第六章_金黄色葡萄球菌的检验
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第六章 金黄色葡萄球菌检 验
雪印牛奶中毒事件
• 人民日报（记者于青 管克江）报导 6月底以来，日本 关西等地区发生特大食品中毒事件，截至6月30日晚间， 因喝下有问题的雪印牌低脂肪牛奶而产生上吐下泻、腹 痛等不适症状的患者人数为4891人，到7月1日中午， 中毒人数已经超过5000人！且受害范围 也由原来的5个行政区域扩大至8个。这是战 后日本发生的规模最大的一起食品中毒事件。 • 7月2日，大阪府公共卫生研究所证实，从患 者饮用剩余的雪印牛奶中检查出了金黄色葡 萄球菌，这种葡萄球菌导致A型肠毒素滋生， 该毒素可造成饮用者腹泻、呕吐及全身不适。 • 牛奶被污染原因何在？
目前，随着研究的深入，一些快速和采用 现代技术的检测方法不断出现，这些新的快速 方法，一般都缩短了传统检测方法的时间，能 够较快地得到检测结果，并且操作相对简单。 比如：法国梅里埃公司生产的RPF培养基 、API检测系统等。梅里埃公司生产的mini VIDAS利用荧光免疫的方法检测葡萄球菌 肠毒素，在仪器上45 min可以得到结果。
金黄色葡萄球菌的显微照片
典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8 mm 左右，显微镜下排列成葡萄串状。
金黄色葡萄球菌革兰氏染色显微照片
金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜
革兰氏染色阳性
金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片 Staphylococcus aureus Enhanced sem w: 7.9 micron
金黄色葡萄球菌的定性检验
检样 增菌（7.5％氯化钠肉汤或
10％氯化钠胰酪胨大豆肉汤）
BP平板，血平板 涂片染色 观察源自文库血
BHI肉汤和营养琼脂 血浆凝固酶实验
报告
金黄色葡萄球菌的检验
1、样品制备 按无菌操作取检样25 g（mL），加入 225 mL灭菌生理盐水，固体样品研磨或置 均质器中制成1:10样品混悬液。 供计数检验时，可按十进位递增稀释法 将样品匀液再进行适当稀释。
一、金黄色葡萄球菌的生物学特性
1、形态与染色：(staphylococcus aureus)
金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，不运动 典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8 mm左右，显 微镜下排列成葡萄串状。 革兰氏染色阳性
附： 金黄色葡萄球菌的显微照片 金黄色葡萄球菌的染色照片 金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片 金黄色葡萄球菌的透射电镜照片
*金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生 问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起 的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%， 加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此 类中毒事件也非常多。肠毒素形成条件： √存放温度，在37℃内，温度越高，产 毒时间越短； √存放地点，通风不良氧分压低易形成 肠毒素； √食物种类，含蛋白质丰富，水分多， 同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。
金黄色葡萄球菌的检验
2、增菌及分离培养 吸取5 mL混悬液，接种于7.5%氯化钠 肉汤或胰酪胨大豆肉汤50 mL培养基内， 36℃±1℃培养24 h，转种血平板和BairdParker平板， 36℃±1℃培养24 h，挑取血 平板上金黄色（有时为白色）菌落进行革 兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。
血平板上金黄色葡萄球菌 菌落形态
法国梅里埃公司生产的RPF培养基
将兔血浆包括在培养基中作为直接确认菌落的手段
-
+
凝固酶阳性葡萄球菌 : 菌落周围形成沉淀圈 (例) 金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌污染的控制 防止食品污染
防止带菌人群对各种食物的污染： 定期对生产加工人员进行健康检查，患 局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等 ）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性 肺炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止 其工作或调换岗位。
金黄色葡萄球球菌的单个菌落在血 平板上呈金黄色，有时也为白色，大而 突出、圆形、不透明、表面光滑，周围 有溶血圈。
溶血圈
金黄色葡萄球菌 在BP平板上的菌落形态
在Baird-Parker琼脂平板上菌落呈圆形，表面光 滑、凸起、湿 润，直径2～3 mm。灰黑色至黑色，有 光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围绕以不透明 圈 （沉淀），其外常有一清晰带。当用接种针触及 菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的 菌株，除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相 同。从长期贮存的冷冻或脱 水食品中分离的菌落， 其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地 较干燥。
金黄色葡萄球菌污染的控制 防止食品污染
防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品 的污染：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳 房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶； 奶挤出后，要迅速冷至-10℃以下，以防 毒素生成、细菌繁殖。奶制品要以消毒 牛奶为原料，注意低温保存。 对肉制品加工厂，患局部化脓感染 的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温 或其他适当方式处理后进行加工生产。
3、生化特性：
可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸 不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。 许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝 酸盐，液化明胶。 金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺 类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏 感。
金黄色葡萄球菌的致病性
金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素 和侵袭性酶： a.溶血毒素：外毒素，分α 、β 、γ 、δ ，能损伤血小板， 破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死； b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液 或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞 的吞噬作用。 葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关； d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶 能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌； e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋 白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E及F六种血清型。
季节分布，多见于春夏季；中毒食品 种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此 外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起 的中毒事件也有报道。
金黄色葡萄球菌的检验
GB4789.10-2010 √第一法：金黄色葡萄球菌的定性检测 √第二法：金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数
√第三法：金黄色葡萄球菌MPN计数
金黄色葡萄球菌的透射电镜照片 Tem x12000 digitized Staphylococcus aureus
2、培养特性：
金黄色葡萄球菌营养 要求不高，在普通培养基 上生长良好，加少量葡萄 糖或血液生长更旺盛。需 氧或兼性厌氧，最适生长 温度37℃，最适生长pH 7.4 金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在7.5～ 15%NaCl肉汤中生长。
金黄色葡萄球菌 在甘露醇盐平板上的菌落
Staphylococcus aureus on mannitol salts agar
3、血浆凝固酶试验：
吸取1:4新鲜兔血浆0.5 mL，放入小试 管中，再加入培养24 h的金黄色葡萄球菌 肉浸液肉汤培养物0.5 mL，振荡摇匀， 置 36±1℃温箱或水浴内，每半小时观察 一次，观察6 h，如呈现凝固,即将试管倒 置或 倾斜时，呈现凝块者，被认为阳性结 果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及 肉汤作为对照。
＊＊＊当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较 多的食品，如牛奶和乳制品、肉、蛋等，在温度条 件适宜时，经过8～10小时即可产生相当数量的肠毒 素，肠毒素可耐受100℃煮沸30分钟而不被破坏。 人摄食该菌污染的食物2～3h后 可引起中毒症状，它引起的食 物中毒症状是呕吐和腹泻。
金黄色葡萄球菌的流行病学特点
防止金黄色葡萄球菌肠毒素生成
应在低温和通风良好的条件下贮藏 食物，以防肠毒素形成； 在气温高的春夏季，食物置冷藏或 通风阴凉地方也不应超过6小时，并且 食用前要彻底加热。
成分：
胰蛋白胨 牛肉膏 酵母膏 丙酮酸钠
卵磷脂环 亚碲酸钾
甘氨酸
氯化锂 卵黄 亚碲酸钾 琼脂
甘氨酸、 氯化锂
BP平板主要成分及作用
• 氯化锂、甘氨酸 抑制非致病性葡萄球菌的生长 • 丙酮酸钠 促进葡萄球菌生长 • 亚碲酸钾 抑制G-杆菌生长，可被金黄色葡萄球菌还原为碲盐呈 黑色 • 卵黄 含蛋白质、卵磷脂、脂肪，提供营养和有利于观察卵 磷脂环
金黄色葡萄球菌肠毒素的检测
一、动物学试验 主要用幼猫和猴。 二、血清学试验 肠毒素作为抗原，可以 和特异性抗体发生结合性反应，产生可见 沉淀。 用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠 毒素，方法主要有： 1.免疫琼脂扩散法 2.反向间接血凝试验 3.免疫荧光法 4.酶联免疫吸附法
金黄色葡萄球菌快速检测方法
雪印牛奶中毒事件
• 人民日报（记者于青 管克江）报导 6月底以来，日本 关西等地区发生特大食品中毒事件，截至6月30日晚间， 因喝下有问题的雪印牌低脂肪牛奶而产生上吐下泻、腹 痛等不适症状的患者人数为4891人，到7月1日中午， 中毒人数已经超过5000人！且受害范围 也由原来的5个行政区域扩大至8个。这是战 后日本发生的规模最大的一起食品中毒事件。 • 7月2日，大阪府公共卫生研究所证实，从患 者饮用剩余的雪印牛奶中检查出了金黄色葡 萄球菌，这种葡萄球菌导致A型肠毒素滋生， 该毒素可造成饮用者腹泻、呕吐及全身不适。 • 牛奶被污染原因何在？
目前，随着研究的深入，一些快速和采用 现代技术的检测方法不断出现，这些新的快速 方法，一般都缩短了传统检测方法的时间，能 够较快地得到检测结果，并且操作相对简单。 比如：法国梅里埃公司生产的RPF培养基 、API检测系统等。梅里埃公司生产的mini VIDAS利用荧光免疫的方法检测葡萄球菌 肠毒素，在仪器上45 min可以得到结果。
金黄色葡萄球菌的显微照片
典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8 mm 左右，显微镜下排列成葡萄串状。
金黄色葡萄球菌革兰氏染色显微照片
金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜
革兰氏染色阳性
金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片 Staphylococcus aureus Enhanced sem w: 7.9 micron
金黄色葡萄球菌的定性检验
检样 增菌（7.5％氯化钠肉汤或
10％氯化钠胰酪胨大豆肉汤）
BP平板，血平板 涂片染色 观察源自文库血
BHI肉汤和营养琼脂 血浆凝固酶实验
报告
金黄色葡萄球菌的检验
1、样品制备 按无菌操作取检样25 g（mL），加入 225 mL灭菌生理盐水，固体样品研磨或置 均质器中制成1:10样品混悬液。 供计数检验时，可按十进位递增稀释法 将样品匀液再进行适当稀释。
一、金黄色葡萄球菌的生物学特性
1、形态与染色：(staphylococcus aureus)
金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，不运动 典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8 mm左右，显 微镜下排列成葡萄串状。 革兰氏染色阳性
附： 金黄色葡萄球菌的显微照片 金黄色葡萄球菌的染色照片 金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片 金黄色葡萄球菌的透射电镜照片
*金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生 问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起 的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%， 加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此 类中毒事件也非常多。肠毒素形成条件： √存放温度，在37℃内，温度越高，产 毒时间越短； √存放地点，通风不良氧分压低易形成 肠毒素； √食物种类，含蛋白质丰富，水分多， 同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。
金黄色葡萄球菌的检验
2、增菌及分离培养 吸取5 mL混悬液，接种于7.5%氯化钠 肉汤或胰酪胨大豆肉汤50 mL培养基内， 36℃±1℃培养24 h，转种血平板和BairdParker平板， 36℃±1℃培养24 h，挑取血 平板上金黄色（有时为白色）菌落进行革 兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。
血平板上金黄色葡萄球菌 菌落形态
法国梅里埃公司生产的RPF培养基
将兔血浆包括在培养基中作为直接确认菌落的手段
-
+
凝固酶阳性葡萄球菌 : 菌落周围形成沉淀圈 (例) 金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌污染的控制 防止食品污染
防止带菌人群对各种食物的污染： 定期对生产加工人员进行健康检查，患 局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等 ）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性 肺炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止 其工作或调换岗位。
金黄色葡萄球球菌的单个菌落在血 平板上呈金黄色，有时也为白色，大而 突出、圆形、不透明、表面光滑，周围 有溶血圈。
溶血圈
金黄色葡萄球菌 在BP平板上的菌落形态
在Baird-Parker琼脂平板上菌落呈圆形，表面光 滑、凸起、湿 润，直径2～3 mm。灰黑色至黑色，有 光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围绕以不透明 圈 （沉淀），其外常有一清晰带。当用接种针触及 菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的 菌株，除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相 同。从长期贮存的冷冻或脱 水食品中分离的菌落， 其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地 较干燥。
金黄色葡萄球菌污染的控制 防止食品污染
防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品 的污染：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳 房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶； 奶挤出后，要迅速冷至-10℃以下，以防 毒素生成、细菌繁殖。奶制品要以消毒 牛奶为原料，注意低温保存。 对肉制品加工厂，患局部化脓感染 的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温 或其他适当方式处理后进行加工生产。
3、生化特性：
可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸 不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。 许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝 酸盐，液化明胶。 金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺 类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏 感。
金黄色葡萄球菌的致病性
金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素 和侵袭性酶： a.溶血毒素：外毒素，分α 、β 、γ 、δ ，能损伤血小板， 破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死； b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液 或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞 的吞噬作用。 葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关； d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶 能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌； e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋 白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E及F六种血清型。
季节分布，多见于春夏季；中毒食品 种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此 外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起 的中毒事件也有报道。
金黄色葡萄球菌的检验
GB4789.10-2010 √第一法：金黄色葡萄球菌的定性检测 √第二法：金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数
√第三法：金黄色葡萄球菌MPN计数
金黄色葡萄球菌的透射电镜照片 Tem x12000 digitized Staphylococcus aureus
2、培养特性：
金黄色葡萄球菌营养 要求不高，在普通培养基 上生长良好，加少量葡萄 糖或血液生长更旺盛。需 氧或兼性厌氧，最适生长 温度37℃，最适生长pH 7.4 金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在7.5～ 15%NaCl肉汤中生长。
金黄色葡萄球菌 在甘露醇盐平板上的菌落
Staphylococcus aureus on mannitol salts agar
3、血浆凝固酶试验：
吸取1:4新鲜兔血浆0.5 mL，放入小试 管中，再加入培养24 h的金黄色葡萄球菌 肉浸液肉汤培养物0.5 mL，振荡摇匀， 置 36±1℃温箱或水浴内，每半小时观察 一次，观察6 h，如呈现凝固,即将试管倒 置或 倾斜时，呈现凝块者，被认为阳性结 果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及 肉汤作为对照。
＊＊＊当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较 多的食品，如牛奶和乳制品、肉、蛋等，在温度条 件适宜时，经过8～10小时即可产生相当数量的肠毒 素，肠毒素可耐受100℃煮沸30分钟而不被破坏。 人摄食该菌污染的食物2～3h后 可引起中毒症状，它引起的食 物中毒症状是呕吐和腹泻。
金黄色葡萄球菌的流行病学特点
防止金黄色葡萄球菌肠毒素生成
应在低温和通风良好的条件下贮藏 食物，以防肠毒素形成； 在气温高的春夏季，食物置冷藏或 通风阴凉地方也不应超过6小时，并且 食用前要彻底加热。
成分：
胰蛋白胨 牛肉膏 酵母膏 丙酮酸钠
卵磷脂环 亚碲酸钾
甘氨酸
氯化锂 卵黄 亚碲酸钾 琼脂
甘氨酸、 氯化锂
BP平板主要成分及作用
• 氯化锂、甘氨酸 抑制非致病性葡萄球菌的生长 • 丙酮酸钠 促进葡萄球菌生长 • 亚碲酸钾 抑制G-杆菌生长，可被金黄色葡萄球菌还原为碲盐呈 黑色 • 卵黄 含蛋白质、卵磷脂、脂肪，提供营养和有利于观察卵 磷脂环
金黄色葡萄球菌肠毒素的检测
一、动物学试验 主要用幼猫和猴。 二、血清学试验 肠毒素作为抗原，可以 和特异性抗体发生结合性反应，产生可见 沉淀。 用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠 毒素，方法主要有： 1.免疫琼脂扩散法 2.反向间接血凝试验 3.免疫荧光法 4.酶联免疫吸附法
金黄色葡萄球菌快速检测方法