实验十二 氨基转换反应的定性鉴定

纸层析检测
纸层析是以滤纸为载体，用一定的溶剂系统展开而达到分 离、分析目的的层析方法。此法可用于定性，亦可用于分离制 备微量样品。
20ml展层剂饱和20min
点样
展层2小时左右
显色
Rf值的定义
物质分离后在图谱上的位置，可用比移值 Rf来表 示，Rf值的定义是：从溶质层析的起点(原点)到 层析斑点中心的垂直距离与从原点到溶剂流动的 前沿的垂直距离的比值：
氨基转换反应
试管号 酶液 15%三氯乙酸 1 2 10d 10d 10d,10min
Βιβλιοθήκη Baidu
1%Glu 10d 10d
1%丙酮酸 10d 10d
0.1%碳酸氢钾 0.05%碘乙酸 10d 10d 5d 5d
37℃-40℃反应1.5小时，经常摇动确保反应进行完全。保温 后取出第2号试管，加入15%三氯乙酸10d，沉淀蛋白终止反 应。将两只试管中的内容物转移到离心管中，2500rpm/min 离心5min，将上清转移到干净的试管中备用。
Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离
两相体积比在同一实验情况下是不变的，所以 Rf 值的主要决定因素是分配系数 (α)。对于每一 物质在一定条件下α值是固定的，因此Rf值为其特 征常数，可做为定性鉴定的参考数值。
影响 Rf值的主要因素
1.物质结构对于Rf值的影响 2.溶质与溶剂间的相互作用对Rf值的影响 3.pH对Rf值的影响 4. 滤纸对Rf值的影响 5.温度对Rf值的影响
转氨基反应的定性鉴定原理
37℃保温1.5小时 氨+还原茚三酮 氨+还原茚三酮
水和茚三酮
紫色物质
预期的实验结果
思
考
• 影响转氨基作用的因子有哪些？ • 实验过程中应注意些什么？ • 网上查询有关转氨酶的研究动态。
转氨基反应的定性鉴定原理
• 无色物质的层析图谱可用光谱法 (如核苷酸类物质用紫外 光照射)或显色法鉴定。氨基酸纸上层析图谱常用的显色 剂有茚三酮、吲哚醌。 • 本实验采用茚三酮为显色剂。茚三酮显色反应受温度、 pH，时间影响较大。如果要使结果重复，必须严格控制 上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不显出颜色。 样品中含大量盐时显色点上会出现白斑，空气中其它的杂 质如氨，硫化氢或酚等皆会影响显色结果。铜离子可以与 氨基酸-茚三酮显色物形成络合物，颜色较稳定，用硫酸 铜乙醇溶液洗脱层析后的显色斑点，可以通过比色法定量 测定氨基酸含量。
纸层析检测原理
• 滤纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。 滤纸的成份是纤维素，纤维素的— OH基为亲水 性基团，因此可吸附一层水或其它溶剂作为固定 相。通常把有机溶剂作为流动相。当将溶质样品 (被分离物)点在滤纸的一端后，该物质溶解在吸 ( ) 附于支持物上的水分子或其它溶剂分子的固定相 中，有机溶剂自下而上移动，称为上行层析。流 动相流经支持物时与固定相对溶质进行连续的抽 提，物质在两相间不断分配的结果即得到分离。
3、氨基转换反应的定性鉴定
学习一种鉴定氨基转换反应的简便方法 掌握纸层析的原理和操作技术 体外氨基转换反应原理
实验原理
• 转氨酶能催化α -AA的氨基与α -酮酸的α-酮基互换，生成 一种新的氨基酸和新的α-酮酸，这种反应称为转氨作用。 它在体内蛋白质合成与分解等中间代谢中，在糖、脂肪、 蛋白质之内物质代谢的相互关系、相互转化上都起着重要 作用。 • 任何一种氨基酸的转氨基反应都由专一的转氨酶催化，其 最适pH接近7.4。其中Glu-草酰乙酸转氨酶及谷氨酸-丙酮 酸转氨酶活力最强。当机体发病时，如肝炎、心肌梗塞等， 血清中转氨酶活力显著增加。测定转氨酶活性的方法有分 光光度法、纸上层析、光电比色法。 • 为防止丙酮酸被组织中其它酶氧化或还原，可加碘乙酸或 溴乙酸以抑制酵解或氧化作用。