得

1. 取脑一定要在冰上操作,液体也一定用冷的

2. 30%蔗糖一定要充分,最好中间换液一次, 20%的可以不做

3. 沉淀后冻存,一定要快冻, 最好在干冰上操作.

4. 最重要的一点, 灌注的时候, 不要用0.1M PB, 用0.01M PBS. 以前不知道,很多书上写的都是0.1M PB,后来自己用了发现还是有洞. 为了这个,我还专门作了对照实验,结果0.01M PBS更好一些, 原因不知道为什么, 但是事实如此. (理论上高浓度液体更利于保护细胞不会因为冰冻损伤)

5. 如果做磷酸化的抗体,一定记得在灌注液里加一定的抑制剂,如NaF等.

如果是全脑的话，放在30%蔗糖（PBS或PB配）中沉底会很慢，我们都用双蒸水配，先20%沉底，再30%沉底，想要沉底快可将脑先切成小块。

其实我做过很多次只用20%沉底，30%泡过感到有点粘粘的，切出的片子容易卷，不好展开。要切片没有洞关键要速冻，切片机闲时一般温度较高，使用时把温度调到切片温度，先不将脑块放入，待温度降低后再放入以达到速冻的效果。

我做切片的时候，先用20％蔗糖（PB配）沉底，再用30％蔗糖沉底，这样脱水比较充分。一般是等切片机温度达到-22度之后，再将包埋好的脑组织放入。脱水不充分也会导致切片有洞，而且片子容易向内卷，很不好贴。一直这样做了很久，效果都还不错。

防止脑袋冻碎办法：

先准备好一个保温杯，倒入适量的液氮，然后在杯身中放一个纸杯（塑料或玻璃杯禁用），再在杯中放一金属片，以防止纸杯翻倒，动物脑袋取好后，先放在一张小锡箔纸上，然后连锡箔纸一起转移至杯中的金属片上面，盖上保温杯盖，3-5分钟后，见大脑表片颜色变白，表示冷冻完全，随即将大脑用锡箔纸包好，转入-80度冰箱长期保存。

脑片切好后保存方法：

1、先用手指在玻片（已挂好胶）后均匀轻轻过一下，将脑片组织贴在玻片上。

2、37度干燥箱中烘干。

3、放入切片盒中，盖紧盒盖，并用胶带将切片盒封严，外用样品袋包扎严实，即可防止水汽进入。于-20度可保存半年以上，于-80度可保存一年以上。

切忌经常打开盒子。

0.01M PBS配方（pH7.2～7.4）（500 ml）

Na2HPO4•12H2O2（分子量358.14） 2.9g

NaH2PO4•2H2O2 （分子量156.01） 0.295g

NaCl 4.5g

ddH2O 500 ml

混匀，完全溶解后，用H3PO4调PH值至pH7.2～7.4。

用前配制或者于4度短期保存。

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