极端嗜盐古菌的分离与纯化方法初探
极端嗜盐古菌YC71、YC8816SrDNA序列克隆及系统发育学分析
（徐州师范大学生命科学学 院，江苏徐州 ２２１１１６）
摘要 ：运城盐湖位于我国山西省 ，嗜盐微生物资源 丰富。从 运城盐湖 水样 中分离纯化 嗜盐微 生物得到 ２株 嗜盐 古菌 ，编号分别为 ＹＣ７１、ＹＣ８８，经革兰 氏染色鉴定均为 阴性 ，杆 菌。采用古菌通用 引物对 ＹＣ７１、ＹＣ８８的 １６Ｓ ｒＤＮＡ进 行序列扩增 ，各得到 １ ５００ ｂｐ左右 的片段 ，经过测序及分析 ，最终得到长度分别为 １ ４２５ ｂｐ、１ ４３０ ｂｐ的 ＤＮＡ片段 。利 用 ＭＥＧＡ４．０软件和 Ｃｌｕｓｔａｌｘ １．８软件对 ＹＣ７１、ＹＣ８８及相近物种进行同源性 比较和 系统发育分析 ，表 明 ＹＣ７１属于盐 红菌属 （Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ），ＹＣ８８属于盐盒菌属 （Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ）。
关键 词 ：嗜盐菌 ；１６Ｓ ｒＤＮＡ；克 隆 ；系统发育学 中图分类 号 ：Ｑ９３３ 文献标志码 ：Ａ 文章编 号 ：１００２—１３０２（２０１２）０７—００３９—０３
极端嗜盐古 菌广泛分 布于晒盐场 、盐湖 和各种盐制 品等 ＴＴＧＡＴｃｃＴＧＣＣＧＧＡ 一３ ；反 向 弓Ｉ物 ：５ 一ＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣ
江苏农业科学 ２０１２年第 ４０卷第 ７期
一 ３９一
杨依凡，王 璐 ，王 宇，等．极端嗜盐古菌 ＹＣ７１、ＹＣ８８ １６Ｓ ｒＤＮＡ序列克隆及系统发育学分析 ［Ｊ］．江苏农业科学 ，２０１２，４０（７）：３９—４２
极端 嗜盐古菌 ＹＣ７１、ＹＣ８８ １６Ｓ ｒＤＮＡ序列克 隆 及 系统发育学分 析
高盐环境 ，它们最明显的特征是必须在高浓度 ＮａＣ１存在的条 ＡＧＣＣＧＣＡＧ 一３ 。 件下才能很好地 生长 ，这些菌在盐水 中合成 Ｃ５０类胡 萝 卜素 １．２ 方 法
极端嗜盐古菌分类学研究进展
（ ｘｒｍ ｐ ｉ ｓ。 为 了在 极 端 环 境 下 完 成 所 有 的生 命 化 Ｅ ｔ ｏ ｈｌ ） ｅ ｅ
有争议 的地方 。随着生命科学 的不断发 展 ， 的方法和 新 技术 的不断 涌现并应用到分类 学领域 ， 使得 分类 学一直 都处在肯定到否定 、 再到肯定 的发展规律 中。现 将极端
早期对极端嗜盐古 菌 的分类学 研究 仅在 有 限的形
第 一作 者简 介 ： 爽 （ ９ １） 女 ， 宁人 ， 读 博 士 ， 究 方 向为 王 １８一， 辽 在 研
嗜 盐微 生物 的 分 离及分 类 。
化、 生态及进化学家的重要研究对象 。
ｌ 极 端 嗜盐古 菌分 类学 的研 究历史
据记载 ， 早在 ５００年前 我们 的祖 先就 对盐 田中红 ０ 池的现象 有过描述 ， 古埃及人 以及圣经 也都 曾对 这类现
象 做 过记 录 。达 尔 文 （８ ９年 在 做 环 球 旅 行 过 程 中 ） １３ 是
ｈ ｌ ｉｓ ｕｂｒ 。１４ ａｏ ｕ ｂｅ ” ９０年 ，ｌ ａｉ ｏｃｎ 建 立 了极 端 嗜 ｂ ｒ Ｅａ ｒＶ ｌ ｉ ｚ － ａ
盐古 菌科 的第一个 属一一 极 端嗜盐 杆菌 属 （ ｌ ａｔ Ｈａｏ ｃ ｂ ｅ ｒ ｍ）归属 于 假单 胞 菌科 （ ｓｕ ｏ ｏ ａ） 其 典 型种 为 ｉ ， ｕ Ｐ ｅｄ ｍ ｎｓ ， Ｈ．ｓｌ ａ ｕ ａｉ ｒｍ。１７ ｎ ９４年 ， 盐杆 菌科 （ ｌｂｃ ｒ ｃａ） Ｈａ ａｔ ｉ ｅｅ 建 ｏ ｅａ 立 ，９４ １８ 年被 Ｇｉ ｏ ｓ 式列 入《 杰 氏鉴定 细菌 学手 ｂ ｎ正 ｂ 伯
古菌的分离原理与方法
古菌的分离原理与方法古菌是一类特殊的微生物，它们具有原核生物的特点，同时又拥有真核生物的某些特征，因此在生物分类学中被归为一个独立的分类群体。
古菌广泛存在于地球上各种极端环境中，如高温泉、高盐湖、酸性矿渣等，具有很强的适应能力和生存能力。
为了研究古菌的生理特性、基因组结构以及其在环境中的功能，科学家需要从自然界中分离出古菌，接下来我们将介绍古菌的分离原理和方法。
古菌的分离原理主要基于古菌与其他微生物在生理特性上的差异。
古菌的分离方法通常包括样品采集、样品处理、分离培养和纯化培养四个步骤。
样品采集是古菌分离的第一步。
科学家需要选择合适的样品来源，例如高温泉、高盐湖等极端环境中的样品，因为这些环境中古菌的数量相对较多。
样品收集需要注意避免外界污染，可以使用无菌工具采集样品，并储存在无菌容器中。
第二，样品处理是为了减少样品中的杂质和其他微生物的干扰。
通常的方法是将样品进行稀释，然后通过滤膜或离心等手段去除大部分的杂质，得到较为纯净的样品。
第三，分离培养是将样品中的古菌分离出来并进行培养的步骤。
常用的分离培养方法包括平板培养和液体培养。
在平板培养中，科学家将样品平铺在含有适当培养基的琼脂平板上，利用古菌的生长特性形成单个的菌落。
液体培养则是将样品接种到含有适当培养基的培养液中，利用古菌的生长特性使其在液体中繁殖。
纯化培养是为了得到单一的古菌菌株。
在分离培养中，科学家通常会得到多个古菌菌株，为了研究一种特定的古菌，需要将其从其他菌株中纯化出来。
纯化的方法可以通过多次传代分离、单个菌落的划线传代等手段实现。
在古菌分离的过程中，还需要注意一些细节。
首先，古菌的分离需要在无氧或微氧条件下进行，因此在培养过程中需要采取相应的措施。
其次，古菌的分离还需要选择适合的培养基和培养条件，如温度、pH值等，以促进其生长和繁殖。
总结起来，古菌的分离原理和方法主要基于古菌与其他微生物在生理特性上的差异。
通过样品采集、样品处理、分离培养和纯化培养等步骤，科学家可以从自然界中分离出古菌，并获得纯净的古菌菌株。
青海盐湖地区嗜盐菌的分离纯化及抑制植物病原菌的活性初探
青海盐湖地区嗜盐菌的分离纯化及抑制植物病原菌的活性初探沈硕;王舰【摘要】以番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)、菊芋菌核菌(Jerusalem artichoke Sclerotium)、油菜菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、蚕豆根腐菌(Fusarium solani)及豌豆根腐菌(Aphaomyces euteiches Dreehsler)等6种植物病原真菌为供试菌株,采用滤纸片法对植物病原菌提取液的抑菌活性进行了测定.为了获得对这几种植物病原菌具有较高抑制作用的嗜盐菌菌株,对供试菌株进行了液体发酵及发酵液的活性筛选.经滤纸片法测定,青海盐湖嗜盐菌菌株对辣椒疫霉菌具有较强的拮抗作用,并用最小抑制浓度法(MIC)测定了嗜盐菌提取物对辣椒疫霉菌的最小抑菌浓度范围为9～12 mg/mL.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2013(040)001【总页数】4页(P79-81,88)【关键词】嗜盐菌;次级代谢产物;滤纸片法;抑菌活性【作者】沈硕;王舰【作者单位】青海省农林科学院生物技术研究所/青藏高原生物技术教育部重点实验室,青海西宁810016【正文语种】中文【中图分类】S482.2+92盐湖广泛分布于世界各地，是嗜盐微生物高度集中的极端环境。
目前被重点研究的盐湖有美国的大盐湖，肯尼亚的死海和马加迪湖。
我国新疆维吾尔自治区和青海省也有大量的盐湖分布。
研究表明，盐湖中微生物多样性极为丰富，存在着大量高密度的未知微生物资源[1]。
其中，拮抗微生物的生物防治方法近年来日益受到重视。
理论研究方面,人们对嗜盐菌的嗜盐机理尤感兴趣,生存在极端环境中的微生物,通常是通过代谢作用适应其所处生境而得以存活并发挥作用,集中表现在细胞膜、细胞壁结构性成分和功能性成分的稳定性、反应动力学、酶系的性质、代谢途径及信息传递、蛋白质核酸成分及构象等方面为了适应高盐环境而具有的特异性。
浅谈盐湖嗜盐微生物研究——基于期刊论文的分析
浅谈盐湖嗜盐微生物研究——基于期刊论文的分析发布时间：2021-09-02T10:18:04.057Z 来源：《医师在线》2021年21期作者：杨宁高若伊[导读] 嗜盐微生物是一类新型的、极具应用前景和开发潜力的极端微生物资源杨宁高若伊青海大学医学院，青海省西宁市，810001[摘要]：嗜盐微生物是一类新型的、极具应用前景和开发潜力的极端微生物资源，也是研究生命起源、生物进化和生物多样性的重要材料，近年来，我国对于嗜（耐）盐微生物的相关研究正处于起步阶段。
本文将综合讨论介绍近年嗜盐微生物培养、分离、观察所用流程与方法，为以后的嗜（耐）盐微生物研究提供参考方法与理论基础。
[关键词]：盐湖嗜盐微生物，纯化分离，保存，分析高盐环境通常指环境中盐的浓度高于海水，而可以在高盐环境中生存的古菌、细菌等则称为嗜盐微生物[1]，嗜盐微生物以其自身独特的盐胁迫适应机制生存于高盐环境中。
目前，嗜盐微生物对高盐环境的盐胁迫适应机制已研究甚广，而它作为一种应用前景广阔的新型生物资源可在盐腌或盐发酵食品中作为添加剂 [2]，降解石油烃污染物[3]，化妆品制造,利用其耐盐基因创造耐盐植物[4]，制造生物电池[5]等，但其应用探索研究仍处于起步阶段。
因此，对嗜盐微生物的系统鉴定、比较分析可为其资源开发利用奠定基础。
1.嗜盐菌的采集嗜盐菌一般经分离富集获得的泥样、土样、盐卤水、高盐污水等样本得到；采集得到的土样、泥样在进行菌株分离培养时，建议使用无菌低浓度盐水振荡稀释[6]，以便进行下一步操作和保存。
2．嗜盐菌的分离培养2.1嗜盐微生物分类根据嗜盐菌对盐的适应能力的不同提出多种嗜盐微生物分类方法，其中最被广泛接受的是Kushner提出的根据嗜盐菌最适生长NaCl浓度进行分类的方法[7]，见表1。
可根据嗜盐菌对NaCl的适应能力不同进行初步的筛选。
2.2嗜盐微生物常用分离用培养基酪素琼脂培养基[8]、甘油-门冬酰胺琼脂培养基[8]、高氏1号、RM培养基[9]、Gibbons培养基( Segal & Gibbons, 1960)[10]、LB培养基[11]、牛肉膏、碳源利用培养基、细菌培养基础培养基、蛋白酶菌筛选培养基[12]、蛋白酶菌发酵培养基、淀粉酶菌发酵培养基、脂肪酶菌筛选培养基、MNTA培养基[13]、TSA培养基、JCM培养基、GC培养基[14]、CＭ培养基[15]、MG培养基[16]、OSM 培养基(g/L)[17]；2.3嗜盐微生物常用特征观察培养基营养琼脂培养基(Nutrient Agar)、察氏培养基(Czapek's medium)、ISP4、ISP5[18]、ATCC213[19]培养基；PDA培养基[20]、酵母膏-麦芽膏琼脂、ISP3、羽毛粉培养基、人工海水[21]、MGM培养基[22]、富集培养基[23]。
嗜盐微生物的分离及鉴定
嗜盐微生物的分离及鉴定盐度高的环境条件下生长的微生物被称为嗜盐微生物，这种微生物能够在高盐度的环境中生存繁殖，适应各种不同的盐度变化。
嗜盐微生物具有重要的生物学和生态学意义，能够应用于食品加工、药物和化学品的生产等各种领域。
本文将介绍嗜盐微生物的分离和鉴定方法，为相关领域的研究提供参考。
一、分离嗜盐微生物的方法1.挥发性酸法将样品置入含青黛和碳酸氢钠的稳定盐，在适当的温度下培养一段时间，嗜盐微生物会产生挥发性酸，通过气液分离则可分离出嗜盐微生物。
2.筛选法使用高浓度盐水来筛选嗜盐微生物。
将样品加入含有不同浓度盐水的培养基中，一些嗜盐微生物会适应高盐环境，从而形成单一的菌落。
筛选后，从单一的菌落中挑选嗜盐微生物种类。
3.沉淀法在样品中加入一定量的沉淀剂如重铁、三氯化锑等，通过离心等手段可分离出嗜盐微生物。
二、鉴定嗜盐微生物的方法1.生化试验法通过观察基本生物学特征、色素、代谢酶、代谢产物的产生等，辨别嗜盐微生物的种类。
2.遗传试验法通过遗传学方法来鉴定嗜盐微生物的种类，如PCR技术、DNA芯片技术、序列分析技术等，这些技术能快速、准确地确定嗜盐微生物。
3.形态学鉴定法通过显微镜等手段观察细胞形态、胞内结构、分离出的形态等特征，辨明嗜盐微生物的种类。
结论嗜盐微生物的分离和鉴定是研究微生物和应用其资源的重要环节。
不同的分离方法和鉴定方法各有优缺点，在实际应用中需要针对不同的实验目的选择合适的方法。
此外，为了提高鉴定结果的准确性，需要充分利用多种方法进行综合分析，从而更好地开发、利用嗜盐微生物。
盐蒿内生耐(嗜)盐真菌的分离及鉴定
镰 孢属 （ Ｆ ｕ ｓ ａ ｒ ｉ ｕ ｍ） 。 以小球 腔 霉属 （ Ｌ ｅ ｐ ｔ ｏ ｓ ｐ ｈ ａ ｅ ｒ ｉ ａ ） 为优 势属 ， 其 次 为链 格 孢 属 ， 其 分 离频 率 分
２ ０ １ ４年 ８月
陕西理 工学院学报 （ 自然科 学版 ）
Ｊ ｏ ｕ ｎａ ｒ ｌ ｏ ｆ Ｓ ｈ ａ ａ ｎ ｘ ｉ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ（ Ｎ ａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｅ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ）
（ 嗜） 盐真 菌 多样性 的理 想 区域之 一 。
到
饱和 Ｎ ａ 浓度 ， 生长于湖岸 的盐蒿其组织 中 Ｎ ａ 含量 为普 通植物 ６倍 多 ， 该地 区无疑是发掘极 端耐 本文利用不同含盐培养基分离纯化花马盐湖区耐盐植物盐蒿的耐 （ 嗜） 盐真菌， 基 于形态学和 Ｉ Ｔ Ｓ 序列的系统发育关系认识 真菌物种多样性 ， 丰富我 国盐湖真菌菌种资源 ， 为耐（ 嗜） 盐真菌的进一步开
Ａｕｇ ． ２ ０１ ４ Ｖｏ １ ． ３ Ｏ ＮＯ ． ４
第３ Ｏ卷第 ４期
［ 文 章编 号 ］ １ ６ ７ ３— ２ ９ ４ ４ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ４— ０ ０ ５ ５— ０ ６
盐蒿 内生耐 （ 嗜） 盐真菌 的分离及鉴定
亍 小 维
（ 陕西理工学院 生物科学与工程学 院 ， 陕西 汉 中 ７ ２ ３ ０ ０ ０ ）
青海茶卡盐湖中极端嗜盐碱真菌分离的研究
青海茶卡盐湖中极端嗜盐碱真菌分离的研究洒威;焦迎春【摘要】[Objective]The research aimed to separate extreme halophilic and alkaliphilic fungi from the soil samples in Qinghai Chaka Lake.[Method]The spread plate method and streaking were adopted.[Result]Two fungal, five bacteria and three actinomyces were separated. The maximum growth of two fungal was appeared at the first eight days. The halophilic and alkaliphilic of two fungal were studied.[Conclusion] CF12-1 grew at 15% salinity was the extreme halophile. CF12-2 stopped growth at 12% and 15% salinity was the moderate halophile. CF12-1 and CF12-2 grew under pH 10 were the extreme alhallphiles.%[目的]为了从青海茶卡盐湖中分离极端嗜盐碱真菌.[方法]采用平板涂布、划线分离法.[结果]分离得到可培养真菌2株、细菌5株、放线菌3株.2株真菌均在第8天达到最大生长量.同时,对2株真菌的嗜盐碱性进行了研究.[结论] CF12-1在15％盐度时能生长,为极端啫盐菌；CF12-2在12％和15％盐度时停止生长,为中度啫盐菌；CF12-1与CF12-2在pH 10时均能生长,为极端啫碱菌.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(040)035【总页数】3页(P16989-16990,17037)【关键词】青海茶卡盐湖;极端嗜盐碱;真菌;分离【作者】洒威;焦迎春【作者单位】青海大学生态环境工程学院,青海西宁810016;青海大学生态环境工程学院,青海西宁810016【正文语种】中文【中图分类】S273.3茶卡盐湖位于青海省海西蒙古族藏族自治州乌兰县茶卡镇附近，是柴达木盆地有名的天然结晶盐湖，存在大量的石盐盐湖矿床。
新疆两盐湖嗜盐菌生物多样性及嗜盐菌素分离纯化的研究
新疆大学
硕士学位论文
新疆两盐湖嗜盐菌生物多样性及嗜盐菌素分离纯化的研究
姓名：***
申请学位级别：硕士
专业：植物学
指导教师：李冠;吴敏
20070601
新疆大学硕士研究生学位论文
图２ｄＡＪ３５：ＡＢ２酗Ｂ１对ＡＪ．７．０１的抑制效果
Ｆｉｇ．２－１ＴｈｅｉｎｈｉｂｉｔｅｆｆｅｃｔｉｏｎｔｏＡｌ２０１ｆｒｏｍＡＪ３５，ＡＢ２６ａｎｄＡＢｌ．
表２．２的结果表明，极端嗜盐古菌产生的嗜盐菌素的抑菌谱有较大差别，也就是说２２株嗜盐古菌可能产生２２个不同的嗜盐菌素。
在２２株产嗜盐菌素的极端嗜盐古菌中，有３株极端嗜盐古菌（ＨａｌｏｒｕｂｒｕｍＡ１３５，ＮａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＡＢ２６，ＮａｔｒｏｎｏｃｏｃｃｕｓａｉｂｉｅｎｓｉｓＡＢｌ）产生的嗜盐菌素抑菌谱比较广（可抑制＞１１０株嗜盐古菌的活性）。
图２－１所示的是三个不同的嗜盐菌素对指示菌株ＡＪ２０１的抑制效果。
嗜盐菌的分离与生理活性测定
嗜盐菌的分离与生理活性测定张兆轩生命科学学院生物科学 07级 2007300111组员：陈晓文廖永杰指导教师:韩庆国老师【摘要】本实验为基础性创新性实验，以加强学生自主创新为目的，锻炼学生实验操作能力，分离筛选含有蛋白酶活性的细菌。
嗜盐菌作为一类新型的、极具应用前景的微生物资源，近年来受到人们的广泛关注。
但是，目前对嗜盐微生物的分离还远远不够。
因此，分离更多的未知嗜盐菌，包括极端嗜盐古菌和中度嗜盐菌是微生物资源开发的必要前提和关键之一。
在我国存在很多高盐环境，如新疆、内蒙、青海、山东和甘肃都有大面积的盐碱化土壤和许多盐湖。
这些为我们开展嗜盐微生物的分离和系统分类提供了得天独厚的条件。
我们从深圳东角头地区的高盐环境采集到样品，进行嗜盐菌的多种生物学研究。
【关键词】嗜盐菌蛋白酶活性最适盐浓度最适温度【前言】嗜盐菌,又称作副溶血性弧菌。
海水是它的乐园,盐腌的食品又是它栖居之地。
海鱼、海蟹、海贝等海产品，以及不太咸的咸菜、咸蛋、腌鱼、腌肉之类一旦沾上嗜盐菌就会大量繁殖，速度十分惊人。
实验表明，该菌最喜欢含盐量2%—4%的环境，在5%—6%的高盐浓度或营养丰富的低盐浓度都会孽生。
尤其是温度适宜的夏季，10个嗜盐菌在3—4小时后就会育出数百万个后代。
这是一个可怕的天文数字，但人的肉眼和其他感觉器官难以察觉。
嗜盐菌是科学家们在死海中发现的极细小微生物。
科学家们研究嗜盐菌，发现嗜盐菌似乎是修复DNA损伤的高手，研究人员用辐射轰击法破坏嗜盐菌的DNA细胞，使其分裂成碎片，但几个小时后，嗜盐菌又将染色体重新“召集”在一起。
再次恢复正常功能。
科学家们看中嗜盐菌的DNA修复能力，对嗜盐菌进行深入研究，使科学家们探知了更多有关生物技术和癌症的秘密，科学家们还认为嗜盐菌有助于研究和解决：如何让宇航员在太空旅行中，免受宇宙射线伤害的问题。
1 实验器材及材料1.1实验材料深圳东角头海泥1.2实验用品1.2.1富集培养基的配制（g/ L )蛋白胨 7.5；NaCl 150；酵母浸膏 10；MgSO4·7H2O 10；柠檬酸钠 3；KCl 2；FeSO4·7H2O 0.05；pH 7.0 。
极端嗜盐古生菌(Natrinema sp.)R6-5胞外嗜盐蛋白酶的纯化和性质研究
维持高活性和稳定性， 普通的酶在这种条件下会变性而失去 活性。由于嗜盐酶具有这种独特的性质， 因此来自于极端嗜 盐古生菌的酶在高盐或者低水活性的条件下具有非常重要 的应用潜力， 同时也是生物化学和酶学等基础研究的一个令 人感兴趣的材料。 目前虽然有嗜盐古生菌能分泌胞外嗜盐蛋白酶的报道， 但只有少数几种极端嗜盐古生菌的胞外嗜盐蛋白酶被分离
图!
6/78 !
胞外嗜盐蛋白酶活性与 !"#$%&’(" ’() *+,# 生长之
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活性完全没有影响， 在与表面活性剂 FVF 保温处理后仍然保 持较高的活性， 结果表明该蛋白酶能够耐受一定的表面活性 剂和有机溶剂。 表!
［+］ 蛋白酶活力测定
蛋白酶在生命过程中承担重要的使命， 比如胞内非正常 蛋白的清理、 转录因子的调控、 前体的加工、 发育和分化控 制、 调节细胞周期和调亡。此外， 蛋白酶在生物技术和工业 上也有广泛的应用， 比如广泛应用于洗涤剂、 食品、 医药、 制 革、 纺织及废物处理等工业领域
［#］
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酶活性的测定： 将 #:S 的酶液含有 (:G4RS 的 J.04 和 #Y 的偶氮酪素用 %V#:G4RS 3,;?6U04 调节 <U 值为 5V%， 其中含有 于 ("T 反应 (%:;=， 加入 (:G4RS 的 J.04 和 #%::G4RS 的 0.04$ ， 室温放置 #7:;= 后， $%Y 的三氯乙酸终止反应， #$%%%,R:;= 离 心 #%:;= 取上清， 测定上清 )*((7 值。该值与先加入三氯乙 酸使酶失活的对照样品的 )*((7 值差为酶反应的增加值。一 个酶活力单位 （Z） 定义为： 在上述反应条件下， 使反应液上清 )*((7 值每分钟增加 %V%%# 个单位所需要的酶量。 (), (),)( 酶的分离纯化 粗酶液制备： 从平板上挑取单菌落于 7:S 上述液体
定边盐碱土壤嗜盐菌的分离及鉴定
定边盐碱土壤嗜盐菌的分离及鉴定摘要[目的]从陕西定边盐湖高渗极端环境中筛选分离获得嗜盐微生物，并对筛选获得的微生物进行种属鉴定。
[方法]通过高盐选择性培养基平板分离法，从陕西定边盐湖土壤样品中，分离筛选获得极端嗜盐菌株，该菌最适生长温度35 ℃，最适pH值8.0。
通过传统的表型特征（包括形态学观察、生长因子试验、生理生化特征）和系统发育学16S rDNA序列分析鉴定嗜盐菌株的分类学地位。
[结果]获得一株最适生长盐浓度在10%～20%的细菌菌株A426，初步鉴定其为盐单胞菌科（Halomonadaceae）盐单胞菌属（Halomonas）菌株。
[结论]成功获得定边盐湖地区中度嗜盐菌株A426。
关键词嗜盐菌；极端微生物；盐单胞菌；鉴定中图分类号S154.3 文献标识码 A 文章编号1007-5739（2015）20-0157-03Separation and Identification of Halophilic Bacteria in Salinealkaline Soil from DingbianSUN Xiao-Yu CHEN Rui LI Yue LU Peng-peng MEN Xin HAN Li-ping HUANG Ji-hong SHEN Wei-rong *（Microbial Resource Center，Microbiology Institute of Shaanxi，Xi′an Shaanxi 710043）Abstract [Objective] Halophilic bacteria strain was isolated from Dingbian salt lake sample in Shaanxi，and species indentification was studied. [Methods] By high salt selected culture method and gradient dilution isolation method isolate a halophilic bacteria strain from the Dingbian salt lake sample. The optimum growth temperature of it was 35 ℃，the optimum pH value was 8.0.According to the classic phenotypic characteristics which include morphological observation，growth factor and the physiological and bio-chemical characteristics，moderate halophile strain A426 was to be identified. To determine the taxonomy position of the newly isolated moderate halophile bacterium in evolution history，16S rRNA sequence homologous alignment were performed between it and related species.[Results] The strain A426 which could grow optimally in culture media that contain 10%～20% NaCl. The moderate halophile strain A426 was identified to belong to Halomonas sp.[Conclusion] Successfully isolate a moderate halophile strain A426 from Dingbian salt lake.Key words halophilic bacteria；extreme microorganism；Halomonas sp.；identify嗜盐菌是能在高浓度盐环境下生长的微生物[1]，对其分类鉴定主要通过表型特征、生理生化分类及分子生物学分类等方法进行[2]。
一种嗜盐古生菌胞外蛋白酶的分离纯化及其酶学特性研究开题报告
一种嗜盐古生菌胞外蛋白酶的分离纯化及其酶学特
性研究开题报告
题目：一种嗜盐古生菌胞外蛋白酶的分离纯化及其酶学特性研究
研究背景：嗜盐古生菌是一种在高盐环境下生长的微生物，其蛋白酶可分解并降解一种合成各种生物大分子所需的蛋白质。
因此，研究嗜盐古生菌蛋白酶对于探索生物大分子的降解机制具有重要意义。
研究目的：本研究旨在分离纯化一种嗜盐古生菌胞外蛋白酶并对其酶学特性进行深入研究，为探索生物分子降解机制提供基础依据。
研究方法：本研究将从嗜盐古生菌菌株中分离纯化胞外蛋白酶，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blot检测其纯度与酶的种类，利用高效液相色谱（HPLC）和质谱等方法对纯化后的酶进行酶学特性分析，并研究其对底物的降解能力、pH值和温度的适应性等方面的酶学指标。
预期结果：本研究预计可以成功分离纯化一种嗜盐古生菌胞外蛋白酶，从而增进对其酶学特性的理解，为探索生物分子的降解机制提供基础依据。
研究意义：本研究的结果可以为探索嗜盐古生菌的生物降解机制提供重要的理论基础，并可为相关领域的研究提供新思路与依据。
同时，研究也可为相关产业的开发与改进提供一定的参考价值。
古菌的分离培养
古菌的分离培养以古菌的分离培养为标题，本文将介绍古菌分离培养的方法、培养条件以及其在科研和工业中的应用。
古菌属于原核生物中的一类单细胞微生物，生存环境广泛，可以存在于高温、高压、酸碱、高盐等极端条件下。
由于其独特的生物特性，古菌在科研和工业领域中有着广泛的应用价值。
古菌的分离培养是研究古菌的基础工作，其目的是从复杂的环境中分离出纯种古菌菌株，以便进一步研究其生物学特性和应用价值。
下面将介绍古菌分离培养的方法和步骤。
选择合适的样品和培养基。
古菌存在于各种环境中，例如地热泉、海底热液等，因此可以选择这些样品作为分离古菌的来源。
另外，古菌对于培养基的要求也比较特殊，通常需要添加一定浓度的盐类、缺氧环境以及特定的碳源等。
因此，合理选择培养基对于古菌的分离至关重要。
进行样品的处理和分离。
对于复杂样品，可以通过稀释、过滤和分层等方法将古菌与其他微生物分离开来。
然后，将分离得到的样品接种于合适的培养基上，利用适当的温度和pH条件进行培养。
接下来，进行纯种菌株的筛选和鉴定。
通过连续传代培养，可以筛选出生长较快、形态较纯的古菌菌株。
然后，可以通过形态学观察、生理生化指标和分子生物学方法对菌株进行鉴定，确保其为纯种古菌。
古菌分离培养的成功与否取决于培养条件的控制。
古菌对于温度、pH、盐浓度等环境因素有着较高的要求。
一般来说，古菌的最适生长温度在60℃以上，最适生长pH在2-4之间，最适盐浓度在2-4M之间。
因此，在进行古菌分离培养时，需要根据具体菌株的生物学特性来调整培养条件。
古菌在科研和工业中具有广泛的应用价值。
首先，古菌可以产生多种特殊的酶，具有很高的热稳定性和抗酸碱性，因此对于工业生产中的酶催化反应有着重要的应用。
其次，古菌的生物膜具有独特的结构和功能，可以应用于生物传感器、分离膜等领域。
此外，古菌还可以用于环境修复、食品发酵等方面的研究和应用。
古菌的分离培养是研究古菌生物学特性和应用价值的基础工作。
通过合适的方法和培养条件，可以成功分离出纯种古菌菌株，并进一步研究其在科研和工业中的应用。
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极端嗜盐古菌的分离与纯化方法初探陈绍兴1,刘 毅1,谢 昆1,田学军1,谢志雄2(1.红河学院生命科学与技术学院,云南蒙自661100;2.武汉大学生命科学学院,湖北武汉430072)摘要:从一平浪盐矿采集到的一块盐矿石样品中分离到2株极端嗜盐古菌(命名为CY 1和CY 2)。
方法是用嗜盐培养基培养,采用连续传代法和N aC l 浓度(m /V )梯度法分离该样品中的极端嗜盐古菌,结合平板划线纯化得到两株菌种。
对分离得到的菌落进行观察,结果表明已分离纯化得到的这两株菌种为极端嗜盐古菌。
由此,建立了分离纯化极端嗜盐古菌的一套可行的实验方法。
关键词:极端嗜盐古菌;连续传代法;N aC l 浓度(m /V )梯度法;分离;纯化中图分类号:S939.9 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2009)02-0291-02收稿日期:2008-10-30基金项目:红河学院生物化学与分子生物学重点学科建设项目(编号:071010)。
作者简介:陈绍兴(1979)),男,浙江龙游人,硕士研究生,讲师,现从事微生物遗传方向研究。
Te:l (0873)3698575;E -m ai :lshaox i nch en @yahoo .co 。
盐古菌[(Extre mel y haloph ilic arc haea)]通常称为嗜盐菌(H al obacteri a),划分为古菌域(A rchaea )的嗜盐菌目(H al obacteri al es)下的嗜盐菌科(H alobacteriaceae)。
嗜盐古菌一般生长在盐湖、盐碱湖、死海、盐场、海洋以及盐腌制品表面等富盐环境[1]。
其中极端嗜盐古菌在盐浓度15%~30%的介质中能良好生长,最适盐浓度为20%~25%,在饱和盐浓度中也能生长[2],这是一类只能在高盐浓度下才能生长并维持其结构稳定性与完整性的极端环境微生物,属于古生菌域,被称为第三生命形式[3]。
极端嗜盐菌多为圆形小菌落,规则、湿润、有光泽,菌落颜色多样,一般有粉红、桃红、朱红、橙红等色,镜检多为杆状、球状、三角形、方形以及多角形等各种形态[4]。
极端嗜盐古菌由于其特殊的结构特点和理化性质,有广阔的应用前景。
例如在环境生物治理方面用于高盐污水处理[5-7]、盐碱地开发[8-9]等,也应用于生物电子领域[10-11],用于生产PHB (聚B -羟基丁酸)[12]等药物工业[13]。
对极端嗜盐古菌的研究有巨大的潜在价值。
目前极端嗜盐古菌的分离方法主要有:特殊选择培养基筛选法如G i bbons 培养基[5,14-15]和C M 培养基[14,16]、分级稀释平板涂布法[5,16]等。
本研究组利用连续传代法和NaC l 浓度(m /V )梯度法,从云南楚雄一平浪盐矿中分离到2株极端嗜盐古菌,菌株命名为CY1和CY2,现报道如下。
1 材料与方法1.1 样品的来源和处理采集于云南楚雄一平浪盐矿的矿石样品,放入浓度为17.5%的NaC l 溶液中,置于磁力搅拌器(40e ,200r/m i n)上,溶解盐矿石得到样品原液,备用。
1.2 培养基制作嗜盐液体培养基参照文献[17]的方法制备总体积1000m :l 175gN aC,l 37gM gS O 4,3.7g KC ,l 5g Tryptone ,3g Yeastextrac,t 25m l 1mol/L Tri s-HC l(p H 值7.2),5m l10%CaC l 2#2H 2O,17L lM nC l 2。
250m l 三角瓶装入50m l 液体培养基,高压蒸汽灭菌器121e 灭菌15m i n 。
嗜盐固体培养基,每瓶装量50m ,l 添加琼脂粉1g ,经121e 灭菌15m i n ,倒平板,50m l/皿,保存备次日之用。
1.3 极端嗜盐古菌的分离与纯化1.3.1 连续传代法 按1%接种量,将1m l 样品原液接入有嗜盐液体培养基的三角瓶中,于38e 、180r/m i n 摇床培养箱中培养2周,取该菌悬液500L l 以同样条件传代至第2代,同时做平板划线培养。
如此连续传至第5代,直到液体培养基呈橙红色,并且平板上得到橙红色菌落。
1.3.2 NaC l 浓度梯度法 依照O ffner 的嗜盐培养基配方,仅改变N aC l 质量分数(m /V ),分别配制N a C l 浓度为5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%的液体培养基,150m l 三角瓶装量50m ,l 接入1m l 样品原液,于38e 、180r/m i n 摇床培养箱中培养2周。
1.3.3 菌种纯化 将连续传代法和N aC l 浓度梯度培养获得的红色菌悬液平板划线,培养两周,挑取橙红色菌落转移到新鲜嗜盐固体平板上划线培养。
继续平板划线,得到单一菌落。
挑取单菌落,转接到新鲜液体培养基中培养,以获得较纯的极端嗜盐古菌。
2 结果与讨论2.1 N a C l 浓度梯度法分离菌种在较高浓度NaC l 溶液的丰富营养的培养基中,其他微生物由于不能适应很高的渗透压而不能良好生长或生长极其缓慢,而极端嗜盐古菌只能生长较高盐浓度的环境。
因此,利用NaC l 浓度梯度法,不断提高NaC l 的浓度,使极端嗜盐古菌的生长占主导地位。
从培养1周后的观察来看,在NaC l 浓度低于10%时,基本无菌生长(图1-A 、B);NaC l 浓度在15%~30%(2.6~5.1m ol/L)时,极端嗜盐古菌能大量生长,菌悬液逐渐变红,红色渐深(图1-C 、D 、E 、F)。
根据Kushner 等[2]提出的关于嗜盐微生物的划分方法,最适生长盐浓度在2.5~5.2mol/L 范围内的称为极端嗜盐古菌,据此进一步作最适盐浓度测定推断,本样品所分离到的细菌可能为极端嗜盐古菌。
2.2 连续传代法分离菌种通过不断传代培养,逐步淘汰其他微生物,而只有极端嗜)291)江苏农业科学 2009年第2期盐古菌得到较好生长,并富集。
在第1、2、3次传代时,极端嗜盐古菌以及其他少数微生物生长,并且其他微生物逐渐减少,极端嗜盐古菌增多(如图2-a 、b 、c);当传至第4代时,极端嗜盐古菌占主要部分,菌悬液变为红色(如图2-d);当第5次传代以后,菌悬液红色更明显,并且能在接近20%的盐浓度培养基中生长,基本上已经分离到较纯的极端嗜盐古菌(如图2-e)。
2.3 平板划线分离纯化菌种将上述分离所得的极端嗜盐古菌菌悬液平板划线,38e 下倒置培养2周,分离单个菌落。
经过连续多次平板划线,得到两种大小和形态不同的菌落(如图3-A 、B):大菌落直径为2mm ;小菌落直径为0.2mm 。
两种菌落均为橙红色、突起、光滑、边缘整齐。
将图3-B 进行局部放大,如图3-C 所示。
在同样培养条件下,于嗜盐古菌的固体平板上得到两种菌落形态和直径大小有较大差异的橙红色单个菌落,基本可以确定为两种不同的极端嗜盐古菌,暂时把菌落形态较大的命名为CY1、较小的为CY2。
目前对极端嗜盐古菌的分离培养都集中在培养基的制作与改良上,如前所述的G i bbons 培养基以及改良配方[5,14-15]、C M 培养基[5,18],另外还有很多各种配方的嗜盐培养基[19],说明了其分离方法多种多样。
但是培养嗜盐古菌的操作方法较单一,如稀释平板涂布法[5,18]。
然而,对极端嗜盐古菌的分离纯化很少有专门的研究报导。
我们采用连续传代法和N aC l 浓度梯度法富集培养,再结合平板划线,从云南楚雄一平浪盐矿矿石中分离并纯化了两株极端嗜盐古菌,同已报道的现有分离方法相比较,建立了一套从盐矿分离、纯化极端嗜盐古菌的较为系统、有效的分离方法,为研究盐矿中的极端嗜盐古菌种群的生态分布和进一步分离得到在环境生物治理、盐碱地开发、生物电子领域、药物工业等方面有较好应用价值的工程菌株奠定基础。
为更好地开发极端环境的微生物资源提供了有效的分离和纯化手段。
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