遗传学实验指导

遗传学实验指导

实验须知

一、实验课的目的

1．培养锻炼科学的思维方法，实事求是的科学态度和严格的科学作风，提高分析问题解决问题的能力。

2．通过实验加深对理论知识的理解，学习掌握基本的实验技术和实验技能，为今后学习和研究打下一定的基础。。

3．培养学生爱好公物，爱护集体，团结互助的优良道德品质。

二、实验课要求

1．课前必须预习，了解基本原理和主要步骤及意义，写出预习报告。

2．上课必须穿白大褂，带实验讲义和实验报告纸。

3．遵守实验室制度，注意安全（水、电、暖、强酸、强碱、有毒物质等）。

4．实验中要正规操作，动手动脑主动进行实验；掌握关键，力求得出准确结果；仔细观察，认真思考，及时做好记录；综合分析得出正确的结果。

5．在实验过程中不诉大声喧哗，有问题及时请教老师或同学。

6．器材、药品等按规定使用，严禁乱用乱放。

7．爱护仪器，在实验过程中因个人未能安实验要求操作而导致的器材损坏，按规章制度进行赔偿。

8．实验结束后，相关器材要彻底清洗干净，放到指定原位。

9．废弃物按要求分类收集、处理。

10．值日生要打扫干净实验台、地面，并负责关好门窗、检查水、电等。

11．因故不能上实验者应有请假手续。

实验1 植物染色体压片技术

一、实验原理

植物根尖的分生细胞的有丝分裂，每天都有分裂高峰时间，此时把根尖固定，经过染色和压片，再置放在显微镜下观察，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。

二、实验目的

学习植物材料的固定方法和常规压片技术；观察染色体的动态变化。

三、实验材料

洋葱（Aillum cepa）根尖

四、实验器具和药品

1．用具：染色板，载玻片，盖玻片，指管，温度计，试剂瓶，滴瓶，镊子，解剖针，毛边纸。

2．药品：无水酒精，70%酒精，冰醋酸，对二氯苯或秋水仙素，醋酸钠，碱性品红，石炭酸，甲醛，山梨醇，二甲苯。

a卡诺固定液的配制：用3份无水酒精，加入1份冰醋酸（现配现用）。

b染色液的配制：

配方Ⅰ.石炭酸品红（Carbol.fuchsin），先配母液A和B。

母液A：称取3g碱性品红，溶解于100mL的70%酒精中（此液可长期保存）。

母液B：取母液A 10mL，加入90mL的5%石炭酸水溶液（2周内使用）。

石炭酸品红染色液：取母液B 45mL，加入6mL冰醋酸和6mL 37%的甲醛。此染色液含有较多的甲醛，在植物原生质体培养过程中，观察核分裂比较适宜，后来在此基础上，加以改良的配方Ⅱ，称改良石炭酸品红，可以普遍应用于植物染色体的压片技术。

配方Ⅱ：改良石炭酸品红。取配方Ⅰ石炭酸品红染色液2-10ml，加入

90-98ml45%的醋酸和1.8g山梨醇（sorbitol）。此染色液初配好时颜色较浅，放置二周后，染色能力显著增强，在室温下不产生沉淀而较稳定。

1N Hcl ：浓HCl82.5ml→1000ml

五、实验说明

1．有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织，根尖取材容易，操作和鉴定方便。根尖由于取材方便，是观察植物染色体最常用的材料，有些植物种子难以发芽，或仅有植株而无种子，也可以用茎尖作为材料；

2．植物细胞分裂周期的长短不尽相同，通常在十到几十小时之间，温度明显地影响分裂周期，对于一个不太熟悉的实验材料，最好在特定温度下长根，掌握有丝分裂高峰期，以便得到更多的有丝分裂的细胞。

3．预处理是降低细胞质的粘度，使染色体缩短分散，防止纺锤体形成，让更多的细胞处于分裂中期。预处理的方法有低温预处理和药物预处理。(1)低温预处理将材料浸在蒸馏水中，放在1-4℃冰箱内离体处理24h。此法效果很好，对染色体无破坏作用，染色体缩短均匀，简便易行，各种作物都适用。(2)药物预处理：①0.05-0.2%秋水仙素溶液与室温下处理2-4h，对抑制纺锤体活动效果明显，易获得较多的中期分裂相，且染色体收缩较直，有利于染色体结构的研究。②饱和对二氯苯溶液室温下处理3-5h，对阻止纺锤体活动和缩短染色体效果也较好，但对染色体小而多的植物来说不利于染色体的计数。③0.002-0.00mol/L8-羟基喹啉18℃条件下处理5-6h，可以引起细胞粘度的改变，导致纺锤体活动受阻，使中期染色体在赤道面上保持相应的排列位置。缢痕区也较为清晰。一般认为对中等或长染色体的植物较合适。④70ppm放线菌酮和250ppm8-羟基喹啉的混合液于25℃条件

下，根尖不离体处理5h，可获得大量的分裂相，是最值得首选的预处理方法。

4.固定是将新鲜的活组织从生物体取下后，立即投入固定剂中，借助化学药品的作用，使细胞保持原有形态、结构的一种手段。其目的是：(1)迅速防止细胞死亡后的变化,防止自溶、腐败，尽量保持生长状态结构；(2)使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前的形态；(3)使组织内各种物质成分产生不同的折光率，便于观察和鉴定；(4)使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色；(5)防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。常用的固定液有：酒精、甲醛水溶液、冰醋酸（0.3-0.5 )、AF液（90ml乙醇+10ml甲醛用于固定大块组织）、卡诺氏固定液（冰醋酸:氯仿:无水乙醇=1:3:6）、改良卡诺氏固定液（冰醋酸:无水乙醇=1:3）等。固定液用量：组织块体积的20倍。

5．解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化或部分分解，使细胞和染色体容易分散压平，解离方法有酸解法和酶解法。

（1）酸解法是用盐酸水解根尖，步骤简便、容易掌握，广泛应用于染色体计数、核型分析和染色体畸变的观察。根尖分生组织细胞的染色体还包在细胞壁中间。

（2）酶解法常用于染色体显带技术或姊妹染色单体交换等项研究，通过解离和压片，使分生细胞的原生质体，能够从细胞壁里压出，再经过精心的压片，使染色体周围不带有细胞质或仅有小量细胞质，致使多项制片措施直接作用于染色体。

6.压片时必需掌握以下几点：

⑴压片材料要少，避免细胞紧贴在一起，致使细胞和染色体没有伸展的余地。

⑵用铅笔的橡皮头或小镊子的柄端轻敲盖玻片，使材料均匀分散，然后压片。压片时用力要适当，不要移动盖玻片。

7.染色的原理是染料通过毛细作用或渗透作用进入组织内部；组织吸附染料；染料进入细胞，由于吸收作用而留在细胞内部。染料分为碱性染料（苏木精、卡红、醋酸洋红、碱性品红等）和酸性染料（伊红Y、刚果红、苦味酸、酸性品红）两种，碱性染料染细胞核；酸性染料染细胞质。

六、实验步骤

流程：固定好的根尖→水洗2-3次→1N HCl7-8min→水洗2-3次→取材(1/2分生区)→切碎→染色6-7min→加盖玻片→轻敲→压片→观察。

1．材料准备

将洋葱放在加满水的广口瓶上，使其根茎部接触水面，然后转移到25-28℃的条件下培养。待根尖长到2cm左右使，在上午9-10点剪取根尖备用。

2．预处理

用0.1%或0.02%秋水仙素溶液中，浸泡处理3-4小时。

3．固定

经过前处理的根尖放到卡诺固定液中，固定24小时。转入70%酒精中，在4℃冰箱中保存待用，保存时间最好不超过二个月。

4．解离

酸解：从固定液中取出洋葱根尖，用蒸馏水漂洗，放入1N HCl或酸解液（浓盐酸：95%乙醇=1:1）中，在60℃水浴中，解离8-10分钟，用蒸馏水漂洗后，放在上，加上培养皿中。

5．压片