重测序ppt20120406
测序PPT
生工Sangon Biotech
α-互补
• 即：携带lacz’基因的质粒编码的α肽链和宿 主编码的N端有缺陷的β半乳糖苷酶突变体 互补，产生完整β半乳糖苷酶的能力——把 X-gal分解成蓝色物质的能力。
生工Sangon Biotech
TA克隆的优点
• 1、不需使用含限制酶序列的引物
• 2、不需要把PCR产物优化 • 3、不需要把PCR产物平末端处理 • 4、不需要把PCR产物加接头
生工Sangon Biotech
克隆测序要求
• 1、PCR以纯化：浓度≥20ng/ul，体积20ul • 2、PCR未纯化：浓度≥50ng/ul，体积25ul • 3、务必订单上注明PCR所用引物序列，以 便用于克隆结果的核对分析 • 4、克隆片段信息：名称、大小、样品是否 带A尾以及PCR产物类型
• 4、质
粒：20ul,浓度>100ng
生工Sangon Biotech
样品处理
• 1、菌液：
过夜培养 质粒提取 鉴定 反应
结果报告
序列分析
上机测序
生工Sangon Biotech
样品处理
• 2、PCR未纯化：
纯 化 鉴定 反 应
结果报告
序列分析
上机测序
生工Sangon Biotech
样品处理
生工Sangon Biotech
样本要求
• 1、甘油菌或穿刺菌：请注明其培养基、抗 生素抗性、载体名称及是否需要诱导等信 息；
• 2、质粒DNA：浓度需≥ 100 ng/μl，总量≥ 1 μg，OD 值介于1.80～2.00 之间，并确保 DNA 没有发生降解。
生工Sangon Biotech
流
挑取克隆、液体 LB培养基培养
第二代测序技术ppt课件
454 (GS-FLX)
▪ Roche：（2005，2007，2008）
▪ 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光 素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的 聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来， 通过检测化学发光信号的有无和强度，达到 实时检测DNA序列的目的。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
454 (GS-FLX)流程
▪ 包水的混合 物，每个独特的片断在自己的微反应器里、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
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SOLiD流程
▪ 4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
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基因组重测序
基因组重测序背景介绍 全基因组重测序，是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。
与已知序列比对，寻找单核苷酸多态性位点（SNP ）、插入缺失位点（InDel ，Insertion/Deletion ）、结构变异位点（SV ，Structure Variation ）位点及拷贝数变化(CNV) 。
可以寻找到大量基因差异，实现遗传进化分析及重要性状候选基因的预测。
涉及临床医药研究、群体遗传学研究、关联分析、进化分析等众多应用领域。
随着测序成本的大幅度降低以及测序效率的数量级提升，全基因组重测序已经成为研究人类疾病及动植物分子育种最为快速有效的方法之一。
利用illumina Hiseq 2000平台，将不同插入片段文库和双末端测序相结合，可以高效地挖掘基因序列差异和结构变异等信息，为客户进行疾病研究、分子育种等提供准确依据。
重测序的两个条件：（1）该物种基因组序列已知；（2）所测序群体之间遗传性差异不大（ >99% 相似度 ）在已经完成的全基因组测序及其基因功能注释的基础上，采用全基因组鸟枪法（WGS ）对DNA 插入片段进行双末端测序。
技术路线生物信息学分析送样要求1.样品总量：每次样品制备需要大于5ug 的样品。
为保证实验质量及延续性，请一次性提供至少20ug的样品。
如需多次制备样品，按照制备次数计算样品总量。
2.样品纯度：OD值260/280应在1.8～2.0 之间；无蛋白质、RNA或肉眼可见杂质污染。
3.样品浓度：不低于50 ng/μL。
4.样品质量：基因组完整、无降解，电泳结果基因组DNA主带应在λ‐Hind III digest 最大条带23 Kb以上且主带清晰，无弥散。
5.样品保存：限选择干粉、酒精、TE buffer或超纯水一种，请在样品信息单中注明。
6.样品运输：样品请置于1.5 ml管中，做好标记，使用封口膜封好；基因组DNA如果用乙醇沉淀，可以常温运输；否则建议使用干冰或冰袋运输，并选择较快的运输方式。
基因组组装和重测序
基因组组装和重测序
基因组组装和重测序是基因组学研究中的两个重要技术。
基因组组装是指将测序得到的 DNA 片段拼接成完整的基因组序列的过程。
这个过程通常需要使用计算机算法和生物信息学工具来处理大量的测序数据，并通过比对和拼接来重建基因组的完整性。
基因组组装可以帮助我们了解基因组的结构、功能和进化等方面的信息。
重测序则是对已经测序过的基因组进行再次测序的过程。
重测序可以用于检测基因组中的变异、突变和单核苷酸多态性等信息，从而深入了解基因组的遗传多样性和进化历史。
重测序还可以用于研究基因组中的基因表达、转录组和表观遗传等方面的信息。
基因组组装和重测序技术的发展为基因组学研究提供了重要的工具和手段。
它们可以帮助我们深入了解基因组的结构和功能，探索物种的进化历史和遗传多样性，以及研究基因组与环境和生物学过程之间的相互作用。
在实际应用中，基因组组装和重测序技术已经被广泛应用于生物医学、农业、环境保护等领域。
例如，在医学领域，基因组组装和重测序可以用于研究疾病的遗传机制、诊断和治疗；在农业领域，它们可以用于研究作物的基因组和遗传改良；在环境保护领域，它们可以用于研究生物多样性和生态系统功能等。
总之，基因组组装和重测序是基因组学研究中的重要技术，它们的发展和应用为我们深入了解生命的奥秘提供了有力的支持。
基因组重测序技术及其应用
测序方法
生信分析流程和内容
第一部分 NGS数据质控
原始数据
质控数据、过滤
比对（有参考基因组 ）
第二部分 变异检测
HiSeq X Ten
10台仪器同时运行时，每周至少可完成320个人类基 因组测序（以30×覆盖度计算），每年完成的数量可 超过18000个。
个人基因组产品
个人基因组的解读-----健康风险
老年痴呆症 银屑病 结肠直肠癌
个人基因组产品
个人基因组的解读-----药物反应
质子泵抑制剂代谢
阿巴卡韦过敏
外显子重测序产品
分析内容
测序数据统计及质量评估 SNP检测及在基因组中的分布 InDel检测及在基因组的分布 孟德尔遗传疾病高级信息分析 癌症的高级信息分析 复杂疾病的高级信息分析
外显子重测序产品
在孟德尔遗传疾病研究应用
第5指综合征（Coffin-Siris syndrome，简称CSS）是一种罕见的先 天性疾病，由于患者父母多为健康个体 ，CSS通常被认为是一种隐性遗传病。 CSS遗传机制的阐明有待于对其致病基 因及突变的鉴定。本研究使用外显子组 测序方法成功的找到了CSS致病基因。
全基因组重测序产品
全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个 体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异 性分析。全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以 找到大量的单核苷酸多态性位点（SNP），插入缺失位 点（InDel，Insertion/Deletion）、结构变异位点（SV ，Structure Variation）位点。
重亚硫酸盐测序技术介绍PPT课件
未来重亚硫酸盐测序技术将进一步优化测序精度，降低测序错误率， 提高数据分析的可靠性。
测序成本不断降低
随着技术的成熟和规模化生产，重亚硫酸盐测序技术的成本将逐渐 降低，使得更多人能够享受到基因测序的益处。
在生物医药领域的应用前景
疾病诊断与预测
重亚硫酸盐测序技术可用于检测与特定疾病相关的基因变 异，从而为疾病的早期诊断和预测提供依据。
其他应用领域
进化生物学研究
利用重亚硫酸盐测序技术，可以对不同物种的基因组 进行比较分析，研究物种进化关系和演化历程。
药物研发
通过重亚硫酸盐测序技术，可以对药物作用靶点进行 精准定位，为新药研发提供有力支持。
生物多样性研究
利用重亚硫酸盐测序技术，可以研究生物多样性，包 括物种分类、种群结构等。
03
比较与选择
重亚硫酸盐测序技术
在DNA序列分析中，重亚硫酸盐测序技术是一种基于连接反应和重亚硫酸盐转化的序列 特异性扩增技术。它具有高灵敏度、高特异性和可检测突变丰度的优点，因此在基因突变 筛查、基因分型和突变体鉴定等领域具有广泛的应用价值。
与其他测序技术的比较
与第二代测序技术相比，重亚硫酸盐测序技术的通量更高，能够检测低丰度的突变；与第 三代测序技术相比，重亚硫酸盐测序技术的准确性更高，适用于对准确性要求较高的应用 。
代表性技术
基于PCR扩增和光学检测的Sanger测序法。
特点
准确性高，但通量低，测序长度短，主要用于完成人类基因组计划等基础研究。
第三代测序技术
代表性技术
基于纳米孔的单分子测序技术（如PacBio RS II）和合成式测序技术（如Illumina MiSeq）。
特点
高通量、长读长，但准确性相对较低，主要用于临床诊断、基因组组装和基因表达分析 等应用。
测序技术.ppt
（一）随机测序法
随机测序法（random approach）包括鸟枪法与人 工转座子法。其共同特点是无特定方向性，随机 对靶DNA进行测序，最后通过计算机拼装而得到完 整的序列信息。
（二）非凝胶基质毛细管电泳
为了避免CGE存在的问题，非凝胶基质毛细管电 泳用于DNA分析的研究越来越多，常见的有线性 聚丙烯酰胺和纤维素衍生物等非凝胶基质，这些 非凝胶基质在DNA测序中可以更换，使毛细管的 寿命延迟，在优化条件下可获得高效及高速的分 离效果。
（三）阵列毛细管电泳
阵 列 毛 细 管 电 泳 （ Capillary array electrophoresis, CAE）是将毛细管电泳与板凝 胶电泳的优势相结合，采用毛细管凝胶电泳的装 置，将多支毛细管进行并列进行分离与检测，以 板凝胶电泳的优势弥补了毛细管凝胶电泳的不足， 可一次检测多个样品。
人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的 科学工程，它奠定了21世纪生命科学发展和现代 医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大 意义和商业上的巨大价值。
经典方法 新技术方法
Sanger双脱氧链终止法(Sanger和 Coulson1977) Maxam-Gilbert DNA化学降解法 (Maxam 和Gilbert,1977)
通用引物的长度一般为15～30个核苷酸。
（三）DNA聚合酶
1．大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段） Klenow片段酶是Sanger法最早使用的DNA聚合
酶，具有5′→3′聚合酶和3′ → 5′外切酶 活性，但它催化链延伸反应的能力较差，用它 进行测序常产生较高的本底测序技术
重测序分析简介
重测序参考手册目录目录 (1)1. 重测序简介 (3)2. 重测序实验方法 (3)基因组DNA抽提 (3)基因组DNA样品建库 (3)上机前定量 (4)3. 重测序分析内容 (4)重测序分析流程 (5)重测序分析内容 (5)4. 重测序重要技术参数 (6)5. 重测序分析内容解释 (6)6. 重测序分析内容示例 (6)SNP、INDEL的样本差异分析 (12)7. 成功分析案例/或已发表论文 (14)8. 概念及常用工具链接 (14)1. 重测序简介全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位点（SNP），插入缺失位点（InDel，Insertion/Deletion）、结构变异位点（SV，Structure Variation）位点。
众信可以协助客户，通过生物信息手段，分析不同个体基因组间的结构差异，同时完成注释。
2. 重测序实验方法提取基因组DNA，利用Covaris进行随机打断，电泳回收所需长度的DNA片段（0.2~5Kb），加上接头, 进行cluster制备（Solexa）或E-PCR （SOLiD），最后利用Paired-End或者Mate-Pair的方法对插入片段进行重测序。
实验步骤主要包括以下几点：基因组DNA抽提不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。
在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。
尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。
基因组DNA样品建库这是样品准备过程中最主要的环节，也就是真正意义上的建库（通常我们所说的建库包括整个样品准备的过程）。
重测序
全基因组重测序项目简介全基因组重测序是对已有参考序列（Reference Sequence）的物种的不同个体进行基因组测序，并以此为基础进行个体或群体水平的差异性分析。
通过这种方法，可以寻找出大量的单核苷酸多态性位点（SNP），插入缺失位点（InDel，Insertion Deletion），结构变异位点（SV，Structure Variation），拷贝数变异（Copy Number Variation，CNV）等变异信息，从而获得生物群体的遗传特征。
这对在群体水平上研究物种的进化历史、环境适应性、自然选择等方面具有重大意义。
利用全基因组重测序有助于快速发现与动植物重要性状相关的遗传变异，缩短分子育种的实验周期；有助于发现人类疾病相关的重要变异基因，加快生物医药研发的速度等，这对人类疾病及动植物育种研究等方面具有重大的指导意义。
技术流程提取基因组DNA后，采用物理方法随机打断，选择性回收所需长度的DNA片段（0.2~5Kb），并在两端连接接头以构建测序文库，进行桥式PCR（Bridge Amplification）制备Cluster，最后利用Paired-End的方法对插入片段进行重测序。
生物信息分析1．数据量产出总碱基数量、Totally mapped reads、Uniquely mapped reads统计，测序深度分析。
2．一致性序列组装与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。
3．SNP检测及在基因组中的分布提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。
并根据参考基因组序列对检测到的变异进行注释。
4．InDel检测及在基因组的分布在进行mapping的过程中，进行容Gap的比对并检测可信的Short InDel。
全基因组重测序
Small INDEL检测
step1：将reads不允许indel的方式比对到参考基因组上 Step2：对于比对过程产生大量mismatch的比对序列进行重新进行允许indel比对 Step3：确定其中能够确定的Indel位点，并根据测序reads的深度进行判定纯和和
杂合 Step4：对SNP位点和Indel位点进行筛选和过滤
以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记 是 DNA 水平遗传多态性的直接反映 能直接反映生物个体或种群间基因组DNA间的差异
1. 直接以DNA的形式表现，不受组织、发育阶段、季节、环境等 因素的限制，不存在表达与否等问题，表现稳定
2. 数量极多，遍布整个基因组 3. 多态性高，自然界存在许多等位变异 4. 许多标记表现为共显性的特点，能区别显性纯合体和杂合体，
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比对原理
将基因组拆分为若干个具有互相overlap的片段—index Reads与已经拆分好的片段进行比对，找到最优的比对位置 DNA 使用BWA RNA或chip-seq使用Bowtie 比对效率：比对到基因组上的reads/所有参与比对分析的reads
变异检测
两个基本特征：可遗传性和可识别性 某种生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。
形态标记
• 株高、穗形、粒色或芒毛等外部形态特征的 相对差异。
细胞学标记 • 染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、 着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等） 的变化。
生化标记 • 基因表达产物——同工酶、等位酶等的差异。
样品间差异SNP
概念：若某一SNP位点在样品间存在不一致的基因型，则认为是样品间差异的 SNP。
检测原理：比较同一SNP位点上各样品基因型是否完全一致。
基因测序-ppt课件
Flowcell实物图 8
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
第二部分
Flowcell表面微观示意图
每个泳道(LaP5接头)。这两种接头与泳道表面共价连接。
边合成边测序（来源：illumina官网）
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为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
第二部分
Ion Torrent PGM半导体测序
芯片就是测序仪，4种dNTP依次流过半导体芯片PCRDNA聚合产生的氢离子直接检测，每 个碱基只需数秒
美国Illumina 公司的基因组测序仪（genome analyzer，GA）
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为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
第二部分
Flowcell
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
第二部分
SBS测序
特异荧光标记的4种dNTP，3’-OH叠氮基团被保护，每次只能添加一个dNTP，这就确保了在测序 过程中，一次只会被添加一个碱基，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。
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为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
第三部分
Oxford Nanopore纳米孔单分子技术
重测序
全基因组重测序项目简介全基因组重测序是对已有参考序列（Reference Sequence）的物种的不同个体进行基因组测序，并以此为基础进行个体或群体水平的差异性分析。
通过这种方法，可以寻找出大量的单核苷酸多态性位点（SNP），插入缺失位点（InDel，Insertion Deletion），结构变异位点（SV，Structure Variation），拷贝数变异（Copy Number Variation，CNV）等变异信息，从而获得生物群体的遗传特征。
这对在群体水平上研究物种的进化历史、环境适应性、自然选择等方面具有重大意义。
利用全基因组重测序有助于快速发现与动植物重要性状相关的遗传变异，缩短分子育种的实验周期；有助于发现人类疾病相关的重要变异基因，加快生物医药研发的速度等，这对人类疾病及动植物育种研究等方面具有重大的指导意义。
技术流程提取基因组DNA后，采用物理方法随机打断，选择性回收所需长度的DNA片段（0.2~5Kb），并在两端连接接头以构建测序文库，进行桥式PCR（Bridge Amplification）制备Cluster，最后利用Paired-End的方法对插入片段进行重测序。
生物信息分析1．数据量产出总碱基数量、Totally mapped reads、Uniquely mapped reads统计，测序深度分析。
2．一致性序列组装与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。
3．SNP检测及在基因组中的分布提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。
并根据参考基因组序列对检测到的变异进行注释。
4．InDel检测及在基因组的分布在进行mapping的过程中，进行容Gap的比对并检测可信的Short InDel。
基因重测序技术
基因重测序技术嘿，咱今儿个就来说说这基因重测序技术！你知道吗，这玩意儿就像是给基因做了一次超级详细的“普查”。
想象一下，基因就像是我们身体这个大王国里的神秘密码本，它决定了我们的各种特征和潜在的健康问题。
而基因重测序技术呢，就是那个厉害的解密高手，能把这些密码一个一个地解读清楚。
以前啊，我们对基因的了解就像是在大雾中摸索，模模糊糊的。
但有了基因重测序技术，那可就不一样啦！它就像一束强光，一下子把迷雾驱散，让我们能清楚地看到基因的真面目。
它能帮助医生更准确地诊断疾病呢！比如说，有些疾病的原因很复杂，常规的检查可能找不到头绪。
但通过基因重测序，说不定就能发现隐藏在基因里的秘密，找到疾病的根源，这多厉害呀！就好像是在茫茫人海中一下子找到了那个关键人物。
而且哦，它对治疗也有很大的帮助呢！医生可以根据基因的情况，制定更个性化的治疗方案。
这就好比是量体裁衣，每个人的基因不一样，治疗方法也得不一样，这样才能达到最好的效果呀！这基因重测序技术还能在预防疾病方面发挥大作用呢！通过检测基因，我们可以提前知道自己有没有患某些疾病的风险。
这就像是提前知道了天气预报，我们可以提前做好准备，采取一些预防措施，降低患病的可能性。
这多牛啊！当然啦，这项技术也不是完美无缺的。
它也有它的挑战和难题呢！比如说，成本还是比较高的，不是每个人都能轻易承受得起。
而且解读基因数据也不是一件容易的事儿，需要专业的人才和先进的设备。
但咱不能因为这些就否定它的厉害呀！随着科技的不断进步，基因重测序技术肯定会越来越成熟，成本也会慢慢降低。
到时候，说不定每个人都能做一次基因检测，更好地了解自己的身体呢！总之呢，基因重测序技术就像是一把神奇的钥匙，打开了我们了解基因的大门。
它让我们对生命的奥秘有了更深的认识，也为医疗领域带来了新的希望和可能。
咱可得好好期待着它未来的发展呀，说不定它能给我们带来更多的惊喜呢！你说是不是？。
基因组重测序技术
基因组重测序技术
嘿，朋友们！今天咱来唠唠这个基因组重测序技术呀！你说这玩意儿可神奇了，就好像是给生命的密码本来了个大揭秘。
想象一下，我们的基因组就像是一本超级厚的大书，里面记载着我们身体的各种秘密和信息。
而基因组重测序技术呢，就是那个能让我们一页一页仔细去读这本书的厉害工具。
它能帮我们发现好多以前不知道的事儿呢！比如说，有些疾病为啥会发生在某些人身上呀，也许通过这个技术就能找到答案。
就好像你家里的电器坏了，你得找到那个出问题的零件一样，基因组重测序技术能帮我们找到生命这本书里出问题的地方。
而且啊，这技术还能让我们更了解自己的家族病史呢！你想想，要是能知道自己的祖辈们可能有哪些健康问题，那我们不就能提前做好准备，更好地照顾自己了嘛。
这就好比你知道前方路上有个坑，你就能提前绕过去，免得掉进去啦！
这技术对于医学研究那也是相当重要啊！医生们可以通过它来研究各种疾病的根源，然后想办法去治疗。
这不就像是给医生们配备了一个超级放大镜，让他们能更清楚地看到疾病的本质嘛。
再说了，它对农业也有很大的帮助呢！可以让农作物长得更好，更健康。
就好像给农作物也来了一次全面的体检和优化，让它们结出更多更好的果实。
哎呀，这基因组重测序技术可真是个宝啊！它让我们对生命有了更深的理解和认识。
我们可以利用它来让我们的生活变得更美好，更健康。
难道不是吗？它就像是一把钥匙，打开了我们了解生命奥秘的大门。
所以啊，朋友们，可别小看了这个技术哦！它可是在默默地为我们的生活带来很多改变呢。
让我们一起期待它能给我们带来更多的惊喜和发现吧！。
基因组重测序
基因组重测序基因组重测序背景介绍全基因组重测序，是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。
与已知序列比对，寻找单核苷酸多态性位点（SNP ）、插入缺失位点（InDel ，Insertion/Deletion ）、结构变异位点（SV ，Structure Variation ）位点及拷贝数变化(CNV) 。
可以寻找到大量基因差异，实现遗传进化分析及重要性状候选基因的预测。
涉及临床医药研究、群体遗传学研究、关联分析、进化分析等众多应用领域。
随着测序成本的大幅度降低以及测序效率的数量级提升，全基因组重测序已经成为研究人类疾病及动植物分子育种最为快速有效的方法之一。
利用illumina Hiseq 2000平台，将不同插入片段文库和双末端测序相结合，可以高效地挖掘基因序列差异和结构变异等信息，为客户进行疾病研究、分子育种等提供准确依据。
重测序的两个条件：（1）该物种基因组序列已知；（2）所测序群体之间遗传性差异不大（ >99% 相似度）在已经完成的全基因组测序及其基因功能注释的基础上，采用全基因组鸟枪法（WGS ）对DNA 插入片段进行双末端测序。
技术路线生物信息学分析送样要求1.样品总量：每次样品制备需要大于5ug 的样品。
为保证实验质量及延续性，请一次性提供至少20ug的样品。
如需多次制备样品，按照制备次数计算样品总量。
2.样品纯度：OD值260/280应在1.8～2.0 之间；无蛋白质、RNA或肉眼可见杂质污染。
3.样品浓度：不低于50 ng/μL。
4.样品质量：基因组完整、无降解，电泳结果基因组DNA主带应在λ‐Hind III digest 最大条带23 Kb以上且主带清晰，无弥散。
5.样品保存：限选择干粉、酒精、TE buffer或超纯水一种，请在样品信息单中注明。
6.样品运输：样品请置于1.5 ml管中，做好标记，使用封口膜封好；基因组DNA如果用乙醇沉淀，可以常温运输；否则建议使用干冰或冰袋运输，并选择较快的运输方式。
最新整理基于全基因组重测序的基因定位研究.ppt
技术路线
3个与性状连锁的QTL区域
两个表型差异的亲本及F2子代
侧鳞完整混池（60） 侧鳞缺失混池（31）建库
高通量测序 亲本多态性变异位点检测
子代基因型分析 与表型进行关联分析
案例二 BSA快速定位水稻基因
QTL-seq：在分离群体中，对表现出极端相反表型 的二组材料进行基因组重测序来快速鉴定性状相关 的QTLs。
混合分组分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA）
又称分离体分组混合分析法或集团分离分析法，生物信息 学中用于QTL或基因定位的一种分析方法。
将目标性状在F2或 BC代中表型极端的高、低两组个体的 DNA分别混合成两个 DNA 池，然后利用分子标记在两池中 进行标记与性状间的共分离分析，检测QTL。
QTL-seq技术流程图
RILs群体中QTL-seq的应用
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2、目标性状未初定位
有些性状没有经过初定位，就需要 在测序完成后在全基因组范围内寻找变 异序列，这种情况下可以增加对照物种 的数量来消除遗传背景的干扰，排除掉 那些常规与性状无关的变异。
候选材料 （10个/性状） 测序5X/样本 参考基因组序列
全基因组变异区域 性状关联
多样本排除背景差异
候选基因
二、混合分组分析法挖掘性状相关基因
实验材料：
一、三刺鱼
两个存在较大表型差异的三刺鱼亲本进行了杂交，构建由96个个体组成 的F2分离群体。侧鳞完整个体60个，侧鳞缺失个体31个；大腹鳍个体67 个，小腹鳍个体29个。
二、粗糙链孢菌
通过诱变，从原生型菌株N2977中获得突变株AX7。将AX7与另一个品种 的菌株N32杂交，构建F2群体。最终分离出28个突变表型后代，24个野 生型后代，将这同种表型的个体混合，构建两个DNA池。
基因组重测序
基因组重测序
基因组重测序（Genome Resequencing）是一种研究族群遗传学和物种进化过程的常用分析方法，它包括对个体或物种基因组的重新测序，以及对基因组的遗传变异的进一步探讨。
基因组重测序可以用来研究物种进化，筛选便利性基因以及鉴定和分析基因组变异。
一、优势
1、基因组重测序的比较优势：重测序比利用芯片进行平面分析方法更加灵活。
能够快速鉴定多种类型的遗传变异，包括插入、缺失、临时变异，以及双倍体变异等。
2、复杂性大：由于重测序可以精细分析基因组中的染色体，因此可以更好地捕捉基因组变异的复杂性。
3、高效性：仪器分析周期短，该技术可以高效地获得基因组芯片和组装基因组变异的信息。
二、应用
1、种群遗传研究：基因组重测序能够针对个体或物种基因组的群体变异和单倍型进行分析，以发现先前未被准确定位的遗传标记和位点，有助于预测物种进入新环境时适应性和抗病性方面的变异。
2、育种研究：基因组重测序可以鉴定出品质和适应性相关的基因和位点，有助于精准育种。
3、公共健康：基因组重测序可以确定某种疾病的发病形态，有助于进
一步深入认识疾病的发生机理以及发病的根源，从而促进公共健康的发展。
三、前景
在未来，基因组重测序技术将会被广泛应用于基因组学中，例如用于进化生物学和疾病基因组学研究，它也可用于转基因技术和育种。
同时也会继续发展新的基因组重测序技术，更新、完善重测序技术，为科学家和科技工作者提供更多先进的应用技术。
《重亚硫酸盐测序技术介绍》PPT课件
CpG岛的甲基化
CpG岛经常出现在真核生物的 house-keeping基因的调控区，在其 它地方出现时会由于CpG中的C易 被甲基化而形成5'-甲基胞嘧啶，脱 氨基后形成胸腺嘧啶，由于T本身在基因 组中是以岛的形式分布的。
基本原理
重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱 氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变， 行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲 基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成 胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未 经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。 此方法一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目 的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。在寻找有 意义的关键性CpG位点上，有其他方法无法比拟的 优点。
重亚硫酸氢盐直接测序技术的优缺点
优点：测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序 列为引物配对区，能够同时扩增出甲基化和非甲 基化靶序列。
缺点：它的不足是耗费时间和耗资过多，至少要 测序10个以上的克隆才能获得可靠数据，需要大 量的克隆及质粒提取测序，过程较为繁琐、昂贵。 在甲基化变异细胞占少数的混杂的样品中，由于 所用链特异性PCR不是特异扩增变异靶序列，故 灵敏度较MSP差。
重亚硫酸直接测序法对启动子测序 的应用
CpG岛不仅是基因的一种标志，而且还参 与基因表达的调控和影响染色质的结构。 启动子的甲基化能抑制基因的表达。
研究证明启动子区的高甲基化导致抑癌基 因失活是人类肿瘤所具有的共同特征之一， 而且这种高甲基化是导致抑癌基因失活的 又一个机制。
酶切法同亚硫酸氢盐联合法
酶切法：限制性酶切后选用对特 异DNA片段甲 基化序列敏感的限制性内切酶(酶 切位点与甲基 化位点不重叠)进行酶切后，以待测 甲基化位点 外侧序列为扩增起始点进行PCR。该 DNA片段 若存在甲基化，将会有扩增产物出现；若 无甲 基化，则不会有任何片段扩增出现。当用甲基 化不敏感的内切酶消化产物作为PCR模板时，不 论 该部位是否甲基化都不应有片段扩出。PCR 法比 Southem法更为敏感，但只能检测甲基化敏 感的限 制性位点的CpG甲基化，且DNA必须酶 切完全，否 则会出现假阳性。
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反转(Inversion)
成对reads比对到基因组上应该是一条正向，一条 反向互补。但结果两条reads都正向或反向互补比 对到参考基因组上
移码突变
• 在正常的DNA分子中，碱基缺失或增加非3 的倍数，造成这位置之后的一系列编码发
生移位错误的改变，这种现象称为移码突
变。
移码突变
多态性分布与差异分析
碱基平均测序深度
1 2 3 4 5 10 15
基因组未覆盖率
3.68E-01 1.35E-01 4.98E-02 1.83E-02 6.74E-03 4.54E-05 3.06E-07
基因组覆盖率
63.21% 86.47% 95.02% 98.17% 99.33% 100% 100%
测序深度与覆盖度
9
10
0
0
0x0200 the read fails platform/vendor quality checks
转为二进制后，以上各位代表含义均为0无据
比对
深度、覆盖度 SNP检测 SV检测
统计与注释
通过深度、质量值等筛选 得到可靠结果
重测序分析流程图
SAMtools
三、基因组重测序的发展
• 2008年4月17日的 Nature 杂志上，美国的科学家 发表了首个利用新一代 高通量测序技术得到的 人类全基因组， 这个基 因组正是“ DNA之父” James D.Watson的 。
2013/1/13
三、基因组重测序的发展
大豆重测序
水稻重测序
第一部分 基因组重测序概况 第二部分 重测序分析原理及内容
颠换
参考基因组上的碱基为G，但实际在物种中测得的为A,该位 点突变类型为颠换，且为纯合。
同义与非同义突变
• 同义突变： synonymous mutation，由于生物的遗 传密码子存在简并现象，密码子的核苷酸发生改 变后，所编码的氨基酸种类保持不变。 • 非同义突变： nonsynonymous mutation ，密码子 的核苷酸发生改变后导致编码的氨基酸改变。 • 一般认为，同义突变不受自然选择，而非同义突 变则受到自然选择作用。在进化分析中，了解同 义突变和非同义突变发生的速率是很有意义的。
Flag示例
• 如99：1100011
– 第1位为1：Pair-end – 第2位为1：比对合适位置 – 第3位为0：这条序列比对到基因组上了 – 第4位为0：另一条序列也比对到基因组上 – 每5位为0:这条序列正向比对到基因组上 – 第6位为1：另一条序列反向互补比对比对到基 因组上 – 第7位为1：这是Pair-end的Read1序列
0x0040 the read is the first read in a pair 1,2 0x0080 the read is the second read in a pair 1,2
6
7 8
0
1 0
0x0100
the alignment is not primary (a read having split hits may have multiple primary alignment records)
Flag注释
FLAG DESCRIPTION SITE 81
1 2 3 4 5 1 0 0 0 1 0x0001 the read is paired in sequencing, no matter whether it is mapped in a pair 0x0002 the read is mapped in a proper pair (depends on the protocol, normally inferred during alignment) 1
SAMtools常用工具介绍
• 文件查看与格式转换：samtools view -b 输出bam格式 -S 输入文件为sam格式 -u 输出的bam文件不压缩 -t 参考基因组每条染色体长度分布文件 -T 参考基因组fasta格式文件 -o 结果输出文件
• 通过对多态性分布的研究寻找保守区域和多 变区域
• 通过移码突变和结构变异找出差异基因 • 对差异基因进行功能注释，并通过关联分析 解读表现型与基因型的关系
进化分析
• 通过对突变的分析研究物种中不同品种的 进化史，绘制进化树
第一部分 基因组重测序概况 第二部分 重测序分析原理及内容
第三部分 分析流程及工具
• 比对： – 寻找 SA coordinates:bwa aln – 转换SA coordinates输出为sam:bwa sampe/samse
寻找 SA coordinates
• bwa aln 常用参数：
– n 比对时，允许最大错配数：mismatch+gap – o 允许的gap数 – t CPU使用个数
其他参数详细说明见： /bwa.shtml
SAM/BAM格式
• 存储对参考序列的片段比对的一个通用比对格式 • BAM含有和SAM相同的信息 • BAM较高的压缩率 • 具有快速访问和检索的功能 • 应用广泛
SAM/BAM格式
更多详细信息见官方文档： /SAM1.pdf
0x0004 the query sequence itself is unmapped 0x0008 the mate is unmapped 1 0x0010 strand of the query (0 for forward; 1 for reverse strand)
0x0020 strand of the mate 1
深度、覆盖度 SNP检测 SV检测
统计与注释
通过深度、质量值等筛选 得到可靠结果
重测序分析流程图
Burrows-Wheeler Aligner
• BWA: Burrows-Wheeler Aligner ，可以快速的将相 对较小的片段比对到参考序列上。 • 采用了两种不同的方式： – 针对小于200bp的错误率低（<3%）的片段。 – BWA-SW，针对较长的且错误率高的片段。 – 就目前测序的长度以及准确率来看，应该多采 用的是第一种方式。
– f
– I
结果输出文件
文件为 Illumina 1.3+的fastq文件
bwa aln ref.fa read1.fq –f read1.sai –o 0 –n 2 其他参数详细说明见： /bwa.shtml
转换SA coordinates输出为Sam
• 基因组重测序是对已知基因组序列的物种
进行不同个体的基因组测序，并在此基础
上对个体或群体进行差异性分析。
二 、基因组情况
• 1977年完成噬菌体Phi X 174基因组测序。
• 目前已知测序完成的生物基因组数量超过
3000，其中真核生物近200个，绝大部分生
物的基因组也已公布。 • 正在测序的生物基因组数量超过1万个。
长度约31M的染色体A03上，每个位点的覆盖深度大约为8X 左右，在这条染色体上覆盖度达到99.8%
二、重测序分析内容
多态性分析
单核苷酸多态性—SNP
同义与非同义突变
结构变异--SV 移码突变
进化分析
多态性分析
• 可找到大量的单核苷酸多态性位点（SNP） • 结构变异位点（SV，Structure Variation）； • 分析不同个体基因组间的结构差异， 完成基因 功能注释。
为什么使用BWA?
比对效率与soap相当
所占内存只有soap一半
结果文件应用更为广泛
可以容更多的错配与gap
BWA与SOAP比较
BWA
• 参考基因组建立索引数据库： – 待比对序列为短序列(<200bp)：bwa index ref.fa – 待比对序列为长序列(>=200bp)：bwa index –a bwtsw ref.fa
第三部分
分析流程及工具
测序数据
比对
深度、覆盖度 SNP检测 SV检测
统计与注释
通过深度、质量值等筛选 得到可靠结果
重测序分析流程图
分析软件
序列比对：bwa
SNP检测:samtools、bcftools SV检测:pindel、breakdancer
第三部分
分析流程及工具
测序数据
比对
到的片段。
• 插入片段长度一般为200-500bp；
双向测序
• Read：测序读到的碱基序列 • Pair ends：克隆末端测序产生的成对reads • 成对的reads之间的距离关系是确定的
测序深度
• 测序深度：
– 实际测序得到的碱基总量（bp）与基因组大小的比值； – 比对到基因组上的碱基总量与基因组大小的比值。 • 评价测序量的指标之一; • 测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降; • 我们目前采用的是Paired-End，当测序深度在5-15X以上时，基因组 覆盖度和测序错误率控制均得以保证;
密码子
结构变异（SV）
• 结构变异类型：通过pair-ends分析鉴定
– 插入(Insertion) – 缺失(Deletion) – 缺失插入(Deletion and Insertion) – 反转(Inversion) ……
插入（Insertion）
实际插入片段大小为300bp，比对到参考基 因组上后发现插入片段长度小于300bp，所 以对比参考基因组插入了一段序列。
SNP
• 单核苷酸多态性（SNP），主要是指在基因组水平上由单 个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。主要通过比
对的碱基错配（mismatch）鉴定。
• 两种类型： – 转换：同型碱基的置换（A↔T、G↔C）； – 颠换：异型碱基的置换（ A/T↔G/C ）；