实验方法总结(2)：细胞实验部分

实验方法总结（2）：细胞生物学部分

1.原代细胞分离与培养 (2)

1.1原代细胞分离 (2)

1.2原代细胞培养 (2)

2. 干细胞分离培养 (3)

2.1胚胎干细胞诱导分化 (3)

2.2肿瘤干细胞（CSC）分离鉴定 (3)

3. 细胞增殖相关研究方法 (5)

3.1 MTT分析法 (5)

3.2 XTT (5)

3.3 WST-1 (6)

3.4 CCK-8(WST-8) (6)

3.4 平板克隆形成 (6)

3.5 软琼脂克隆形成 (7)

3.6 BrdU (7)

4.细胞转移相关研究方法 (8)

4.1 划痕 (8)

4.2 细胞粘附 (8)

4.3 Transwell迁移 (9)

4.4 Transwell侵袭 (9)

5. 血管生成 (10)

6. 细胞周期：PI染色 (10)

7. 细胞凋亡检测 (10)

7.1 AnnexinV/PI双染色法 (10)

7.2 TUNEL法 (11)

7.3 线粒体膜电位(MMP)检测 (12)

8.细胞分选 (12)

8.1 流式分选 (12)

8.2 磁珠珠分选 (13)

9.细胞转染 (13)

10. 细胞慢病毒感染 (14)

11. 基因稳定细胞株的筛选 (14)

12. 耐药细胞株的筛选 (15)

13. 细胞共培养 (15)

13.1直接共培养 (15)

13.2间接共培养 (15)

1.原代细胞分离与培养

1.1原代细胞分离

人或动物体（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来。

第一，悬浮细胞的分离方法

组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10 min。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。

第二，实体组织材料的分离方法

对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。其中，机械分散法的特点是简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差，适用于处理纤维成分少的软组织。而消化分离法是指把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。

1.2原代细胞培养

原代细胞的培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步。

第一，组织块培养法

组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法。其基本方法是将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。

第二，消化培养法

第三，悬浮细胞培养法。

对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分

层液分离后接种培养。

第四，器官培养。

器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养。器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。

2. 干细胞分离培养

2.1胚胎干细胞诱导分化

首先将类胚体消化成单细胞，贴壁培养，于不同的培养阶段添加不同种类和不同浓度的化学物质、条件培养基或细胞因子等诱导条件，直接促进ES细胞定向分化为某种特殊类型的细胞；或通过改变培养条件对某些类型的细胞分化起抑制作用，从而高效诱导目的细胞的分化。改变细胞的培养条件使ES细胞进行定向分化的基本策略有三种：一是向培养基中添加生长因子和化学诱导剂等；二是将ES细胞与其它细胞一起进行培养；三是将细胞接种在适当的底物上，以促使细胞中某些特定基因的表达上调或下降，从而引发细胞沿着某一特定谱系进行分化。

体外诱导胚胎干细胞的物质有化学试剂诱导法、细胞因子诱导法和外源基因诱导法。

化学试剂诱导法：维甲酸（RA）、DMSO、β-磷酸甘油、维生素C(VC)、地塞米松、维生素K3(VK3)以及2，5-羟基维生素D3等化学试剂，都能诱导ES细胞定向分化为特定类型细胞。

细胞因子诱导法：ES细胞在培养过程中对许多细胞因子具有很强的依赖性。增加或减少一种或几种细胞因子可影响ES细胞的增殖或分化。目前研究最深入的细胞因子主要有骨形成蛋白(BMPs)和成纤维细胞生长因子(FGF)等。

外源基因诱导法：转基因法可以弥补细胞因子法的不足。其原理是使某个促分化基因在ES细胞中过度表达，从而调控ES细胞的分化。应用此方法之前，首先要确定决定该细胞向不同方向分化的关键基因，其次还要确保在适宜的时间将此基因正确插入到ES细胞基因组序列上。

2.2肿瘤干细胞（CSC）分离鉴定

对于CSC的分离纯化主要有根据细胞表型特征和生物学特性而建立的两大类方

法：

第一类：依赖于细胞表面标志的分离方法

造血系统肿瘤干细胞：正常造血干细胞的表型为CD34+CD38+Thy-1-

实体瘤肿瘤干细胞：

A.乳腺癌：ESA+CD44+CD24-/LowLineage-的细胞是乳腺癌CSC。

B.脑肿瘤：将CD133+的肿瘤细胞命名为脑肿瘤干细胞(BTSC), 还表达Sox2、

Musashi-1、bmi-1、磷酸丝氨酸磷酸化酶等神经干细胞和其它干细胞的

基因特征

C.结直肠癌：CD133+细胞是结直肠癌细胞的起始细胞。上皮细胞黏附分子、

CD44、CD166可以作为鉴定结直肠癌干细胞的细胞表面标志。

以乳腺癌为例，介绍实验方法（其他肿瘤针对下面蓝色的关键词更改）：

人乳腺肿瘤细胞分离培养：选择XXX医院肿瘤外科接受治疗的乳腺癌患者，经过患者及其家属知情同意，在手术室无菌条件下获取肿瘤组织样本约10g，置无菌组织转移液中，迅速转入无菌实验室，PBS漂洗数遍，去除脂肪及坏死部分，将乳腺组织充分剪碎；将上述乳腺肿瘤组织移入离心管，加入8mL组织消化液（含2700U/mLⅣ型胶原酶1mL、0.02mg/mL透明质酸酶100μL、DNase50μL的DMEM 培养液），轻轻混匀，37℃水浴消化1~2小时，期间每20~30min振摇离心管1次，以便充分消化；消化结束后，加入10mL PBS，摇匀后以1000r/min离心4min，弃上清，加入1mL乳腺肿瘤干细胞培养液（含10mL/L FBS，100U/mL青霉素，100mg/mL链霉素，10ng/mL bFGF，20ng/mL EGF，20ng/mL ITS的DMEM-F12培养液），混匀，1000r/min离心4min，弃上清；以1×106/mL细胞密度接种于细胞

培养箱中培养。3d后换液，约7~10d开始出培养瓶中，置入37℃、50mL/L CO

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现悬浮生长的细胞克隆球。

流式细胞术检测获得乳腺肿瘤细胞：收集培养的乳腺肿瘤细胞克隆球，离心并弃去培养基；PBS漂洗1遍，Accutase消化2min后加等体积培养基终止消化；将细胞悬液移入15mL离心管1000r/min离心4min，弃上清，用PBS溶液混悬后无菌滤膜过滤，取4支试管，按如下组合顺序分别加入荧光标记抗体各10μL：IgG1-PE/IgG2-FITC，CD44-FITC/IgG1-PE，CD24-PE/IgG2-FITC，CD44-FITC/CD24-PE，再加入500μL细胞悬液入试管中，混匀，室温避光静置