发酵产酶.ppt

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微生物群体生长的规律 细菌数目的对数
稳
定
对
期
数
衰
调
期
亡 期
整
期
某种细菌的生长曲线
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时间
比较酶产生与细胞 生长的关系,可把 酶生物合成模式分 成4种类型:
酶生物合成的四种类型
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酶生物合成的四种类型
go
（1）同步合成型：
酶的合成与细胞的生长同步进行。（Fig）
（2）延续合成型：
酶的合成伴随着细胞的生长而开始，生长进入平 衡期后，酶又延续合成一段时间。（Fig）
RSr：Ri与Sr的结合物，可与操纵基因结合，而使 mRNA无法合成 。
退出 N：RNA的分解产物。
（2）酶的生物合成速率
dE/dt=K10M –μE
M：细胞中mRNA浓度（mol/L） E：细胞中酶浓度（U/L） μ ：细胞比生长速率（h-1）
对非生长偶联型,u=0
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（3）受分解代谢物阻遏的酶生物合成模型
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(八) 微生物酶的提取方法 (1)酶的粗提； (2)酶的精制。
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(九) 微生物产酶菌种的保藏 (1)斜面； (2)沙土管； (3)冷冻。
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代谢流分析与控制
Gl ucose
细胞膜
=======================
PEP
Pyr
CO2
代谢工G6P程是当今国际生化工程界Ribu的5P 新兴
第二章 酶的生产
第二章酶的生产
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第一节 微生物酶的开发
一、应用微生物开发酶的优点： (1)微生物生长快、周期短。生产能力 大，
能满足市场需求。 (2)微生物种类多，不同的环境下的微生物
以特殊的代谢方式分解利用不同的底物。为 酶品种的多样性提供了物质基础。 (3)通过基因工程使动植物细胞中的酶都能用微 生物细胞获得。因此，有计划地筛选菌种， 可以生产几乎任何一种酶。
需的酶类、ATP等；体积增大；分裂迟缓。 （2）原因：在新的环境，缺乏分解或催化相关底
物的酶。 （3）缩短和消除迟缓期的方法有：增加接种量、
采用最适种龄、选用繁殖速度快的菌种以及尽 量保持接种前后所处的培养基介质和条件一致。
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2.对数期 （1）特点：分裂速度最快、代时最短、代谢
活动旺盛、对环境变化敏感。 （2）作用：作为代谢、生理等研究的好材料
2.间接法
含氮量
生理指标法 含碳量
DNA含量测定
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（二）计繁殖数
直接计数法
血球计数法 涂片计数法
间接计数法
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涂布平板法 倒平板法
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四、微生物的群体生长
（一）无分支单细胞微生物的群体生长
1.特征：指数生长。
退出 G = t/n
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2.无分支单细胞微生物的群体生长曲线
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1.迟缓期 （1）主要特征：代谢活跃，大量合成细胞分裂所
即停止； （3）酶所对应的mRNA很不
稳定。
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延续合成型的特点
（1）酶的合成可以诱导，不受分解代谢物或产物的阻遏； （2）酶所对应的mRNA相当稳定，在生长平衡期后仍可继续较长 时间用于酶的合成。
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中期合成的特点 （1）酶的合成 受到反馈阻遏； （2）所对应的 mRNA不稳定。
退出Fra Baidu bibliotek
(六) 最佳产酶条件的初步确定 (1)培养方式的确定； (2)最佳培养条件组合； (3) 产酶特性(胞内酶、胞外酶)； (4)微生物酶收集的时间顺序；
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(七) 微生物产酶性能的进一步提高
(1)获得高产菌种的突变体； (2)利用代谢工程和代谢调节机理来提高酶产量； (3)运用基因工程技术将原有菌株中目的基因转 移到对生产环境更适应的菌株内，使其高效表 达；
Pyr
Al a
CO2 AcCoA
Val
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Oaa Mal
Suc
Isocit
CO2 NADP H
aKG
SucCoA
CO2
NH4 + AT P
Gl u Gl n
细胞膜
Gl u
Gl n
=====================================
谷氨酸与谷氨酰胺产生代谢网络图
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谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸代
细胞产酶模式不同，产酶速率与细胞生长动力学关系也不同。
讨论:
（1）同步合成型：生长偶联型 β=0，dE/dt=αµX （2）中期合成型：特殊生长偶联型 β=0，dE/dt= αµX
有阻遏存在时， α =0，无酶产生 dE/dt= 0 退出 阻遏解除后才开始合成酶.
dE/dt=(αµ+β)x
（3）滞后合成型：非生长偶联型， α=0 , dE/dt=βX

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dRi/dt=k3DNA-k6RiSr+k-6RSr- μRi
dRSr/dt=k6RiSr-k-6RSr- μRSr
实际发酵过程非常复杂,以上模型进行 修正和发展才可;
动力学模型参数的估算是一项重要 又复杂的问题;
参数值是通过大量实验数据分析估 算出来的;
数据呈随机性,有时借助数学方法和 计算机.
选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。 酶活的测定方法的建立对其很重要。
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(五) 对复筛获得菌株的要求 (1)不是致病菌； (2)菌株不易变易和退化； (3)不易感染噬菌体； (4)微生物产酶量高； (5)酶的性质符合应用需要，最好是胞外酶； (6) 便于分离和提取，得率高； (7)微生物培养营养要求低。
同步培养法：使培养基中所有微生物细胞 处于相同的生长阶段的培养方法。
同步生长：培养物中所有的微生物细胞都 处于同一生长阶段，并能同时分裂的生长 方式。
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三、微生物生长繁殖的测定方法
（一）测生长量
测体积（离心）
1.直接法
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称干重
离心法（单细胞微生物） 过滤法（丝状微生物）
比浊法（分光光度计）
dx/dt=(µ-D)X
D：稀释率
D=0,分批发酵; D<u ,细胞浓度增加; D = u,细胞浓度恒定; D>u细胞浓度下降,S升高,u回升;
D>um X趋于零;
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Monod方程与米氏方程相似,参数um与Ks也 可由双倒数作图法求出.
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双倒数作图法
三、产酶动力学
研究细胞产酶速率及各因素对其的影响.
假设细胞中K1和DNA浓度为常数. mRNA浓度: dM/dt=k7CC-k11N- μM cc浓度: dCC/dt=k4CRP·cAMP-k-4CC- μCC CRP浓度: dCRP/dt=k1DNA-k4CRP·cAMP+k-4CC- μ·CRP
(注：M、CC、CRP与细胞生长有关）
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（4）诱导系酶合成模型 （CRP与CAMP复合物的浓度足量或过量）
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二、微生物酶开发的一般程序
(一) 样品的采集 采样的目的、采样地点、采样方法及采样的数
量。 (二) 菌种的分离
培养基的确定、培养条件的确定。
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(三) 菌种的初筛 (1)用简单的定性反应进行初筛； (2) 最初分离阶段给予特殊的培养基或培养条 件，让目的菌株大量繁殖。
(四) 菌种的复筛 初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的是筛
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第五节 固定化细胞发酵产酶
固定化细胞：
又称固定化活细胞、固定化增殖细胞,用各种方法固 定在载体上又能进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。 是70年代后期(1978)发展起来的技术; 在发酵生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等胞外酶方面 取得了成功。
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本节主要内容： 一、固定化细胞发酵产酶的特点； 二、固定化细胞生长和产酶动力学； 三、固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制。
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微生物群体生长的规律
生长曲线代表在新的适应环境中生长、分裂直至 衰老、死亡全过程的动态变化规律。分为迟缓期、 对数期、稳定期和死亡期四个主要的时期。 生长曲线的不同时期反映的是群体而不是单个细 胞的生长规律。 认识和掌握微生物的生长曲线有重要的实践意义。 如设法缩短迟缓期、延长对数期以及在稳定期收 集菌体。
假设K2和DNA浓度为常数, dM/dt=k8RSi-k11M- μM dRSi/dt=k5RASi-k-5RSi- μRSi 退出 dRA/dt=k2DNA-k5RASi+k-5RSi- μRA
（5）阻遏系酶合成模型
K3和DNA浓度设定为常数：
dM/dt=k9Ri-k11M- μM
（4）延续合成型：部分生长偶联型， α≠0， β≠0 dE/dt= αµX+βX
有关模型参数一般通过线性化处理及尝试 误差法求出.
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附:3、微观产酶动力学
（1）细胞内酶生物合成的一般模型
（cf.P54)
RA、Ri：有、无活性的阻遏蛋白；Si、Sr：诱导物和阻遏物； cc：环腺苷酸接受蛋白CRP与环腺苷酸CAMP的复合物； RSi：RA与Si的结合物，不与操纵基因结合；
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选择与改造
（1）选择最理想的酶合成模式——延续合成型； （2）改造非理想模式
A、同步合成型：适当降低发酵温度，尽量提 高相应的mRNA的稳定性；
B、滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢 物阻遏，使酶合成提早开始；
C、中期合成型：努力提高mRNA稳定性，解 除代谢物阻遏物。
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二、细胞生长动力学
主要研究细胞生长速度及其受外界环境影响的规律。 1950年,法国的Monod首先提出表述微生物生长的动力 学方程,细胞生长速率与细胞浓度成正比.
Rx =dX/dt= µX
u: 比生长速率
只存在一种限制性基质时:
退出Monod方程是基本的细胞生长动力学方程; 从不同情况出发对其进行修饰.
连续全混流反应器发酵过程中,稳态时游离细胞连 续发酵的生长动力学方程:
和发酵生产中用作种子的最佳菌龄。
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3.稳定期
（1）特点：新生的细胞和死亡的细胞数目相等、 总菌数达到最大值、代谢活力钝化。
（2）原因：营养物质的逐渐消耗以及代谢废物的 积累抑制了生长。
（3）功能：产生次生代谢产物（抗生素、生物碱、 色素等）、芽孢；对稳定期的研究发展了连续培 养技术。
4.死亡期
特点：活的细胞数目以对数速率急剧下降、细胞 裂解或自溶。
1、分类
宏观产酶动力学（非结构动力学）: 从整个发酵系统着眼,研究群体细胞的产酶速率 ； 微观产酶动力学（结构动力学）: 从细胞内部着眼,研究细胞中酶合成速率。
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2、宏观产酶动力学方程通式
dE/dt=(αµ+β)x
X—细胞浓度； u—细胞比生长速率； —生长偶联的比产酶系数； —非生长偶联的比产酶速率。
利用除氧铜柱在350℃下 与氧反应来制备高纯度氮， 再用此高纯度氮去驱除培 养基配制、分装过程中各 种容器和小环境中的空气， 使培养基的配制、分装、 灭菌和贮存，以及接种、 稀释、培养、观察、分离、 移种和保藏等操作的全过 程始终处于高度无氧的环 境下，从而保证了严格厌 退出 氧菌的存活。
二、微生物的同步生长及同步培养方法
交叉学科，F6P它将计算机技术、自Xyl5动P 控制、Rib基5P
因操作技1术,6FD与P 发酵工程结合起来，研究生产
过程D中HAP细胞代谢GAP流的分布，利用E4P代谢控制Sed理7P
论和网络刚性理G3P论寻找限制代谢流率的代谢
瓶颈和代谢网络中制约转化率提高的酶反应，
PEP
为定向菌CO种2 选育和发酵控制Lac提供思路。
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细胞生长曲线
附：背景知识——微生物生长的研究
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一、微生物的培养方法
获得单细胞 （纯培养）
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好氧培养
固体培养法 液体培养法
摇瓶培养 发酵罐
厌氧培养（厌氧罐技术、Hungate滚管 技术、厌氧手套箱技术）
发酵罐
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亨盖特滚管技术（hungate roll-tube
technique）：

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滞后期合成型的特点
（1）在对数生长 期不合成酶（可能 是受到分解代谢物 阻遏的影响）； （2）所对应的 mRNA稳定性高。
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影响酶生物合成的模式的主要因素是：
（1）mRNA的稳定性； （2）培养基中阻遏物存在与否。
规律：
（1）mRNA稳定性高，细胞停止生长后继续合成其所对应的酶； （2）mRNA稳定性差，酶的合成随着细胞停止生长而终止； （3）受某些物质阻遏，细胞生长一段时间或在平衡期后（解 除阻遏），开始合成酶。 （4）不受某些物质阻遏，酶的合成随着细胞生长而同步增长。
谢网络图
第二节 酶发酵动力学
发酵动力学
研究发酵过程中细胞生长速度,产物生成速度及环境 因素对这些速度的影响.
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酶发酵动力学研究意义:
了解酶生物合成模式, 发酵工艺条件优化控制, 提高酶产量.
本节主要内容:
一、酶生物合成的模式
二、细胞生长动力学
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三、产酶动力学
一、酶生物合成的模式
细胞生长一般经4个阶段,如图:
（3）中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，进入平
衡期后，酶的合成随之停止。 （Fig）
(4) 滞后合成型
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当细胞进入平衡期后，才开始并大量积累酶
（Fig）
同步合成型的特点
（1）酶的生物合成可以诱 导，不受分解代谢物
阻遏和反应产物阻遏； （2）当除去诱导物或细胞 进入平衡期后，酶的合成立