第四章_克隆载体的特征及类型解析
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第四章克隆载体的特征及类型
吸附
LamB受体 注入
复制
包装
噬菌体或病毒DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体DNA
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到 50-100个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素， 可达到1000-3000拷贝。 缺点： 有被动迁移的可能，不够安全。 抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。
Amp Tet
pBR322
插入片段
Tet平板
Amp平板
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。
质粒的基本特征
质粒
质粒的不相容性：分子机制
两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的 拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定， 因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一 细胞内(亲和性质粒) 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种 拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同， 其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势
质粒的基本特征
4. 质粒的重组性
质粒
由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。 在基因工程应用的是重组缺陷型（rec–）的质粒和菌株。
质粒的基本特征
质粒
5. 携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这
使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物
黏性末端
cos
DNA合成控制基因
阻遏基因 早期控制基因
4第四章 基因克隆的载体-1质粒
2、具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测； 3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，便于外源基因 插入；
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，
克隆载体的基本特征
克隆载体的基本特征
在基因工程领域中，克隆载体起着至关重要的作用。
克隆载体是将外源DNA序列复制并存在于细胞内的一种工具，它具有多种基本特征，下面就让我们依次来了解一下。
一、线性结构
克隆载体通常采用环状DNA结构，但也可以是线性结构。
线性结构克隆载体的优点在于可以很好地进行基因编辑和引导组装，因为我们可以精确地将某个基因插入到DNA链中的任何一个点。
二、多克隆位点
多克隆位点是指克隆载体上多个限制酶切位点，它使得我们可以对载体进行切割和连接操作，使得新的DNA序列可以仿佛“搭积木”一样拼接在载体上，便于我们对其进行进一步的操作。
三、选择标记
克隆载体拥有选择标记，这是一种特殊的DNA序列，它可以帮助我们筛选特定类型的细胞，在细胞培养过程中对于有选择地优异细胞进行筛选。
一般选择标记的方法有抗生素抗性，酵母元素和抑制素敏感性等。
四、维护元素
维护元素是指克隆载体中的特定DNA序列，在细胞内起着非常重要的
作用。
维护元素可以帮助载体与某些DNA蛋白相互作用，防止修饰酶的降解，避免载体丢失，保持在细胞内的稳定状态。
五、操纵元件
操纵元件是指克隆载体中的特定DNA序列，可以控制表达外源基因的时间和数量，包括启动子、增强子和转录终止序列等，操纵元件的调节对于外源基因的表达水平和时间都有至关重要的影响。
以上就是克隆载体的基本特征，这些特征都是为了更好地进行基因工程和生物学研究所必不可少的。
当然，不同的克隆载体可能具有不同的特征，因此在使用的时候我们需要仔细选择适合自己实验的载体。
克隆载体
青霉素抗性检测、蓝白斑筛选(重组表型检测标记)
15
三个显著区别：
1. 分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更 高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）
2. 含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利 用-互补原理进行蓝白筛选
3. 多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成
第一节 载体简介 第二节 克隆载体* 第三节 人工染色体载体 第四节 表达载体
概念：携带目的基因进入宿主细胞进行复制、扩增和 表达的工具称载体（Vector）;即用于克隆、运载和转移目的基 因并能自我复制的DNA分子
一个DNA片段只有与合适的载体DNA连接构成重组 DNA后，才能高效地进入宿主细胞，并在其中复制、扩增
3. 加入选择性标记：通过质粒间的重组使质粒携带合适标 记，常用的有抗生素抗性标记。如：氨苄青霉素抗性标 记、四环素抗性标记、卡那霉素抗性标记等
4. 安全性能改造：不能随便转移，以免污染环境 5. 改造或增加基因表达的调控序列：比如加入强启动子
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11
4363bp
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Ampr
3. 加装选择标记
如加入lacZ’ 使受体细胞在裂解之后形成蓝色透明圈
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B. λ噬菌体载体分类
1. 插入型载体: 仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点，如λgt系列 只能插入较小的外源DNA片段（小于10kb）
cos
cos
LA
RA
EcoRI
2. 替换型载体：具有两个对应的酶切克隆位点
噬菌体还有一大优点，即使它的DNA丢失25％仍不失活， 这部分丢失的空档正好可以装载外源DNA
简述基因克隆载体的主要类型
简述基因克隆载体的主要类型
基因克隆载体是指一类可以携带外源DNA片段并能够被复制的DNA分子。
常用于基因工程中，将特定基因序列克隆到载体DNA上，进而进行转化和表达。
根据不同的功能和应用，基因克隆载体可以分为多种类型，以下是主要的几种：
1. 质粒（Plasmid）：质粒是最常用的基因克隆载体之一，通常起源于细菌，具有自主复制的能力，易于操作和扩增。
质粒通常被用于基因表达、基因敲除和基因突变等领域。
2. 病毒载体（Viral Vector）：病毒载体是一类通过改造病毒而成的基因克隆载体，具有高度的转染效率和生物安全性。
病毒载体通常被用于基因治疗、免疫治疗和癌症治疗等领域。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）：人工染色体是一种可以模拟天然染色体结构和功能的基因克隆载体，通常具有高度的稳定性和扩增性能。
人工染色体通常被用于基因组学研究和治疗复杂遗传病等领域。
4. 原核表达载体（Prokaryotic Expression Vector）：原核表达载体是一类专门用于大肠杆菌等原核生物中进行基因表达的基因克隆载体。
原核表达载体通常具有高度的表达效率和易于操作的特点，被广泛应用于蛋白质制备和生物技术研究等领域。
第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
噬菌体再感染。
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
克隆载体的名词解释
克隆载体的名词解释克隆载体是分子生物学实验中常用的工具，用于携带并负载外源DNA片段，以实现基因克隆和基因工程。
克隆载体可由天然或人工合成的DNA构建而成，广泛用于基础研究、基因表达、基因治疗等领域。
本文将从克隆载体的定义、组成结构、常见类型以及应用等方面对其进行解释。
一、克隆载体的定义克隆载体是指用于将目标外源DNA导入到宿主细胞或有机体中，并在其中进行自主复制、表达和传递的DNA分子。
克隆载体具有一系列特定的序列和功能元件，包括起始子、终止子、选择标记、荧光蛋白等，以确保成功实现目标DNA的克隆和表达。
二、克隆载体的组成结构克隆载体通常由一个或多个元件组成，包括DNA序列、选择标记、表达载体以及复制起源，具体结构如下：1. DNA序列：克隆载体内含有目标外源DNA的序列，其大小和类型因实验需求而异。
DNA序列通常具有特定的限制性内切酶切位点，以便于将外源DNA片段定向插入到载体中的特定位置。
2. 选择标记：为了筛选成功克隆和转入宿主细胞的载体，克隆载体通常携带有选择标记基因，如抗生素抗性基因或荧光蛋白基因。
这些标记基因在宿主细胞中可以提供对抗生素的耐药性或特定荧光表达，从而方便筛选出含有目标外源DNA的成功克隆载体。
3. 表达载体：对于需要进行表达的克隆载体，其内部还包含有启动子、终止子以及表达宿主基因的相关元件。
这些元件协同作用，使得克隆载体能够在宿主细胞中进行基因的转录和翻译，从而实现目标基因的表达。
4. 复制起源：为了保证克隆载体能够在宿主细胞中独立复制，克隆载体通常还含有复制起源序列。
复制起源序列可以与宿主细胞的复制系统相互配合，使得克隆载体能够被复制并遗传到下一代细胞中。
三、克隆载体的常见类型克隆载体具有多种类型，根据其应用和特性的不同，常见的克隆载体包括质粒、噬菌体、合成DNA以及病毒载体等。
1. 质粒（Plasmid）：质粒是环状的双链DNA分子，常见于细菌和真核生物中。
质粒通常具有小分子大小（约1-10 kb），较容易复制和操纵。
四、基因克隆载体(一)
把非洲爪蟾核糖体基因片段同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并 在菌体内成功转录出相应的mRNA。 这是第一次成功的基因克隆实验。
2、pBR322
p—plasmid，BR分别为该质粒的两位主要构 建者F. Bolivar和R.L. Rodriguez姓氏的头一个字 母，“322”为实验编号。
含有双抗基因（Apr，Tcr）和Col E1复制起始 子。
融合型蛋白表达载体：pET28a
非融合型蛋白表达载体：pKK223-3（强启动子Ptac）
（三）、质粒载体的构建
构建质粒克隆载体的基本策略如下：
① 构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行 有效的复制并且作为质粒克隆载体，希望在受体细胞中 有较多的拷贝数。 * 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
克隆载体(cloning vector)： 指能够把外源DNA片段带入受体细胞，并进
行稳定遗传的DNA或RNA分子
穿梭载体(shuttle vector)： 带有两种不同的复制起始位点，可以在两种
不同的生物体中复制的质粒载体
表达载体(expression vector) 一种克隆载体，可以使插入的外源DNA片段
严紧型质粒(stringent plasmid)：拷贝数少，1－数个， 松弛型质粒(relaxed plasmid) ：拷贝数多，10个以上
（提取质粒时，可添加氯霉素）
4. 质粒的不亲和性(Incompatible):
两种类似的不同质粒不能存在于同一细胞中。 亲和质粒、不亲和质粒
5. 质粒的可转移性：
D） Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物， 促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移
E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr， F） 产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒） G） 降解基因：降解重金属、有机物和农药等 H) 致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒
2、pBR322
p—plasmid，BR分别为该质粒的两位主要构 建者F. Bolivar和R.L. Rodriguez姓氏的头一个字 母，“322”为实验编号。
含有双抗基因（Apr，Tcr）和Col E1复制起始 子。
融合型蛋白表达载体：pET28a
非融合型蛋白表达载体：pKK223-3（强启动子Ptac）
（三）、质粒载体的构建
构建质粒克隆载体的基本策略如下：
① 构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行 有效的复制并且作为质粒克隆载体，希望在受体细胞中 有较多的拷贝数。 * 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
克隆载体(cloning vector)： 指能够把外源DNA片段带入受体细胞，并进
行稳定遗传的DNA或RNA分子
穿梭载体(shuttle vector)： 带有两种不同的复制起始位点，可以在两种
不同的生物体中复制的质粒载体
表达载体(expression vector) 一种克隆载体，可以使插入的外源DNA片段
严紧型质粒(stringent plasmid)：拷贝数少，1－数个， 松弛型质粒(relaxed plasmid) ：拷贝数多，10个以上
（提取质粒时，可添加氯霉素）
4. 质粒的不亲和性(Incompatible):
两种类似的不同质粒不能存在于同一细胞中。 亲和质粒、不亲和质粒
5. 质粒的可转移性：
D） Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物， 促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移
E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr， F） 产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒） G） 降解基因：降解重金属、有机物和农药等 H) 致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒
克隆载体
柯斯质 粒载体
细菌人 工染色
体
动物病 毒载体
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5
克隆载体类型
1. 细菌质粒载体（10kb)
包括大肠杆菌和枯草杆菌质粒载体
2. λ噬菌体衍生载体(9-23kb) 3. 柯斯质粒（Cosmid）载体(40-50kb)
一种由质粒和λ噬菌体cos尾巴构建复合载体
4. M13载体
一类专门用于Sanger法测序的载体
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II.噬菌体载体
1. 噬菌体简介 2. λ噬菌体载体 3. λDNA作为载体的优点 4. 噬菌体载体小结
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1.噬菌体简介
噬菌体（Bacteriophage, phage），细菌病 毒一类的总称
噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和 病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌， 也可以认为它是细菌里的“寄生虫”
cos
cos
LA
20Kb
RA
EcoRI
EcoRI
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替换型载体
在非必需区域内含有两个相同的酶切口，两者间的距 离为22kb长，使用时用酶切开，分离去除这个22kb长的DNA 片段，然后用外源DNA片段取代之
载体的容量比插入型载体大，有载装下限为10.4而上 限为25.5kb。实际应用时不需要标记基因，因为空载体DNA 只有26kb，不能被包装，无法进入受体细胞
常用的克隆质粒载体:
pBR322
pUC系列 pGEM系列
4363bp
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pBR322
Ampr BamHⅠ
Tetr
插入灭活四 环素抗性基因
克隆载体表达载体(课件)PPT课件
详细描述
组成型表达载体是将基因整合到宿主细胞的染色体上，使基因在任何生长条件下都能稳定表达。这种 表达载体适用于需要持续稳定表达的基因。
组织特异性表达载体
总结词
在特定的组织或器官中，表达载体才能 启动基因的表达。
VS
详细描述
组织特异性表达载体是将基因与特定的组 织或器官相关的调控序列结合，使基因只 在特定的组织或器官中表达。这种表达载 体适用于需要组织特异性表达的基因。
05
克隆载体和表达载体的未来发展
克隆载体和表达载体的新技术和新方法
基因编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，实现对克隆载体和表达载体的精确修饰，提高基 因治疗的效率和安全性。
人工染色体技术
开发人工染色体技术，实现对大型基因组的克隆和表达，为遗传病研究和治疗提供新的 工具。
克隆载体和表达载体的新应用和新领域
04
克隆载体和表达载体的应用
克隆载体在基因工程中的应用
基因克隆
克隆载体可以将目的基因插入到质粒 或病毒载体中，实现基因的复制和扩 增，为基因工程提供大量目的基因。
基因保存
基因突变
通过将目的基因插入到克隆载体中， 进行定点突变或随机突变，研究基因 功能和蛋白质活性。
克隆载体可以保存和传递目的基因， 为基因工程提供长期稳定的基因来源。
01
02
03
基因治疗
利用克隆载体和表达载体， 开发新型基因治疗策略， 针对遗传性疾病、肿瘤等 进行有效治疗。
生物制药
通过克隆载体和表达载体， 实现高效、大规模的蛋白 质药物生产，推动生物制 药产业的发展。
农业育种
利用克隆载体和表达载体， 培育抗逆、抗病、高产的 农作物新品种，提高农业 生产效益。
组成型表达载体是将基因整合到宿主细胞的染色体上，使基因在任何生长条件下都能稳定表达。这种 表达载体适用于需要持续稳定表达的基因。
组织特异性表达载体
总结词
在特定的组织或器官中，表达载体才能 启动基因的表达。
VS
详细描述
组织特异性表达载体是将基因与特定的组 织或器官相关的调控序列结合，使基因只 在特定的组织或器官中表达。这种表达载 体适用于需要组织特异性表达的基因。
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克隆载体和表达载体的未来发展
克隆载体和表达载体的新技术和新方法
基因编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，实现对克隆载体和表达载体的精确修饰，提高基 因治疗的效率和安全性。
人工染色体技术
开发人工染色体技术，实现对大型基因组的克隆和表达，为遗传病研究和治疗提供新的 工具。
克隆载体和表达载体的新应用和新领域
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克隆载体和表达载体的应用
克隆载体在基因工程中的应用
基因克隆
克隆载体可以将目的基因插入到质粒 或病毒载体中，实现基因的复制和扩 增，为基因工程提供大量目的基因。
基因保存
基因突变
通过将目的基因插入到克隆载体中， 进行定点突变或随机突变，研究基因 功能和蛋白质活性。
克隆载体可以保存和传递目的基因， 为基因工程提供长期稳定的基因来源。
01
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03
基因治疗
利用克隆载体和表达载体， 开发新型基因治疗策略， 针对遗传性疾病、肿瘤等 进行有效治疗。
生物制药
通过克隆载体和表达载体， 实现高效、大规模的蛋白 质药物生产，推动生物制 药产业的发展。
农业育种
利用克隆载体和表达载体， 培育抗逆、抗病、高产的 农作物新品种，提高农业 生产效益。
克隆载体
pUC18和pUC19载体
pUC18
HindIII SphI PstI SalI XbaI BamHI SmaI KpnI SacI EcoRI
EcoRI SacI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII
pUC19
LacZ
Apr
(2.68kb)
Ori
N
cI Cro
Q
S
R
激活 tL PL tR2 N 后期 P'R tM Pi 溶源性建立 和保持 PM OL OR tR1 后早期
PE CI阻遏物
2) λ噬菌体基因的表达
i. 最早期转录：转录起始于CI基因两侧的PL和PR启动子， 止于N和Cro末端的tL和tR1，有的右向转录物可継续通 过O和P止于tR2。 ii. 后早期转录：N蛋白可使宿主细胞转录终止因子ρ失活， 导致转录通过tR1、tR2和tL进入其余早期基因区域。 iii. 后期转录：cro蛋白可与OL和OR结合，阻止RNA聚合 酶与PL和PR结合，转录终止，此时已合成了足够多的 控制蛋白Q，它对P'R起激活作用，导致后期基因转录。 iv. DNA复制：因早期转录获DNA复制蛋白O和P，双向 复制开始。 v. 包装：Nul和A蛋白与λDNA的cos位点的识别与切割， FI蛋白促进DNA进入头部蛋白，DNA充满后，gpw和 gpFⅡ将头部封住，然后与尾部相连，形成噬菌体颗粒。
左臂
隔离段 E lac5 XbE bio256 E KH54
右臂
50kb
nin5 QSR80
大肠杆菌λ载体 Charon 4A
限制酶 克隆方式： EcoRI 取代法
E 20.1kb
E 7.1kb
第四章 基因克隆载体1
c) RF-DNA 以-DNA为模板不断合成+链DNA, 与特异性蛋白结合,组装成新的噬菌体颗粒. 释放到细胞外,而不破坏宿主细胞．
第四节 植物病毒载体
1.花椰菜花斑病病毒（Cauliflower Mosaic Virus,
CaMV)．
环状双链DNA病毒，由蚜虫以非持久方式或半持 久方式传播、感染十字花科和少数非十字花科植物
混合载体系统
将CaMV-DNA整合到Ti质粒DNA分子上,使新的载体 同时具有CaMV和Ti载体的特性. 通过根癌农杆菌 转移到植物细胞中.
特点: * 扩大了CaMV的正常宿主范围 * 避免了CaMV突变体之间的基因重组
第五节 动物病毒基因克隆载体
1.猿猴空泡病毒40（ Simian virus 40，SV40)
e)染色体和质粒DNA兼有的载体（Chrosmid vector） 基因整合平台系统；ＹＡＣ克隆载体
2.2 按克隆载体的用途分类
a)cDNA克隆载体：λgt11，pT7T3， b)原核（Prokaryotic）表达载体：pKK223-3 c)原核基因融合（Prokaryotic gene fusion）载
e）包装成新的反转录病毒颗粒. f）感染目的宿主细胞（动物细胞），外源基
因导入动物细胞.
3. 腺病毒克隆载体
腺病毒（adenovirus, Ad）是一类无囊膜的20面 体病毒，含有一个线性双链DNA分子。AdDNA两端具有逆向末端重复序列IRT．在每一 条单链DNA的5’端共价结合一种特殊结合蛋白 （5.5 kD）TP，当DNA从病毒颗粒中释放后， 通过该蛋白连接成环状．
* 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
2) 构建的质粒载体含有克隆外源DNA的位点(MCS) 3) 构建的质粒载体含有选择标记基因(Apr,Tcr,Kmr) 4) 构建的质粒载体分子量小,转化效率高,插入外源片
第四节 植物病毒载体
1.花椰菜花斑病病毒（Cauliflower Mosaic Virus,
CaMV)．
环状双链DNA病毒，由蚜虫以非持久方式或半持 久方式传播、感染十字花科和少数非十字花科植物
混合载体系统
将CaMV-DNA整合到Ti质粒DNA分子上,使新的载体 同时具有CaMV和Ti载体的特性. 通过根癌农杆菌 转移到植物细胞中.
特点: * 扩大了CaMV的正常宿主范围 * 避免了CaMV突变体之间的基因重组
第五节 动物病毒基因克隆载体
1.猿猴空泡病毒40（ Simian virus 40，SV40)
e)染色体和质粒DNA兼有的载体（Chrosmid vector） 基因整合平台系统；ＹＡＣ克隆载体
2.2 按克隆载体的用途分类
a)cDNA克隆载体：λgt11，pT7T3， b)原核（Prokaryotic）表达载体：pKK223-3 c)原核基因融合（Prokaryotic gene fusion）载
e）包装成新的反转录病毒颗粒. f）感染目的宿主细胞（动物细胞），外源基
因导入动物细胞.
3. 腺病毒克隆载体
腺病毒（adenovirus, Ad）是一类无囊膜的20面 体病毒，含有一个线性双链DNA分子。AdDNA两端具有逆向末端重复序列IRT．在每一 条单链DNA的5’端共价结合一种特殊结合蛋白 （5.5 kD）TP，当DNA从病毒颗粒中释放后， 通过该蛋白连接成环状．
* 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
2) 构建的质粒载体含有克隆外源DNA的位点(MCS) 3) 构建的质粒载体含有选择标记基因(Apr,Tcr,Kmr) 4) 构建的质粒载体分子量小,转化效率高,插入外源片
第四章克隆载体解析
噬菌体生物学性状介绍
3、基因组成：
48.5 kb in length；Linear or circular genome (cos ends)
＊replican：基因组中能独立复制的最小单位， 含复制起始点(ori)和复制终点。 ＊ DNA的复制由ori控制 ＊原核细胞的染色体和质粒有固定的ori ＊真核细胞的染色体有多个ori
按复制起点划分克隆载体
质粒复制型—复制起点来自质粒
ARS复制型—ARS（autonomus replicative sequence)，或称 染色体复制型 病毒复制型—复制起点来自病毒 混合复制型
3、载体组成
物理图谱（physical map)
4、载体主要元件（特点） 及其应用
（五）常见人工构建质粒的分类:
according to their functions,plasmids can be classified into: 人工构建的质粒根据其功能及用途分为: 1.多拷贝质粒 复制子经过人工突变，除去控制拷贝数 负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于 扩增外源基因。 2.测序质粒sequencing plasmid
基因工程的克隆载体
Genetic Cloning Vector
基因工程的基本程序及研究策略
目的基因的制备( donor DNA ) 载体DNA及其改造 (Vector DNA)
③ ① ② ④
体外DNA重组(DNA recombination ) 重组DNA的转化 ( Transformation) 重组体的筛选鉴定与 克隆扩增 ( identification &
3.整合质粒 装有整合促进基因及整合特异序列， 便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染 色体上
4-克隆载体
低分子量的质粒载体， ③低分子量的质粒载体，对同一限制酶具有多重 识别位点的几率相应降低。 识别位点的几率相应降低。
（在一条随机排列的长DNA序列中，假设所含有的4种核 在一条随机排列的长DNA序列中，假设所含有的4 DNA序列中 苷酸都具有相同的频率，那么任何一种组合的4 苷酸都具有相同的频率，那么任何一种组合的4核苷酸的 靶序列，在平均4 256个核苷酸对中 个核苷酸对中， 靶序列，在平均44＝256个核苷酸对中，都有出现一次的 机会，同样的， 核苷酸的靶序列出现的机会是每4 机会，同样的，6核苷酸的靶序列出现的机会是每46＝ 4096一次 所以DNA分子的长短， 一次。 DNA分子的长短 4096一次。所以DNA分子的长短，直接关系到同一个限制 酶的识别序列在其中可能出现的次数）。 酶的识别序列在其中可能出现的次数）。
2、质粒载体的选择记号
在基因克隆中采用的质粒载体的选择记号有很 多种，采用较多的是抗性特征 抗性特征。 多种，采用较多的是抗性特征。 一方面由于许多质粒本身就是带有此类抗性基 另一方面因为抗菌素的抗性特征便于操作， 因，另一方面因为抗菌素的抗性特征便于操作， 易于选择。 易于选择。
3、天然质粒用作克隆载体的局限性
具有若干限制酶单一 若干限制酶单一识别位点 （3）具有若干限制酶单一识别位点
这样的分子结构特性， 这样的分子结构特性，可以满足基因克隆的 需要，并且在其中插入适当大小的外源DNA DNA片段之 需要，并且在其中插入适当大小的外源DNA片段之 应该不影响质粒DNA的复制功能。 DNA的复制功能 后，应该不影响质粒DNA的复制功能。
典型的大肠杆菌表达型质粒载体
必须包括大肠杆菌的启动子及操纵位点序列、 必须包括大肠杆菌的启动子及操纵位点序列、多 启动子 序列 克隆位点（MCS） 转录及翻译信号、 克隆位点（MCS）、转录及翻译信号、质粒载体的 复制起点以及抗菌素的抗性基因。 以及抗菌素的抗性基因 复制起点以及抗菌素的抗性基因。
生物基因克隆载体的种类和特征
4、质粒DNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启 动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒， 并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。
生物基因克隆载体的种类和特征
• 除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所 有的质粒都是DNA质粒。质粒DNA的大小：文献中有3种 说法： 小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质； 大的可达105KD，两者相差上百倍。 1Kb～200Kb (Sambrok et al.) 5Kb～400Kb (Lehninger) MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿) 1.5Kb≈1MD
生物基因克隆载体的种类和特征
1、质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制 控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合
抑制蛋白 ↘
Cop
起始蛋白
↘ Rep
Pcop cop
P/Orep rep
ori
生物基因克隆载体的种类和特征
质粒复制控制的分子模型： • *抑制蛋白质稀释模型(Inhibitor dilution model)
③：注意：只有当有确切的证据表明第二种B质粒已经进入含有A质粒 的寄主细胞，而且它的DNA不受寄主细胞限制体系的降解作用，但 这两种细胞却不能长期共存，只有在这种情况下，我们才能说A和 B是不亲和的质粒。
④：不亲和群的概念： 彼此之间互不相容的质粒，属于同一不亲和群(incompatibility group)。
两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid）：质粒的复制受 寄主细胞染色体DNA和染色体蛋白质的控制，在细胞中以低拷 贝数量形式存在， 1 - 3 拷贝。（低拷贝数质粒） 松弛型复制控制的质粒（relaxed plasmid）：质粒的复制不受 寄主细胞染色体DNA和染色体蛋白质的控制，在细胞中以高拷 贝数量形式存在，10 - 60 拷贝。（高拷贝数质粒）
生物基因克隆载体的种类和特征
• 除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所 有的质粒都是DNA质粒。质粒DNA的大小：文献中有3种 说法： 小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质； 大的可达105KD，两者相差上百倍。 1Kb～200Kb (Sambrok et al.) 5Kb～400Kb (Lehninger) MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿) 1.5Kb≈1MD
生物基因克隆载体的种类和特征
1、质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制 控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合
抑制蛋白 ↘
Cop
起始蛋白
↘ Rep
Pcop cop
P/Orep rep
ori
生物基因克隆载体的种类和特征
质粒复制控制的分子模型： • *抑制蛋白质稀释模型(Inhibitor dilution model)
③：注意：只有当有确切的证据表明第二种B质粒已经进入含有A质粒 的寄主细胞，而且它的DNA不受寄主细胞限制体系的降解作用，但 这两种细胞却不能长期共存，只有在这种情况下，我们才能说A和 B是不亲和的质粒。
④：不亲和群的概念： 彼此之间互不相容的质粒，属于同一不亲和群(incompatibility group)。
两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid）：质粒的复制受 寄主细胞染色体DNA和染色体蛋白质的控制，在细胞中以低拷 贝数量形式存在， 1 - 3 拷贝。（低拷贝数质粒） 松弛型复制控制的质粒（relaxed plasmid）：质粒的复制不受 寄主细胞染色体DNA和染色体蛋白质的控制，在细胞中以高拷 贝数量形式存在，10 - 60 拷贝。（高拷贝数质粒）
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拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，
其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势
质粒
质粒的基本特征
3. 质粒的可转移性
革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等
非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用
穿梭质粒
表达质粒
装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆
装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件
探针质粒
装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pBR322：
松弛型复制 拷贝数 50 - 100 / cell 氯霉素可扩增 用于基因克隆
ROI ROP Origin of Replication Hind II Pvu I Pst I Apr Tcr EcoR I Cla I Hind III Pst I BamH I
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制 控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合
Cop
Rep
Pcop
cop
P/Orep
rep
ori
质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系
质粒
质粒的基本特征
2. 质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质 粒组成不相容性群。 以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细 胞以外的其它生物细胞中。
自主复制型载体和附加载体的扩增方式
载体的类型
应用范围：克隆载体、表达载体。 应用对象：原核载体、真核载体（酵母、植物和动物） 、穿梭载体。
构建来源：质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒 DNA 与 病毒或噬菌体 DNA 组成的载体、质粒 DNA 与染色体 DNA 片
如Col、R的其它成员 值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒 的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和
mob 基因决定
质粒
质粒的基本特征
4. 质粒的重组性 由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。 在基因工程应用的是重组缺陷型（rec–）的质粒和菌株。
质粒
在重组的 pGEM3Z载体中 加入相应的RNA 聚合酶，可以 发生外源基因 转录。
质粒载体总体评价
ห้องสมุดไป่ตู้
操作简便
克隆容量有限（< 10kb）
第二节 噬菌体或病毒DNA
噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染 宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏 起来。
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增
质粒的基本特征
5. 携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这
使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 物质合成 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 抗生素、细菌毒素、有机碱
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义
利用
抗性 基因 进行 重组
质粒
质粒的分类
人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因
低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因
温敏质粒 测序质粒 整合质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合
第二节 质粒
质粒的基本特征
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并
被稳定遗传的一类核酸分子；绝大多数的质粒是DNA型
质粒常见于原核细菌和真菌中
质粒DNA的分子量范围：1 - 200 kb
天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、开环
(ocDNA)和线性(lDNA)构型。
质粒
质粒的基本特征
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制 控制复制引物与模板的结合
RNA II
3’ 5’
复制方向
5’ 3’
ori
RNA I
rop
（ +） Rop
E.coli ColE1 plasmid
RNAII是复制的正向调节分子，RNAI是复制的负调节物
质粒
质粒的基本特征
pBR322 4363 bp
Sal I
Bal I
优点：
分子量小：4363bp, 容易纯化。
含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而 且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入 DNA ， amp 基因内可被 Pst I, Pvu I, Sac I 切开，而四环素抗性基 因可被BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理
Plac pUC18/19 5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷 X-gal
CH 2OH O HO H O OH H H H H OH N
MCS
lacZ’
b
Cl Br
a
b-半乳糖苷酶的a-肽段
Cl Br N Cl O N Br
一个强的选择标记。 具有允许外源DNA片段克隆的位点，并且位于选择标记基因区
4.
内，插入外源片段不影响质粒的复制功能。
5. 6.
能够导入寄主细胞，具备转化的功能。 操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质 粒载体。
质粒人工构建的目的
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点
噬菌体或病毒DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体DNA
l 噬菌体的生物学特性： 生物结构
l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成
l-DNA全长48502个核苷酸
l-DNA上至少有61个基因
约有20kb的区域为为噬菌体生长非必需的 ，可以缺失或被外源DNA片段所取代。
l 噬菌体生物学特性： 生物结构
黏性末端
穿梭载体(shuttle vector)
又称双功能载体，能在两种不同的生物体内复制的载体。 同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点 或酵母菌的自主复制序列 (ARS)，它既能在原核细胞中扩增又能在 真核细胞中复制和表达。
主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体 和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞 中表达，并可提高外源基因的表达效率。
亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。
质粒
质粒的基本特征
质粒的不相容性：分子机制 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的 拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定， 因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一 细胞内(亲和性质粒)
两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种
重要的大肠杆菌质粒载体
pUC18 / 19：
EcoRI SstI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT 396 452
拷贝数 2000 - 3000 / cell 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ’ 用于基因克隆和测序
段组成的载体。
克隆载体(cloning vector)
用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。 一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复 制子。
表达载体(expression vector)
使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可 将重组体 DNA 导入适合的受体细胞，使所载的目的 基因能够复制、转录和翻译。
溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因
第四章 基因克隆的载体
载体的功能及特征 质粒（plasmid） 噬菌体或病毒DNA 粘粒（cosmid）与噬菌粒
人工染色体载体
载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。
能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自
我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表
达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。
lacZ'
pUC18
2686 bp Apr
ori
pUC18也来自于pBR322，但只保留了复制起点和ampR位点，ampR基 因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在lacZ 基因内的一个小片段上。 pUC18的优点： 1）突变位点位于复制起点，提高了拷贝数。 2) 重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加amp和X-gal, IPTG，节约了一半的时间。 3）多克隆位点，可以使具有不同粘端的DNA片段插入载体，而不 必连接linker。 4）载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的，因此，插 入pUC系列的克隆DNA可以直接转入M13mp载体，可以进行DNA测序和 体外定点突变。
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到 50-100个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素， 可达到1000-3000拷贝。 有被动迁移的可能，不够安全。 抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。
其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势
质粒
质粒的基本特征
3. 质粒的可转移性
革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等
非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用
穿梭质粒
表达质粒
装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆
装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件
探针质粒
装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pBR322：
松弛型复制 拷贝数 50 - 100 / cell 氯霉素可扩增 用于基因克隆
ROI ROP Origin of Replication Hind II Pvu I Pst I Apr Tcr EcoR I Cla I Hind III Pst I BamH I
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制 控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合
Cop
Rep
Pcop
cop
P/Orep
rep
ori
质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系
质粒
质粒的基本特征
2. 质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质 粒组成不相容性群。 以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细 胞以外的其它生物细胞中。
自主复制型载体和附加载体的扩增方式
载体的类型
应用范围：克隆载体、表达载体。 应用对象：原核载体、真核载体（酵母、植物和动物） 、穿梭载体。
构建来源：质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒 DNA 与 病毒或噬菌体 DNA 组成的载体、质粒 DNA 与染色体 DNA 片
如Col、R的其它成员 值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒 的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和
mob 基因决定
质粒
质粒的基本特征
4. 质粒的重组性 由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。 在基因工程应用的是重组缺陷型（rec–）的质粒和菌株。
质粒
在重组的 pGEM3Z载体中 加入相应的RNA 聚合酶，可以 发生外源基因 转录。
质粒载体总体评价
ห้องสมุดไป่ตู้
操作简便
克隆容量有限（< 10kb）
第二节 噬菌体或病毒DNA
噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染 宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏 起来。
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增
质粒的基本特征
5. 携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这
使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 物质合成 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 抗生素、细菌毒素、有机碱
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义
利用
抗性 基因 进行 重组
质粒
质粒的分类
人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因
低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因
温敏质粒 测序质粒 整合质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合
第二节 质粒
质粒的基本特征
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并
被稳定遗传的一类核酸分子；绝大多数的质粒是DNA型
质粒常见于原核细菌和真菌中
质粒DNA的分子量范围：1 - 200 kb
天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、开环
(ocDNA)和线性(lDNA)构型。
质粒
质粒的基本特征
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制 控制复制引物与模板的结合
RNA II
3’ 5’
复制方向
5’ 3’
ori
RNA I
rop
（ +） Rop
E.coli ColE1 plasmid
RNAII是复制的正向调节分子，RNAI是复制的负调节物
质粒
质粒的基本特征
pBR322 4363 bp
Sal I
Bal I
优点：
分子量小：4363bp, 容易纯化。
含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而 且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入 DNA ， amp 基因内可被 Pst I, Pvu I, Sac I 切开，而四环素抗性基 因可被BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理
Plac pUC18/19 5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷 X-gal
CH 2OH O HO H O OH H H H H OH N
MCS
lacZ’
b
Cl Br
a
b-半乳糖苷酶的a-肽段
Cl Br N Cl O N Br
一个强的选择标记。 具有允许外源DNA片段克隆的位点，并且位于选择标记基因区
4.
内，插入外源片段不影响质粒的复制功能。
5. 6.
能够导入寄主细胞，具备转化的功能。 操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质 粒载体。
质粒人工构建的目的
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点
噬菌体或病毒DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体DNA
l 噬菌体的生物学特性： 生物结构
l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成
l-DNA全长48502个核苷酸
l-DNA上至少有61个基因
约有20kb的区域为为噬菌体生长非必需的 ，可以缺失或被外源DNA片段所取代。
l 噬菌体生物学特性： 生物结构
黏性末端
穿梭载体(shuttle vector)
又称双功能载体，能在两种不同的生物体内复制的载体。 同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点 或酵母菌的自主复制序列 (ARS)，它既能在原核细胞中扩增又能在 真核细胞中复制和表达。
主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体 和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞 中表达，并可提高外源基因的表达效率。
亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。
质粒
质粒的基本特征
质粒的不相容性：分子机制 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的 拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定， 因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一 细胞内(亲和性质粒)
两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种
重要的大肠杆菌质粒载体
pUC18 / 19：
EcoRI SstI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT 396 452
拷贝数 2000 - 3000 / cell 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ’ 用于基因克隆和测序
段组成的载体。
克隆载体(cloning vector)
用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。 一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复 制子。
表达载体(expression vector)
使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可 将重组体 DNA 导入适合的受体细胞，使所载的目的 基因能够复制、转录和翻译。
溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因
第四章 基因克隆的载体
载体的功能及特征 质粒（plasmid） 噬菌体或病毒DNA 粘粒（cosmid）与噬菌粒
人工染色体载体
载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。
能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自
我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表
达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。
lacZ'
pUC18
2686 bp Apr
ori
pUC18也来自于pBR322，但只保留了复制起点和ampR位点，ampR基 因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在lacZ 基因内的一个小片段上。 pUC18的优点： 1）突变位点位于复制起点，提高了拷贝数。 2) 重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加amp和X-gal, IPTG，节约了一半的时间。 3）多克隆位点，可以使具有不同粘端的DNA片段插入载体，而不 必连接linker。 4）载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的，因此，插 入pUC系列的克隆DNA可以直接转入M13mp载体，可以进行DNA测序和 体外定点突变。
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到 50-100个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素， 可达到1000-3000拷贝。 有被动迁移的可能，不够安全。 抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。