小鼠受精卵显微去核技术的研究

小鼠受精卵显微去核技术的研究

武迪迪　刘莹　郑洁　王雁　于秉治

(中国医科大学基础医学院生物化学教研室,沈阳110001)

摘要　目的:探索昆明系小鼠受精卵细胞的去核技术。方法:借助显微操作系统,利用带有小针尖的去核针通过负压将细胞核连同少量细胞质及包裹其外的细胞膜一同吸进去核针内。结果:通过此种方法有66.5%的受精卵去核成功。结论:此种方法为有效的去核方法。

关键词　显微操作;受精卵;去核

The Study on the Enuclea tion of M ouse Fetil ized Em bryos

W u D id i,L iu Y ing,Z heng J ie,W ang Y an,Y u B ing z h i

(D epartm ent of B i ochem istry,Co llege of Basic M edical Sciences,Ch ina M edical U niversiry,Shenyang,110001)

ABSTRACT　Objective:R emoving the nuclear of the kun2m ing strain mou se.M ethods:U sing the em b ryo m i2 crom an i pu lati on system,W e in sert the sharp ti p of the p i pette in to the cell,w h ich leads to negative p ressu re.W ith th is fo rce,w e suck the nuclear together w ith som e cytop las m a and cell m em b rane around it ou t of the cell in to the p i pette.Results:W ith th is m ethods abou t66.5%nuclears w ere removed successfu lly.Conclusion:T h is is a u sefu l m ethod fo r removing nuclear.

KEY WOR D S　m icrom anpu lati on;zygo te;enucleati on

1997年7月苏格兰Ro slin研究所报道的“多利”的诞生[1]在世界范围内掀起了一场克隆热。克隆动物一时引起科学界特别是生物界的关注,克隆动物制作技术将成为遗传工程动物的主导性技术。而去核技术也成为克隆动物的关键环节,在核移植初期,移核针必须刺破细胞膜进行去核,对细胞损伤很大。1986年日本人T sunoda用切透明带的方法进行去核[3],此种方法适用于初学显微操作者。本实验用小鼠的受精卵为材料探索去核技术。

1　材料与方法

1.1　超排　选取4～6周健康昆明系雌性小鼠(中国医科大学实验动物部提供),于下午3时左右腹腔注射孕马血清(PM SG)10I U(天津华浮生物研究所)48h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)10 I U(上海生物化学制药厂),当晚与雄鼠1∶1合笼,次日检查阴栓待用。

1.2　取受精卵　注射hCG17～24h后,脱颈处死有阴栓的母鼠,取输卵管,在显微镜下撕开壶腹,释放带有卵丘细胞的细胞团,于含1m g m l的透明质酸酶的M2液中消化2～3m in,于M2[4]中洗涤4～6次,获得裸卵,置于M16[4]液中,在含5%CO2、95%空气的孵箱中培养,供去核用。

113　固定吸管的制备　将外径为1.0Λm的毛细玻璃管在水平拉针仪上拉成外径合适的小管,在锻烧仪上断开,使其外径为100Λm,内径为20～30Λm的玻璃管,再进一步钝化,制成所需的固定吸管。

1.4　去核针的制备　将毛细玻璃管在水平拉针仪上拉成针尖细部分为8～9nm长,管的粗端为4～5 nm长的玻璃针,在锻烧仪上于外径25～30Λm处断开,在磨针仪上将末端磨成45°角,然后进行洗涤,洗涤后,在锻烧仪上用微温煅烧,使其拉出一条细尖。

1.5　操作过程

1.5.1　预处理:将12细胞期受精卵置入含5Λg m l 细胞松弛素B(CB)和0.1Λg m l乙酰甲基秋水仙碱的培养液中培养30～45m in,然后将12细胞期的受精卵置入含细胞松弛素B和乙酰甲基秋水仙碱的操作滴中。

1.5.2　固定细胞:将固定吸管靠近细胞,轻轻稳定吸住12细胞期的受精卵,调节与固定吸管相连的注射器,施加微小的负压力,由于细胞松弛素B和乙酰甲基秋水仙碱的作用,有部分透明带及细胞膜包绕的细胞质凹入固定吸管中。

1.5.3　调节显微操作系统:固定吸管吸住细胞后,调节显微镜的焦距及操作部分的旋纽,使去核针、固定针和细胞位于同一平面,去核针的针尖清晰。1.5.4　去核针刺入细胞周隙:将去核针轻轻刺入透

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・中国医科大学学报　J Ch in M ed U n iv　第29卷　增刊　2000年8月

明带使其进入细胞周隙,然后回缩去核针,操作时注意不要刺破细胞膜,尽量使去核针的斜面贴近细胞膜。

1.5.5　去核:移动去核针使其达到能够靠近一个细胞核的位置,调节与去核针相连的注射器,然后施加微小的负压力,细胞膜就会包绕核呈弧形凹入去核针中,移动去核针使其靠近另一个核,用同样方法使另一个核吸入去核针内,轻轻向回拉动去核针,吐出核小体,去核成功[5]。去核后的细胞置入培养箱中待用。

2　结果

共进行8次实验,对209个受精卵进行去核, 139个细胞去核成功。成功率为66.5%。

3　讨论

随着“多利”的诞生,克隆技术倍受人们的关注。去核技术的研究也有了很大的进展。很多人研究用不同的方法进行去核。日本人T sunoda采用切透明带的方法进行去核,但也有不足之处。首先,切完透明带的细胞切口不易寻找,且细胞膜包绕的细胞质易从切口中脱出,细胞数损失较多。另外,在这一方法中,去核针同切透明带的针不同,去核时需换针,这样既费时又麻烦。

在进行去核操作过程中,去核针的制作,细胞松弛素的浓度和作用时间及显微操作系统的调节是本实验的关键环节。

首先,去核针在制作时针尖要细并且不能过长还要有一定弯曲,这是因为细的针尖易于穿过透明带进入细胞周隙,而太长的针尖又容易把细胞膜刺破,另外针尖要求有一定的弯曲是有利于去核针的斜面靠近细胞膜.满足这些条件的去核针去核成功率较高。

其次,细胞松弛素的浓度一定要控制在5Λg m l,浓度小于5Λg m l,细胞膜不够柔软,去核时细胞膜易破;浓度大于5Λg m l时细胞易变形,细胞膜变为不规则状,对细胞损伤太大。另外细胞松弛素的作用时间控制在30～45m in,作用效果最佳。时间太长或太短效果都不好。

最后,在去核的操作过程中注意调节显微镜的操作系统,一定要使固定针、去核针及细胞在一个平面,以去核针的针尖清晰为准。操作过程中动作要轻柔缓慢。

本实验所采用的去核方法是高效、快捷的去核方法。去核技术是研究细胞的全能性及核质关系的重要手段,同时去核技术也是克隆技术的关键环节,通过对去核技术的进一步完善,用去核技术克隆有经济价值或社会价值的器官和动物,如克隆人体器官及珍惜动物大熊猫成为可能,其科学意义和应用价值不可估量。

参考文献

1　丁小燕.体细胞克隆与转基因动物1科学,1997,49:52～54

2　M cGrath J,So lter D.N uclear transp lantati on in the mouse em2 bryo bu m icro surgery and cell fusi on.Science,1983,220:1300-

1302

3　Y T sunoda,T Yasui,K N akam ura.Effect of cutting the zona pellucida on the p ronuclear transp lantati on in the mouse.J Exp Zoo l,1986,240:119-125

4　B rigid Hogan,F rank Co stantini,E lizabeth L acy,M ani pulating the mouse em bryo.Co ld Sp ring H arbo r L abo rato ry,1986,250-

252

5　严云勤,李光鹏,郑小民.发育生物学原理与胚胎工程.哈尔滨:黑龙江科学技术出版社,19951259～260

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增刊 武迪迪等1小鼠受精卵显微去核技术的研究