生物芯片的基本原理

第二章生物芯片的基本原理§ 2.1 生物芯片的基本概念一般而言，我们所指的芯片是以硅晶体为材料制造的用来存储信息、进行科学计算等用途的半导体器件，如各种计算机芯片。

硅芯片是通过电路高低电平来表示逻辑1或逻辑0，不同的0，1组合可以代表自然界的一切信息，从而方便存储。

生物电子芯片与硅芯片有很大的相似之处。

20世纪70年代，人们发现脱氧核糖核酸（DNA, Deoxyribonucleic acid）处于不同的状态可以代表信息的存在或没有信息。

这一发现引起科学家们的极大兴趣，科学家们立即投身到生物电子元件这一研究领域[1]。

80年代初，国际上提出了“生物芯片”这一概念，形象地把微电子集成电路技术与生物活性分子功能结合，提出构建具有生物活性的能够获取存储信息并进行处理和传输的微生物构件（微功能单元），以达到仿生信息处理的目的。

在此基础上诞生了“分子电子学”。

90年代以来，在美国硅谷又兴起了研究和开发“生物芯片”的热潮[1][2]。

这一“生物芯片”的概念是指运用大规模集成电路的光刻技术以及生物分子的自组装技术，在一微小芯片上组装成千上万个不同生物分子（DNA，蛋白质，多肽，细胞等）微阵列，实现生物分子信息的快速、并行、大规模检测[1][3]。

芯片分析的实质是在面积不大的基片表面上有序地点阵排列了一系列固定于一定位置的可寻址的识别分子。

结合或反应在相同条件下进行。

反应结果用同位素、化学荧光法、化学发光法或酶标法显示，然后用精密的扫描仪或CCD摄像技术记录。

通过计算机软件分析，综合成可读的IC总信息[3][4][5]。

芯片分析实际上也是传感器分析的组合。

芯片点阵中的每一个单元微点都是一个传感器的探头[6]。

所以传感器技术的精髓往往都被应用于芯片的发展。

阵列检测可以大大提高检测效率，减少工作量，增加可比性。

所以芯片技术也是传感器技术的发展。

生物芯片的概念来自计算机芯片，但是到90年代初以后，在人类基因组计划的推动下，才得以迅速发展起来。

由于最初的生物芯片主要目标是用于DNA 序列的测定，基因表达谱鉴定(gene expression profile comparison)和基因突变的检测和分析，所以它又被称为DNA 芯片或基因芯片[1][7]。

但目前这一技术已派生出蛋白质芯片(protein chip)、细胞芯片(cell chip)、药物筛选芯片(drug screening chip)、微缩芯片实验室(lab-on-chip)等多种不同功用的芯片，并已扩展至免疫反应、受体结合等非核酸领域。

所以按现状改称“生物芯片”更能符合发展的趋势。

生物芯片分析的过程一般来说包括图2.1所示的一些步骤。

90年代的生物分析芯片技术是随着人类基因组研究迅速发展起来的。

人类基因组计划的目标是2005年完成对30亿个人体基因组DNA 碱基的序列测定，现在通过使用更高级的毛细管阵列测序仪和商业操作，使该计划有望提前完成。

1999年4月，美国赛莱拉Celera Genomics 公司宣称，他们已经用不同的方法，完成了解读人体遗传密码的工作，现正将它们组合成正确的次序[8]。

2000年6月26日，美、英、法、德、日、中等国科学家一同宣布，人类基因组工作草图已经绘制完成[9]。

随着后基因组时代（post-genome era ）的到来，研究者的工作重心从基因组结构方面的研究转向了基因组功能的研究。

疾病的研究也转向发病机理方面，及向疾病易样品处理 →目标分子富集 →图2.1 生物芯片分析步骤 转录→文库制备增扩→标记数据处理芯片制作→配体点阵及固定化放射显影光 化 学电 化 学活 性酶促反应 ↓综合信息分析检测 洗涤 分子间反应或杂交 → → → ↓感性研究转移。

由于上述所有研究都与庞大的DNA信息以及蛋白质信息密切相关，而要处理和比较如此庞大的数据，应用传统的建立在电泳基础上的基因表达、序列测定、突变和多态性检测等研究方法，如mRNA DD和RDA就显得力不从心，迫切需要全新高效的检测手段。

生物芯片技术于是应运而生，它是微电子技术和生物基因技术相结合的产物[10][11][12][13]。

生物芯片利用微电子和其他一些微细加工工艺，如光学掩模光刻技术(photolithography)、反应离子刻蚀(ion etching)、微注入模塑和聚合膜浇注法等和生物分子自组装技术，把成千上万个不同生物分子集中在一小片基质上，把玻璃、塑料、硅片等不同基质材料上加出用于生物样品制备、反应、检测的微结构。

将生命科学研究中不连续的分析过程，如样品制备、化学反应和定性、定量检测等连续化、微型化，以尽量减少空间，加快速度，实现生物分析系统的微型化和芯片化[14][15]。

上述分析过程中的某一步或几步微型化集成到一块芯片上就能获得具有特殊功能的生物芯片，如用于样品制备的针对DNA分析的细胞过滤器芯片和介电电泳芯片[16][17]；用于基因突变检测和基因表达测序的DNA微阵列芯片[18]；用于药物筛选的高通量微米反应池芯片[13]。

生物芯片发展的最终目标是将从样品制备、化学反应到检测的整个生化分析过程集成化以获得所谓的微型全分析系统(micro total analytical system)或称缩微芯片实验室(laboratory on a chip)。

§2.2 生物芯片的分类生物芯片的形式多种多样。

按基质材料分有尼龙膜、玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等；以检测的生物信号分，有核酸、蛋白质、生物组织碎片等；按工作原理分类，则有杂交型、合成型、连接型、亲和识别型等[3][5]，还有分为被动式生物芯片、电场式主动生物芯片、电磁式生物芯片等[19]。

常用的生物芯片一般分为基因芯片、蛋白质芯片、芯片实验室三大类。

而现在很多都是按其功能分，有以下常用芯片[19] [20][21][22]：样品制备芯片、PCR芯片、毛细管电泳芯片、生物电子芯片、药物筛选芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、疾病诊断芯片（肝炎芯片Hepatitis Chip、白血病芯片Leukemia Chip、肺结核芯片TB chip等）、血气检测芯片、多糖芯片、神经元芯片、芯片实验室等。

§2.3 几种生物芯片的有关进展1、样品制备芯片(sample preparation chip)针对DNA分析，其制备过程通常要经过细胞分离、破胞、脱蛋白等多方面的工作，最后得到纯度足够高的待检DNA[23]。

目前在细胞分离方法上较突出的有过滤分离(根据生物颗粒的尺寸差异进行分离)和介电电泳分离(利用在芯片上所施加的高频非均匀电场使不同的细胞内诱导出偶电极，导致细胞受不同的介电力作用，从而把它们从样品中分离出来)等；芯片中的破胞方法有芯片升温破胞、变压脉冲破胞，以及化学破胞等。

在捕获DNA方面，Cepheid公司应用湿法蚀刻和反应离子蚀刻/等离子蚀刻等工艺在硅片上加工出含有5000个高200微米直径20微米的具有细柱式结构的DNA萃取芯片，专门用于DNA的萃取[24]。

2、PCR芯片(PCR chip)由于目前所用检测仪器的灵敏度还不够高，因此从样品中提取的DNA在标记和应用前仍需用PCR(polymerase chain reaction)这样的扩增复制技术复制几十万乃至上百万个相同的DNA片段[20]。

一般PCR芯片的设计思路如图2.2所示，检测的原理是利用基因扩增及序列确定，可同时进行多项检测，由光纤光谱仪和微机分析能准确、灵敏、快速、可靠地确定其特定序列。

国内南京益来基因医学有Array限公司[25]报道的PCR芯片采用汽浴控温进行PCR反应，并与固相微阵列探针进行杂交，通过对杂交信号的分析得到检测结果。

他们的PCR芯片操作系统采用基因扩增、杂交、结图2.2PCR芯片设计思路果分析一体化，操作简便，只需10几分钟。

基因只需扩增至pg数量级，相应的减少了试剂如Taq酶的用量，且采用二维扫描方式，基因杂交时可不标记。

目前，在芯片中进行核酸扩增反应获得成功的有宾夕法尼亚大学研究小组，美国劳伦斯-利物摩国家实验室和Perkin-Elmer公司[3]。

宾夕法尼亚大学研究小组所做的扩增反应都是在硅－玻璃芯片中进行的，芯片的外部加热和冷却采用的是计算机控制的帕尔帖电-热器。

在对芯片表面进行惰性处理后，亦即在硅片表面生长一层2000埃的氧化硅之后，他们成功地在硅-玻璃芯片中完成了一系列不同的核酸扩增反应，例如RT-PCR、LCR、多重PCR和DOP-PCR。

由劳伦斯-利物摩国家实验室加工的硅芯片所采用的加热方式是芯片内置的薄膜多晶硅加热套，其升降温的速度很快。

Perkin-Elmer公司的PCR反应则是在塑料芯片上完成的。

伦敦帝国理工大学的研究者研制了一种样品可在不同温度的恒温区间内连续流动的PCR芯片。

上述所有工作都是用事先提纯了的DNA或RNA作为扩增反应的底物来完成的[26]。

为了将样品制备和扩增反应集成为一体，宾夕法尼亚大学研究小组最近成功地在坝式微过滤芯片中直接对分离所得的人白细胞通过升温方式胞解后所释放的DNA进行了扩增，这是世界上首例将样品制备和扩增反应集成为一体的研究成果。

3、检测芯片①毛细管电泳芯片(CE chip)[3]毛细管电泳(capillary electrophoresis)是1983年由杜邦公司的Pace开发出来的。

随后，瑞士的Ciba-Geigy公司和加拿大的Alberta大学合作利用玻璃芯片毛细管电泳完成了对寡核苷酸(oligonucleotide)的分离。

首次用芯片毛细管阵列电泳检测DNA突变和对DNA进行测序的工作是由加利福尼亚大学伯格利分校Mathies领导的研究小组完成的。

通过在芯片上加上高压直流电，他们在近两分钟的时间内便完成了从118bp 到1353bp的许多DNA片段的快速分离。

此外，Mathies的小组与劳伦斯-利物摩国家实验室Nothrup的研究小组合作，报道了首例将核酸扩增反应与芯片毛细管电泳集成为一体所作的多重PCR检测工作。

宾夕法尼亚大学Wilding的小组与Ramsey的小组一道用芯片毛细管电泳对芯片中扩增得到的用于杜鑫-贝克肌萎缩诊断的多条DNA片段进行分离也获得了成功。

其他用芯片毛细管电泳检测突变的外国公司和学术机构有Perkin-Elmer公司、Caliper Technologies公司、Aclara Biosciences公司和麻省理工等。

②DNA突变检测芯片(mutation study chip)DNA之所以能进行杂交是因为核苷A和T、G和C可同时以氢键结合互补成对。

许多经典的分子生物学方法如桑格DNA测序法(Sanger sequencing)和PCR等都是以此为基础的。