测序引物的要求

普通测序及测序相关基础知识——基本概念
• DNA结构示意图——单核苷酸及DNA的二级结构——4种脱氧核苷酸分子 通过3’，5’—磷酸二酯键连接形成的直线型或环型多聚体。
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普通测序及测序相关基础知识——基本概念
• DNA结构示意图——DNA的三级结构：双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形 成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。
料。
DNA分子极为庞大(分子量一般至少在百万以上)，主要组成成分是腺嘌 呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧 核苷酸（简称A、T、C、G）。DNA存在于细胞核、线粒体、叶绿体中， 也可以以游离状态存在于某些细胞的细胞质中。大多数已知噬菌体、部 分动物病毒和少数植物病毒中也含有DNA。
测序知识概述
Content
• 普通测序及测序相关基础知识 • 普通测序生产流程介绍 • 困难模板测序相关知识 • 困难模板测序生产流程介绍 • 测序简单问题解答
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普通测序及测序相关基础知识——基本概念
• 什么是DNA以及DNA测序 • 又称脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材
除了RNA(核糖核酸)和噬菌体外，DNA是所有生物的遗传物质基础。生 物体亲子之间的相似性和继承性即所谓遗传信息，都贮存在DNA分子中。
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普通测序及测序相关基础知识——基本概念
• DNA的结构 • DNA共有四级结构 • 一级结构：由多个4种脱氧核苷酸分子通过3’，5’—磷酸二酯键连接形成
• 动画演示：http://www.bbioo.com/video/2005/43.htm
• 目前测序需要使用的仪器 • A.PCR扩增仪 • B.3730XL全自动荧光测序仪
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普通测序及测序相关基础知识——测序模板的要求
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Hale Waihona Puke Baidu
普通测序及测序相关基础知识——基本概念
• DNA结构示意图——DNA的四级结构： DNA与蛋白质形成的复合物。如 染色体（质）。
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普通测序及测序相关基础知识——基本概念
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普通测序及测序相关基础知识——测序模板的要求
• 注意事项: • PCR产物直接测序成功的关键是PCR产物的纯度，所以我们提倡用胶回收
PCR产物。如果有几条PCR产物长度相近，用电泳胶也无法分开时，此时 的PCR产物直接测序会出现双峰，这种情况建议把PCR产物克隆后测序。 PCR已纯化产物请用水稀释不要用elution buffer。 • PCR产物直接测序成功的另一要因是引物。不是能做PCR反应的引物便一 定能测序。测序用引物要求较高,引物的3‘端必须与模板完全配对，含有 Mix碱基的引物一般不能测序 (特别是3’端)。此外，测序引物长度一般为 20个碱基左右，GC含量必须在50～60%左右，TM值在55-65度之间。尽量 保证测序引物的纯度。并且引物需要用水而非TE溶解。 • PCR未纯化产物最好不要添加染料。
• 测序分析软件 • A. Sequencing Analysis 5.2，用于将测序原始数据转换为峰图文件 • B.DNAStar,用于将测序得到的结果进行拼接 • C.Chromas，用于显示DNA测序峰图文件
• 测序模板的要求
• PCR产物直接测序 • PCR已纯化产物：
提供切胶回收纯化后的PCR产物20ul (浓度大于50 ng/μl), 并请提供浓度 (浓度须正确) 大于3.2 pmol/μl的测序引物10～20 μl（具体体积视客户反应数相应增加）。 • 未纯化PCR产物： • 提供至少40ulPCR扩增原液，送样前取2ul经琼脂糖胶鉴定目的片断为明亮的一条带, 同时请提供浓度 (浓度须正确) 大于3.2 pmol/μl的测序引物10～20 μl （具体体积视 客户反应数相应增加）。
• DNA测序原理 • 目前DNA测序的原理是Sanger双脱氧链末端终止法，简单来说，就是单引
物扩增的PCR反应，但是将PCR反应体系中的dNTP换成了带有荧光标记的 ddNTP和dNTP的混合物。 • 目前最普遍的DNA测序技术是采用四色荧光分别标记四种ddNTP. • 一个样品的测序反应只需在同一反应体系中同时加入四种ddNTP. 产物无 须分离即可在一个泳道中电泳. • 序列的读取依靠检测器对不同荧光的区分.并需要通过软件系统的分析.
的直线型或环型多聚体。 二级结构：在碱基互补配对的基础上形成的DNA双螺旋结构。 三级结构：在二级结构上，DNA双螺旋结构通过折叠和扭曲所形成的特 定构象。如超螺旋等。 四级结构：指DNA与蛋白质形成的复合物。如染色体（质）。
——DNA测序就是测定DNA的一级结构
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• 含有噬菌体DNA的样品
• 公司均不提供此类抽提服务，请客户提供质粒形态的样品20ul ，浓度大于50 ng/μl。务必需要客户注明是含有噬菌体DNA的质粒。
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普通测序及测序相关基础知识——测序模板的要求
• 质粒DNA的测序 • 质粒样品：
请注明载体名称及是否含有特殊结构、插入片段的长度及插入片段的酶切位 点情况、请提供至少15ul以上的提纯的质粒DNA ，浓度大于200 ng/μl（体积视 客户反应个数适当增加）。 • 含有质粒的菌液/沉淀菌体/平板菌/穿刺菌样品： 请注明菌体的种类及抗生素抗性的情况、所含载体的名称及结构情况、插入 片段的长度及插入片段的酶切位点情况、如果有特殊抗生素添加比例或培养 条件特殊须注明。