第10章 现代生物技术的应用

2011/3/11
34
酶工程：
源自文库
酶工程是指利用酶、细胞或细胞器等具有的特异催化功能，借助生物反应装置
将抗生素产生菌的ＤＮＡ部分酶切的２０～４０bp的片段连接到质
粒的表达位点上，转化变青链霉菌，培养，筛选具有抗菌活性转化子
由于抗生素生物合成基因往往成族存在，使得有时可能需要克隆整 套生物合成基因。故此法主要用于基因族相对较小（≤30kb）的抗生素 生物合成基因
10
⑤克隆抗生素抗性基因法
抗生素生物合成基因和抗性基因往往是连锁的，表达也是协同的 （否则菌体本身没有抗性，容易被自身所产生的抗生素杀灭），且抗性 基因一般只有１～２kb，容易检测于克隆
7
②阻断变株法
通过一系列阻断变株的互补结果来确定被克隆DNA片段的性质。即首 先经诱变获得一系列生物合成阻断变株（不能合成抗生素），用互补共 合成法来确定这些变株在生物合成途径中的相互位置。从野生型菌株中
分离DNA，与载体连接后转入阻断变株，以抗生素表型的恢复作指标，克
隆生物合成不同阶段的酶基因
8
20
第二节
基因工程在氨基酸和维生素生产中的应用
21
一、在氨基酸生产中的应用
1.在酶法生产方面，主要通过克隆某些酶系基因来生产氨基酸 如 在L-Trp生产中，利用色氨酸合成酶基因和丝氨酸转羟甲基酶基 因的重组质粒，在E.coli中克隆化;可使L-Trp产量高达9g/L
2.在利用转氨酶反应生产氨基酸方面，将相应的转氨酶基因克隆到工程 菌中
品加工工艺进行改造，降低能耗、提高产率、改善食品品质等。另外，在食品生产
相关领域如食品包装、食品检测等方面，食品生物技术也得到越来越广泛的应用。 所以生物技术在食品领域的应用有着广阔的市场和发展前景。
2011/3/11
27
生物技术： 生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程5个方面。 该技术是应用生物体（微生物、动物细胞、植物细胞）或其组成部分（细胞器、酶）
3、通过基因工程可以改变酶的性质，生产食品结构改良剂 4、基因工程技术还可用于食品工业中新型蛋白质、单细胞蛋白、维生素酶制剂、微
生物多糖、淀粉糖的生产
2011/3/11
30
蛋白质工程:
蛋白质工程是利用X-射线衍射和电子计算机图像显示计算，确定天然蛋白质的
三维构想和活性部位，分析设计需要改造的氨基酸残基，然后采用基因定位突变的
5
2.克隆抗生素生物合成基因的策略和方法
①在标准宿主系统中克隆检测单基因产物 ②阻断变株法 ③突变克隆法 ④直接克隆法
⑤克隆抗生素抗性基因法
⑥寡核苷酸探针法 ⑦同源基因杂交法
6
①在标准宿主系统中克隆检测单基因产物
鸟枪克隆法：这是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方 法(如剪切力、超声波等)或酶化学方法(如限制性内切核酸酶)将生物细胞染 色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合， 将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从 众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。 这种方法也就是应用基因工程技术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基 因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射 击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组中太少太小，在 相当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟枪法”或“散弹 枪”实验法 利用鸟枪克隆法，把抗生素产生菌DNA克隆到最常用的宿主——变青链霉 菌中，通过检测宿主菌中个别基因产物，筛选克隆，从而分离到相应的基因
对溶氧的利用率
2.在抗生素产生菌中引入耐高温的调节基因，或耐热的生物合成基因， 可使发酵温度提高，降低生产成本
19
五、产生杂合抗生素
杂合抗生素：应用遗传重组技术改造菌种，产生新的工程菌，制
备的新型抗菌活性化合物
1.不同抗生素生物合成基因重组 2.生物合成途径中某个酶基因的突变 3.在生物合成途径中引入一个酶基因 4.利用底物特异性不强的酶催化形成新产物
④疫苗：利用基因工程技术将抗原克隆到E.coli或酵母中，用工程菌生产
疫苗，产量高、工艺简单、操作安全
2
第一节 基因工程在抗生素生产中的应用
3
抗生素生物合成并非单一基因的直接产物，而是由初级 代谢产物经过一系列酶催化产生的次级代谢产物，其形成
过程是一个复杂的、多因素调节的过程
传统的提高微生物产生抗生素能力的方法主要是用诱 变剂（如紫外线、化学诱变剂等）处理微生物，获得生产 能力较高的突变株。80年代，人们开始将DNA重组技术应用 于次级代谢产物的生物合成上；通过生物合成酶基因的分 离、质粒的选择、基因重组与转移、宿主表达等方面
先将抗性基因克隆到标准宿主或产生菌的敏感突变株中，再分析与
之紧密连锁的ＤＮＡ，就可能找到生物合成基因；也可利用已经克隆的 抗性基因作为探针，从产生菌基因文库中分离与之同源的并带有生物合
成基因的ＤＮＡ片段
11
⑥寡核苷酸探针法
根据抗生素生物合成酶基因的氨基酸序列，推导出其基因序列，然
后人工合成寡核苷酸，并以此寡核苷酸作为探针，从基因文库中克隆出
免疫动物
动物培养
抽血
分离纯化
冻干保存
有的疾病由于病原微生物具有高度的寄主专一性（如乙肝病毒），只
能感染人及与人亲缘关系近的动物（如黑猩猩），故不能用传统方法制备
基因工程疫苗制备： 寻找病原微生物的致病基因，通过高表达质粒转入相应的宿主，制备 成基因工程菌，然后培养工程菌，表达出相应疫苗
25
二、现代生物技术在食品工业方 面的应用
构和性质非常相似，而其生物活性有时却相差很大
随着对各种抗生素生物合成途径的深入了解及基因重组技术的发 展应用基因工程技术可定向改造抗生素产生菌，获得只产生有效成分
的菌种
18
四、改造抗生素生产工艺
1.抗生素产生菌一般对氧供应较敏感，供氧不足往往是高产发酵的限制 因素。在培养过程中，进入液相培养基的氧分子需穿过几层界膜，进 入菌体后，再经物理扩散，才能到达相应的呼吸细胞器。若在菌体内 导入血红蛋白基因，提高呼吸细胞器对溶氧的亲合力，从而提高细胞
母、酶制剂生产菌的育种多采用细胞工程技术，均得到了非凡的成果，在食用酒精
和食品专用酶的生产中发挥了巨大的效能。
2011/3/11
33
细胞工程的应用：
1、细胞工程育种：在细胞水平上的原生质体制备与融合有利于实现远缘遗传物质的
直接交换，促进遗传资源的创新。
2、细胞培养：利用细胞工程技术生产生物来源的天然食品或天然食品添加剂
1、改善酶性质，提高酶活性和酶耐性
2、创造新型蛋白质
2011/3/11
32
细胞工程：
细胞工程是在细胞水平上改造生物遗传特性和生产性能，以获得特定的细胞、 细胞产品或新生物体的技术，包括细胞融合、细胞培养及细胞核移植等。利用细胞 杂交、 细胞培养等技术可获得遗传性状有所改良的新菌株或动植物细胞、生产食品 添加剂与酶制剂等。典型的是用于味精生产的优良谷氨酸生产菌的育种，继而出现 的必需氨基酸生产菌株的育种都应用到细胞融合技术。如L-苏氨酸和L-赖氨酸均已用 于生产；酱油曲霉菌经细胞融合技术选育后，酱油的品质明显提高。另外，酒精酵
相应的生物合成基因
12
⑦同源基因杂交法
利用一种已经克隆的抗生素生物合成基因片段为探针，探测相关 抗生素同源基因，最后分离及克隆抗生素生物合成基因
13
二、提高抗生素产量
在抗生素生产过程中，获得高产菌株的传统方法是通过诱变育种 得到的；而利用基因工程技术提高抗生素产量应从以下方面着手 1.将抗生素产生菌基因随机克隆到原株直接筛选高产菌株 原理：在克隆菌中，增加某一与产量有关的基因（限速阶段的正性调 节基因）的剂量，使产量提高
22
二、在维生素生产中的应用
简化维生素的发酵工艺 如 Vit.C的传统生产工艺为“两步发酵法”。如今可将第二步发
酵菌株中与发酵生产Vit.C相关的基因转移至第一步菌株中，构建成新
的工程菌株，这样Vit.C的生产过程只需一步发酵即可完成
23
第三节 基因工程在生物制品制造中的应用
24
传统方法制备疫苗：
③突变克隆法
利用整合质粒或噬菌体，将原株DNA转入到抗生素产生菌中。由于 基因有同源性，有可能发生基因重组，一旦某DNA片段的插入干扰了原 株某个生物合成基因的转录，即得到这个生物合成基因的阻断变株，其
相应的DNA片段就是这个阶段的生物合成基因
此法由于要利用噬菌体，因而有一定局限性
9
④直接克隆法
抗生素的杀灭作用；而且有些抗性基因的产物还直接参与抗生素的
合成。抗性基因经常与生物合成基因连锁，是激活生物合成基因进 行转录的必需成分。抗性基因必须先进行转录，建立抗性后，生物
合成基因的转录才能进行。抗生素的生产水平是由抗生素生物合成
酶与对自身抗性的酶所共同确定
17
三、改善抗生素组分
许多抗生素产生菌可以同时产生多种抗生素，这些组分的化学结
4
一、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法
1.抗生素（链霉素）生物合成基因的结构特点
① 链霉菌抗生素生物合成基因组的一个典型特性是G-C碱基组成，
（G+C）%高达70%以上；且三联体密码子中第3个碱基G、C比例极高 ②抗生素生物合成基因大多处于一个基因族中 ③抗生素生物合成基因除定位在染色体上外，有的定位于质粒上
形成基因重组体，然后把重组体引入宿主细胞内或个体中以得到高效表达，最终获 得人们所需要的基因产物，实现动物、植物、微生物等物种之间的基因转移，或
DNA重组，达到食品原料或微生物的改良。
2011/3/11
29
基因工程的应用：
1、优化食品生物资源及食品品质，即食品加工原料的改良
2、改良食品工业菌种，创造新型的工程菌
在最适宜条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术。
微生物 基因工程 蛋白质或酶
工程菌
发酵工程 蛋白质或酶工程 特定产品
细胞工程 动植物个体或细胞
优良品系
2011/3/11
28
基因工程：
基因工程是以分子遗传学为基础，以DNA重组技术（克隆技术）为手段，用人
工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、组合、拼装，
2011/3/11
26
生物技术简介：
生物技术是对生命有机体进行加工改造和利用的技术， 它是2 1世纪高新技术的 核心之一。目前，生物技术已被应用于工农业、食品加工、医疗保健等众多领域中。 而食品生物技术是生物技术的重要分支学科，主要指生物技术在食品工业中的应用， 其作用主要体现在四个方面，一是利用基因工程、细胞工程技术对食品资源的改造 和改良；二是利用发酵工程、酶工程技术将农副原材料加工制成商品，如调味品、 酒类、酸奶等发酵制品；三是利用这些生物技术产品进行二次开发，形成新的产品， 如高果糖浆，食用添加剂等；四是利用酶工艺、发酵技术、生物反应器等对传统食
第十章
现代生物技术的应用
一、利用现代生物技术改造传统制药工业
现代生物技术不仅直接提供IFN、IL、EPO、CSF等基因工程药物，也广 泛用于改造抗生素和生物制品等传统医药工业。主要体现在以下几个方面
①抗生素：可从产生菌中分离出生物合成酶基因，进行克隆，提高生产菌
的生物量，或得到新的杂合抗生素 ②氨基酸：利用生物技术得到基因克隆的生产菌，或采用融合技术提高氨 基酸产量 ③维生素：构建基因工程菌，简化维生素的生产工艺（如Vit C）
方法，修饰或人工合成基因，按照设计改造天然蛋白质或酶，提高其应用价值。蛋 白质工程可以按照人类的需求创造出原来不曾有过、具有不同功能的蛋白质及其新
产品，或生产具有特定氨基酸顺序、高级结构、理化性质和生理功能的新型蛋白质，
可以定向改造酶的性能，生产新型功能性食品。
2011/3/11
31
蛋白质工程的应用：
15
3.通过调节基因的作用
调节基因的作用可增加或降低抗生素的产量，它常常是抗生素生 物合成和自身抗性基因族的组成部分。正性调节基因可加速抗生素的 合成，负性调节基因可降低抗生素的产量。因此，增加正性调节基因 或降低负性调节基因也是增加抗生素产量的方法
16
4.增加抗性基因
抗性基因通过其产物灭活胞内或胞外的抗生素，保护自身免遭
14
2.增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数
抗生素生物合成途径中的某个阶段可能是整个合成中的限速阶段，
识别合成途径中的“限速瓶颈”，并设法导入能提高此阶段酶系的基因
拷贝数；只要增加的中间产物不对合成途径中的某步骤产生负反馈抑制， 就可以增加抗生素的产量。故增加生物合成中限速阶段酶基因剂量有可
能提高抗生素产量