植物组织培养第4章植物原生质体培养及细胞融合
细胞工程___第四章原生质体与细胞融合用
五.原生质体鉴定
1)低渗爆破法：无壁吸水向外膨胀直至胀破，是无形 的。有部分细胞壁，则原生质体从破碎后留下的残 迹仍保持半圆形的细胞壁。
2)荧光染色法:将原生质体放大离心管中，加入0·7mo l/L甘露醇配置的0.05%~0.1%荧光增白剂溶液，染 色5-10Min ，离心、洗涤除去多余的染料，在荧光 显微镜下观察(波长3600-4400A0)。绿色光显示纤维 素的存在，发出红色光的没有纤维素的真正的原生 质体。
4、细胞质膜稳定剂
细胞质膜稳定剂，能防止质膜破坏，提高原生质 体的稳定性与活性，促进细胞壁形成及细胞分裂等。
常用质膜稳定剂有：
葡萄糖硫酸钾、MES、CaCl•2H2O、KH2PO4等。 MES:2-( N-morpholino) ethanesulfonic acid 2-( N-吗啉代)乙磺酸
作用：不但具有质膜稳定作用，还具有缓冲作用，调 节pH值。
(4)氧电极法:有活力的原生质体在光照下会进行光合 作用而放出氧气，在没有光照的条件下进行呼吸而 耗氧。因此，可以采用氧电极来测定氧的变化来原 生质体是否具有活力。
第二节 细胞融合
一、细胞融合的概念
细胞融合，也称原生质体融合，或体细 胞杂交。是指两种异缘（种间、属间）原生 质体，在诱导剂诱发下或电冲击下，发生膜 融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞， 进一步发育成杂种植物体。
甘露醇
0.6 M
CaCl•2H2O
0.5%
MES
5.0 mM
pH
5.8
6、原生质体的游离与纯化(以叶为例)
1）、原生质体的游离
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将 去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在无 菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。如果去表 皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。 对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在 酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉， 留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。
04-植物原生质体的制备及融合-卢文
原生质体的制备及融合生31 卢文2003012377一、实验目的：a)学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体形态。
b)学习植物原生质体的融合技术，观察融合原生质体时其形态及变化。
二、实验原理：详见讨论。
三、实验用品：显微镜、擦镜纸、剪子、镊子、小平皿、吸管、直式漏斗、300目尼龙网、10ml离心管、载玻片、盖玻片。
四、试剂：a)洗涤液：甘露醇0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 2mMpH=5.6b)酶混合液：纤维素酶1%果胶酶0.5-0.7%甘露醇0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 7mMMES 3mMpH=5.6c)PEG溶液：PEG-6000 40%CaCl2·2H2O 3.5mMKH2PO4·H2O 0.7mM葡萄糖0.3mMpH=5.8d)高Ca，高pH洗涤液：CaCl2·2H2O 100mMTris 50mM山梨醇100mMpH=10.5e)蔗糖溶液：20%五、实验步骤：a)原生体的制备i.将新鲜花瓣用蒸馏水洗干净，用滤纸吸干表面水分。
ii.用尖头镊剥去木料的下表皮或将其剪成小细条，加入几滴酶液恒温振荡半小时。
iii.酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，加入少量洗涤液定容至4ml，此时，未被酶解的大块组织留在尼龙网上。
iv.500rpm离心5分钟，弃去上清液，加洗涤液至约2ml吹打均匀。
500rpm5min重复离心一次，彻底去除酶液。
v.加8滴洗涤液，悬浮原生质体。
vi.镜检，检察原生质形态和浓度，看看是否有碎片，本试验中碎片较少，故未做蔗糖漂浮。
b)PEG融合：i.在小平皿内各滴三滴原生质体悬液，静置沉淀。
ii.各缓缓滴加一滴PEG在其中两滴原生质体悬液上，iii.在另一滴上滴加一滴高Ca2+高pH洗液。
iv.镜下观察，1-2分钟后，在原先加入PEG的一滴悬液上加入一滴高Ca2+高pH洗液。
4原生质体培养和融合
1、 离心沉淀法
原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原 生质体沉于底部。
步骤： • 第一步：原生质体溶液用400目网筛过滤。 • 第二步：离心（500~1000r/min离心5~6min）。 • 第三步：吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）
重新悬浮，再离心沉淀。如此2~3次。 • 第四步：用原生质体培养液洗1次，收集原生
对幼叶来说，酶浓度较低：0.5％-1％纤维 素酶，果胶酶(0.2％-0.5％); 酶量少
对愈伤组织、悬浮细胞：纤维素酶、果胶 酶的浓度要提高到1％或2％。酶量大 酶液PH值：5.4 - 5.8
PH高，酶活性低 PH低，原生质体损坏多
2.3 酶液渗透压
• 裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下， 才既不涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构。 因此在酶液中须加入渗透压稳定剂来代替细胞壁 对原生质体起保护作用。
•常用的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、 山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。
目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地 维持渗透浓度。而蔗糖等易被原生质体吸收利用， 降低渗透浓度，故不常用。
2.4 材料预处理 (暗处理，预培 养和低温处理)
在酶处理前，常把供体组织置于合适浓 度的稳压液中，预质壁分离约一小时后再用 酶液处理。
2-6 其它
酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类
保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力
2-7 原生质体分离过程：一步法 （以烟草叶片为例）
• 第一步：预处理即对烟草植株限制供水
• 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥 去外表皮切成4cm的小块
• 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶 0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol CaCl2. PH5.6
原生质体融合操作方法
原生质体融合操作方法
原生质体融合是将两个或更多的细胞融合在一起，以形成单一的细胞。
在实验室中，原生质体融合可用于合成杂交细胞或研究细胞膜蛋白质交互作用。
以下是一种常用的原生质体融合操作方法：
1. 制备原生质体：收获新鲜的植物细胞并环绕其周围的细胞壁。
用酶类解除细胞壁以获得原生质体。
2. 制备混合物：在离心管中将两种原生质体混合并加入缓冲液。
3. 让细胞融合：通过高渗透压或电脉冲使膜破裂或局部破损，让细胞形成互通。
4. 分离融合物：将融合物分离出来，并放在一个合适的培养基上培养。
5. 检测融合结果：使用显微镜观察细胞是否真正融合，或使用特定的抗体标记来检测融合后的细胞表面分子。
需要注意的是，原生质体融合需要谨慎操作，避免损坏细胞结构或引入杂质。
在实验中，需要仔细选择不同类型的原生质体，以确保它们能够融合。
遗传学ppt课件第4章 原生质体培养及融合配色
缺点：由于高渗溶液对原生质体有伤害， 因而活力高的原生质体较少。
B、离心沉淀法
酶解产物 +原生质 体培养基
0.45mol/L甘露醇 400g，5min
碎片带
原生体
利用比重差别原理，在甘露醇溶液中低速离心，使原生质体沉积在试管底部，然 后再用Percoll飘浮一次。
6、原生质体的游离（分离）与纯化 1）原生质体的游离
经酶液处理后，细胞壁被降解，释 放出球状原生质体。为使原生质体从组 织上解离下来，酶解的最后2小时需轻 度振荡，速度为45转/分（rpm）。
酶解液
酶解后的产物包括：
完整原生质体
破碎的原生质体、未去壁的细胞（团）、细胞器及碎片 酶及其它不利于原生质体培养的试剂。
五、原生质体培养 培养密度很重要（原因）：一般以
104-105个/ml为宜。 一般采用的培养方法：液体培养基
→ 固体增殖培养基 → 再分化培养基 → 器官、胚胎或植株分化。
培养方式详见第二节。
1）液体培养
分成三个阶段
➢ 培养基Ⅰ：1/2无机盐、正常有机成分、适量的水 解酪蛋白、适量的激素、1% 蔗糖、0.4-0.6 M甘露 醇，pH 5.8
第四章 原生质体培养及融合
名词术语：
➢ 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是 一个被质膜所包围的裸露细胞。
➢ 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程 中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些 较小的原生质体，称为亚原生质体。 它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是 只有1条或少数几条染色体，具体情况有：
一词。 ➢ 1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效
4.原生质体培养与细胞融合(植物组织培养)
原生质体培养与细胞融合第一节原生质体培养一、原生质体的培养概况1、概念：植物的原生质体：指除去细胞壁以后的裸露细胞。
原生质体培养：是将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进而细胞进行持续分裂形成细胞团，进一步生长形成愈伤组织或胚状体，最后分化或发育形成完整植株的过程。
原生质体培养特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
原生质培养首先在烟草上获得成功。
2、原生质体培养的意义①比较容易摄取外来的遗传物质（壁中有活性很强的核酸酶）—研究植物原生质体培养和再生植株技术，有可能采用细胞遗传工程的方法培育出新品种。
②便于进行细胞融合，形成杂交细胞—可广泛地重组植物界优良遗传性状，创造新物种和新品种（如能固N的禾本科植物，高光效植物，高抗植物）③原生质体可作为遗传理论研究的材料—细胞生物学、植物生理学、遗传学、分子生物学等，如细胞起源、壁生物合成、胞间相互作用、不亲和性、激素作用机理等3、原生质体培养程序取材→预处理→分离→纯化→活力检测→培养→细胞壁再生→细胞分裂分化→愈伤组织→愈伤分化→再生植株取材：大田叶片（消毒灭菌）、无菌试管苗叶片、愈伤组织或悬浮细胞预处理：黑暗、低温、叶片萎蔫处理、预培养、和不同光质照射等，可提高原生质体产量和代谢活力。
二、原生质体的分离和纯化1 原生质体的分离叶肉组织是制备原生质理想的材料，遗传性状一致。
细胞壁主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质等。
分离原生质的方法主要有以下两种：机械法和酶解法（1）机械法①首先将细胞放在高渗的糖溶液中（水势低），使细胞发生质壁分离（细胞失水），原生质体收缩成球状；②破碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。
（缺点）获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。
一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。
植物原生质体的制备及融合
显微镜、低速台式离心机、水浴锅；直式漏斗、离心管；眼科镊等
▪ 试剂
洗涤液 混合酶液 PEG溶液 高钙高pH溶液 20%蔗糖溶液等
原生质体的分离制备
▪ 取新鲜花瓣，以蒸馏水清洗，用吸水纸吸干多余水分。 ▪ 用尖头镊剥取材料的下表皮（带有红色的叶肉细胞），将
下表皮创面朝下浸在酶液中，27℃酶解1hr（振荡）。
▪ 所用小平皿、离心管、漏斗、小镊子等自来水 冲洗并以蒸馏水洗干净后，控干
▪ 托盘及其中的其他物品用自来水冲洗干净
▪ 实验中
植物原生质体的 制备及融合
背景
▪ 原生质体分离 ▪ 细胞融合
▪ 病毒诱导融合（动物细胞） ▪ PEG诱导融合 ▪ 电融合
背景
▪ 融合过程
▪ 细胞的接触 ▪ 细胞质膜的融合 ▪ 细胞质的融合 ▪ 遗传物质的选择（异核体的核融合）
应用
▪ 杂交育种
▪ 单克隆抗体技术
实验器材、试剂等
▪ 材料
剑兰（唐菖蒲）花瓣
原生质体的分离制备
镜检，0 μm
50 μm
原生质体的分离制备
▪ 过滤，以去除大块组织。 ▪ 700rpm离心5分钟，弃上清。 ▪ 加入3mL洗涤液吹打均匀，700rpm离心5分钟，弃上清。 ▪ 加入少量洗涤液（一两百微升即可或由原生质体的量来决
定），悬浮原生质体。 ▪ 镜检，如果碎片较多，可采取蔗糖漂浮方法去除碎片。
▪ 比较分析实验组与对照组之间的差异及 原因
▪ 思考：原生质体制备和融合过程中各种 试剂的渗透压？
提醒
▪ 蔗糖漂浮
▪ 务必留下足够进行融合的细胞悬液 ▪ 使用5ml离心管 ▪ 配平
▪ 35mm dish用于酶解，60mm dish用于融合观察
原生质体培养与融合
飘浮法
采用比原生质体密度大的高渗溶 液（蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生质体漂浮在液体表层的纯 化方法。 优点： 可以避免分离的原生质体因震 荡被组织碎片撞击而破损。 所用药品简单，成本低。 缺点及补救措施： 对离心力要求比较严格，掌握不 好，原生质体则不易漂浮。可采 用不同浓度和不同离心速度分次 漂浮的方法。
影响原生质体培养的因素
培养条件
温度，光照
植物材料和基因型
柑桔，葡萄，桃
供体细胞的生长同步性
原生质体再生过程
原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质 体在适当的培养方法和良好的培养条件下， 很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细 胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分 化出完整植株的过程。 细胞壁再生 细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 植株再生
胡萝卜培养 6d 细胞
8~10d形成细胞 10~ 5~30 团，4周后形成 20 胚状体
矮牵牛愈伤 4d 组织 2~ 油菜叶片 3d
10
马铃薯子叶 48h 46.1 马铃薯花粉 2h
2周后形成20~25 个细胞的细胞团 15d形成细胞团 28d愈伤组织 9~10d形成16个 细胞的细胞团 15d形成细胞团
影响原生质体培养的因素
原生质体的活力
原生质体的起始密度
适宜密度在104~105个／ml左右。在烟草叶原生
质体培养中，密度低于103个／ml时，细胞只能 分裂一、二次，密度在104个／ml以上，植板率 常显著提高。
渗透压稳定剂 培养基营养
原生质体培养经常使用的KM-P培养基就
是以B5培养基为基础；N6培养基则以MS 培养基为基础 改进的。
渗透压稳定剂
植物组织培养技术
植物组织培养技术第一章绪论第二章植物组织培养实验室组成、仪器设备及无菌操作技术第三章植物组织培养基本原理第四章器官培养技术第五章植物胚胎培养第六章花粉及花药培养第七章细胞及原生质体培养第八章组培培养技术在中药学上的应用第一章绪论一、植物组织培养的概念1. 概念植物组织培养（Plant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。
2.主要特征（1）在培养容器中进行；（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。
（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。
二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。
1、根据培养材料不同分为：（1）完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。
（2）胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。
（3）器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。
（4）组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。
（5）细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。
（6）原生质体培养（Protoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。
2、根据再生途径分为：（1）器官发生途径（Organogenesis）：直接器官发生途径：植物器官可以直接由外植体上诱导。
如茎尖培养。
间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化（dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）过程而形成新的组织和器官的过程。
植物细胞原生质体融合方法
植物细胞原生质体融合方法
植物细胞原生质体融合方法：
聚乙二醇（PEG）介导的融合：使用聚乙二醇（PEG）将原生质体暴露在高渗透性的聚乙二醇溶液中，促使原生质体相互融合。
电脉冲介导的融合：通过将原生质体置于电场中，施加电脉冲使质膜产生短暂的孔隙，使得两个原生质体可以融合。
融合诱导剂介导的融合：一些融合诱导剂，如聚乙二醇和钙离子融合剂，可以在一定程度上促进原生质体的融合。
微操控介导的融合：在实验室条件下，可以使用显微操控技术，如显微注射器或显微操作夹，将两个原生质体精确地放置在一起，使它们发生融合。
基因枪介导的融合：基因枪将DNA或原生质体粒子投射到目标细胞中。
植物组织培养(全)
胚培养是器官培养的一种。选用的外植体是成熟或未成熟的胚进行离体无菌培养。其具体方法是将取出放在液体或固体培养基上培养，由于胚包含在胚珠和子房里，因而进行胚胎培养时，常常是将胚珠和子房放在培养基上培养。
胚培养用途：1.拯救胚2.研究胚的发育营养研究3.一些特殊的领域的研究。
(4)细胞和原生质体培养
二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。
全能性体现的两个过程
一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历两个过程，即首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。
再分化的过程有两种方式：
一是器官发生方式 二是胚胎发生方式
2.激素（植物生长调节剂）调控
后来证明，激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同，因而对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同。
⑤1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。
当把茎尖接种在含有细胞分裂素的培养基上以后，将可使侧芽解除休眠状态，而且，能够从顶端优势下解脱出来的不只是那些既存于原来茎尖上的腋芽，此外，还有由原来的茎尖在培养中长成的侧枝上的腋芽，结果就会形成一个郁郁葱葱的结构，里面包含了数目很多的小枝条，其中每个小枝条又可取出来重复上述过程，于是在相当短的时间内，就可以得到成千上万的小枝条。当把这些小枝条转够到另外一种培养基上诱导生根以后，即可移植于土壤中。
奠基阶段（从20世纪30年代中至20世纪50年代末）
30年代中期，植物组织培养领域两个重要的发现，其一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素--一种天然的生长调节物质。
植物细胞原生质体的制备与融合
植物细胞原生质体的制备与融合。
1、相关概念：（1）原生质体：是指那些已去除全部细胞壁的细胞。
细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。
此外，在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体称为原生质球或球状体。
（2）原生质体融合：即体细胞杂交。
用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。
若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。
2、原生质体的制备：在植物组织里，原生质体被坚硬的细胞壁包裹着，而且由于果胶质等使细胞相互紧紧粘连在一起。
在愈伤组织中，这种粘连相对松些；在细胞悬浮培养物中，只有存在细胞团的情况下，有轻度的粘连。
如果破除这种粘连作用，即可使细胞分离开来，进一步去除细胞壁，就能使裸露的原生质体游离出来。
游离效率的高低主要与植物材料和酶混合浓的组成有关。
基本程序如下：取材→除菌→酶解（加酶、渗透压稳定剂）→原生质体的收集与纯化→洗涤→原生质体活力的测定。
（1）取材与除菌：原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。
但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣。
因为，由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。
常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。
对外植体的除菌要因材而异，悬浮培养细胞一般无需除菌。
对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2-3次，然后浸入70%酒精消毒后，再放进3%次氯酸钠处理。
最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。
（2）酶解：现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。
①配制酶解反应液:反应液应是一种pH值在5.5-5.8的缓冲液，内含纤维素酶0.3%-3.0%以及渗透压稳定剂，细胞膜保护剂和表面活性剂等。
③酶解：除菌绿。
反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。
经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。
原生质体培养及融合
主要方法： 漂浮法、界面法和沉降法等。
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A. 漂浮法：使用的飘浮剂有蔗糖、Percoll（珀可，是由聚乙烯
吡咯烷酮包被的SIO2颗粒的无菌胶体悬液）、Ficoll（菲可，水溶 性聚蔗糖）。
原理：采用比原生质体比重高的渗透溶液，使原生质体漂浮在 溶液表面，具体方法为：
子叶/叶片 下胚轴
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五、原生质体培养
培养密度很重要（原因）：一般以104-105个/ml为宜。 常用的培养方法：液体浅层培养、固体平板培养、 固－液双层培养
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1) 原生质体的培养方法
液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进 行培养。
优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养 基和转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现 象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个 细胞的发育情况。
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4、用于细胞器的分离与转移
由于原生质体没有细胞壁的障碍，可以进行亚细胞水平的操作 研究。如叶绿体、线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄取细胞 器后进行培养，获得再生植株，根据再生植株的表现，即可进行遗 传分析，研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。
也可以通过细胞器的转移，使物种获得相应的性状。
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胞质体( cytoplast ) ：不含细胞核，只有细胞质。 微小原生质体(microprotoplast)：只有1条或几条染色体的情况。
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细胞膜
细胞壁
原生质体
植物细胞
细胞核
染色体
微小原生质体 小原生质体 （核质体） 胞质体
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原生质体融合：也称为细胞融合或体细胞杂交。是指将植物的不同 种、属甚至科间的原生质体，通过人工方法诱导融合，然后进行离 体培养，使其再生成为杂种植株的技术。
植物原生质体培养及细胞融合
2．染色观察
• 取一滴0.02％的FDA液与一滴原生质体悬 浮液在载玻片上混匀，25E室温染色5～ 10min。用荧光显微镜观察，激发光波长 330～500nm，活的原生质体产生黄绿色 荧光。用计数器计算存活百分率。
(二)酚藏花红染色法
• 酚藏花红(phenosafranine)是一种碱性 染料，溶于水显红色并带黄色荧光，其 最大激发和射波长分别为527nm和588nm 。酚藏花红能被活的原生质体吸收而呈 红色，无活性的原生质体因无吸收能力 而五色。
(三)不连续梯度离心法
• 在离心管中首先放人不同浓度的Ficoll 溶液，构成不同的浓度梯度，在上部滴 人1～2ml酶一原生质体混合液，在150g 下离心5min，不同比重的原生质体漂浮 在不同的浓度梯度的界面上，用吸管收 集原生质体，悬浮洗涤备用。该方法的 优点是获得的原生质体大小均匀致，纯 度高；缺点是操作繁杂，原生质体的收 率低。
(五)分离方法 • 1．机械分离法 • 但由于该方法获得的原生质体产量低， 不能满足实验需要，而且液泡化程度低 的细胞不能采用该方法，因此，机械分 离法没有得到广泛应用。 • 2．酶分离法
• 1960年，德国诺丁汉大学的Cocking首先利用 纤维素酶从番茄幼苗根尖中分离获得原生质体 ，而且收率高、完整性好、活力强。经过数十 年的不断完善，目前酶分离法已成为植物原生 质体分离最有效的方法。 • 酶分离法又分为两步法和一步法。两步法是先 用果胶酶处理材料，游离出单细胞，然后再用 纤维素酶处理单细胞，分离出原生质体。其优 点是所获得的原生质体均匀一致、质量好。但 由于操作繁杂，目前已逐渐被淘汰。 • 一步法是将纤维素酶和果胶酶等配制成混合酶 溅处理材料，一步获得原生质体。因操作简便 ，目前几乎均采用该方法。
第四章 植物组织培养拓展技术
4.6.3 人工种子的结构
4.6.3.1
体细胞胚 4.6.3.2 人工胚乳 4.6.3.3 人工种皮
人工种子结构示意图
4.6.4 人工种子包埋方法
4.6.4.1 干燥包理法
23℃，相对湿度为70％土5％，黑暗条件下逐 渐干燥。
4.6.4.2 液胶包理法
将胚状体悬浮在一种黏滞的流体胶中，直接插 入土壤。
机械分离法和酶解分离法的比较
机械法 1. 细胞不受到酶的伤害； 2. 机械法不用质壁分离； 3. 细胞产量低； 4. 细胞易破。 1. 细胞受到酶的伤害； 2. 要质壁分离； 3. 细胞产量高； 4. 细胞不易破。
酶解法
4.1.2 单细胞的培养 4.1.2.1 看护培养法
含义：用一块活跃生长的愈伤组织块来看 护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 用途：诱导形成单细胞系。 要求：看护愈伤组织处于活跃生长状态； 愈伤组织和所要培养的细胞可以是同一个 物种也可以不同。
先将植物叶片取下经过无菌处理后，在研钵 中轻轻研碎，经过一定孔径的纱布或不绣钢 滤网过滤，取出过滤后的研磨介质经过低速 离心等其他处理使细胞得到纯化。
4.1.1.2 酶解分离
用纤维素酶和果胶酶等酶液处理适合植物外 植体即可得到所需要的单细胞。
4.1.1.3 由组织培养物分离
离体培养的愈伤组织分离单细胞。
4.3 花药和花粉培养
4.3.1 花药培养
4.3.1.1 花药材料的选择
选择大致处于所需要时期的花蕾。由于 花粉发育时期和植株的某些外部形态特征 之间的大致相关性，因此利用这些外部标 志，选择符合条件的花蕾，经镜检确定花 粉发育的准确时期。
4.3.1.2 培养基的选择
植物组织培养知识点归纳
植物组织培养知识点归纳1第1章植物组织培养:指植物器官、组织、细胞、原生质体等的培养。
体内使用人工培养基使它们生长成完整的植物2，外植体:在植物组织培养中，为无菌细胞、组织、器官等。
从活植物中提取并接种在培养基上的称为外植体。
3，愈伤组织:指在人工培养基上无序地从外植体中生长出来的大量薄壁细胞。
4.1的应用。
1农业应用。
幼苗的快速繁殖。
无病毒培养3。
(1)倍性育种，缩短育种年限，具有明显的杂种优势；(2)克服远缘杂交(胚胎培养)的不亲和性和不育性；(3)种质保存(4)变异2的创造，在遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、胚胎学、基因工程、生物工程等方面的应用。
用于基因工程创造植物新种质用于植物生长发育的理论研究，包括生理学、病理学、胚胎学、细胞和分子生物学等。
3。
使用组织培养材料作为植物生物反应器第2章1，全能性:任何具有完整细胞核的植物细胞都具有形成完整植物所必需的所有遗传信息以及发育成完整植物的能力。
2，细胞分化:指导致细胞形成不同结构和功能变化或潜在发育模式的过程3，去分化:指在体外生长的细胞、组织或器官逐渐失去原来的结构，恢复分生组织状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程4，再分化:指去分化细胞恢复其分化能力并形成具有特定结构和功能的细胞、组织、器官甚至植物的过程5，植物组织培养中经常遇到的问题及解决方法1，污染与预防:1，真菌污染后，如果孢子已经形成，必须在高压灭菌后丢弃然而，在细菌污染的情况下，只要及时发现，材料仍然可以使用，并且材料上部不易受细菌影响的部分被切割和转移。
2.用抗生素等抗菌剂处理会影响植物材料的正常生长第二，的褐变和防止(1)选择合适的外植体(2)适宜的培养条件(3)用抗氧化剂连续转移(4)，玻璃化和防止(1)提高培养基中的溶质水平和降低培养基中的水势；(2)减少培养基中氮化合物的量；(3)增加光照；(4)增加容器通气量和施用CO2肥料对降低试管苗玻璃化有明显效果。
植物原生质体培养及细胞融合过程
3. 获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。
植物原生质体培养及细胞融合过程
第一节 原生质体的分离与纯化
一、原生质体的分离
（一）材料来源
植物的茎、叶、胚、子叶、下胚轴等器官组织 以及愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为原生质体分离的材料。
果胶酶/纤维素酶 纯度高， 但浓度不来自太高； 木本植物加入半纤维素酶。
植物原生质体培养及细胞融合过程
◆渗透稳定剂
如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩， 因此在酶液、洗液和培养液中渗透压 应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。
较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽， 但同时也可能抑制原生质体的分裂。
①糖溶液系统
包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40-0.80mol／L。 可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；
②盐溶液系统
包括 KCl、MgSO4和 KH2PO4等。
此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，
提高原生质体的稳定性植物；原使生质R体培N养A及酶细胞不融合活过程化；并使离子稳定。
细胞壁的组成
纤维素 半纤维素 果胶质
25-50％ 53％
5％
纤维素酶 半纤维素酶 果胶酶
少量蛋白质
植物原生质体培养及细胞融合过程
酶的种类及特点
◆ 纤维素酶
主要含有 纤维素酶C，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用， 还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素， 另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、 核酸酶、溶菌酶等，
植物组织培养知识点归纳
植物组织培养知识点归纳第⼀章1、植物组织培养：是指在离体条件下，利⽤⼈⼯培养基对植物的器官、组织、细胞、原⽣质体等进⾏培养，使其长成完整植株2、外植体：在植物组织培养中，由活体（in vivo）植物上提取下来的、接种在培养基上的⽆菌细胞、组织、器官等均称为外植体。
3、愈伤组织：指在⼈⼯培养基上由外植体长出来的⼀团⽆序⽣长的薄壁细胞。
4、应⽤⼀、农业上的应⽤1. 种苗快速繁殖(rapid propagation)2.⽆病毒苗(virus free)的培养3.在育种上的应⽤(breeding)（1）倍性育种，缩短育种年限，杂种优势明显；（2）克服远缘杂交的不亲合性和不孕性（胚培养）；（3）保存种质（4）创造变异⼆、在遗传学、分⼦⽣物学、细胞⽣物学、组织学、胚胎学、基因⼯程、⽣物⼯程等⽅⾯的应⽤。
⽤于基因⼯程技术创造植物新种质。
⽤于植物⽣长发育理论研究，包括⽣理学、病理学、胚胎学和细胞与分⼦⽣物学等。
三、利⽤组织培养材料作为植物⽣物反应器第⼆章1、细胞全能性（Totipotency）：指任何具有完整的细胞核的植物细胞都拥有形成⼀个完整植株所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能⼒。
2、细胞分化（cell differentiation）：指导致细胞形成不同结构，引起功能或潜在的发育⽅式改变的过程。
3、脱分化（Dedifferentiation）：指离体条件下⽣长的细胞、组织或器官逐渐失去原来的结构和功能⽽恢复分⽣状态，形成⽆组织结构细胞团或愈伤组织的过程。
4、再分化（Redifferentiation）：指脱分化的细胞重新恢复分化能⼒，形成具有特定结构和功能的细胞、组织、器官甚⾄植株的过程。
5、植物组织培养中常遇到的问题以及解决措施⼀、污染及防治：1、真菌污染后，如果已形成孢⼦，则必须经⾼压灭菌后扔掉。
但若是细菌污染，只要及时发现，将材料上部未感菌的部分剪下转接，材料仍可使⽤。
2、⽤抗⽣素等杀菌药剂的处理，会影响植物材料正常⽣长。
原生质体制备与融合
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• 渗透压稳定剂对原生质体制备的影响
细胞壁脱去后，原生质体必须在高渗环境中保存及生长，否则会 因为渗透压而破裂。因此，渗透压稳定剂也是影响原生质体制备的重 要因素。
0.5% 纤维素酶+1mol/L 的 山梨醇处理Lecanicillium sp.
高倍显微镜下酶解前 Lecanicillium sp. 菌丝
混合酶液处理 Lecanicillium sp. 制得原生质体（×200）
原生质体的融合
原生质体的融合的不同产物
电诱导融合法： 短时间强电场作用， 质膜发生可逆性电击 穿，促使原生质体融 合
原生质体融合的方法
激光诱导融合法： 让原生质体先紧密 贴在一起，后用激 光对接触处照射， 使细胞融合
化学诱导融合法
• 酶解时间、温度、pH值对原生质体制备的影响
酶解时间的长短直接影响原生质化的效果，处理时间过短，脱壁 不完全，处理时间过长，会导致原生质体脱水皱缩，再生率显著降低 。而且不同的的酶都有各自的最适酶解温度。酶解时温度选择的原则 是既有利于原生质化，又能防止原生质体被破坏。酶解时的pH值随 酶和物种有一定的差异，需根据实际情况对pH值进行优化。
影响原生质体融合的因素
• 无机离子对原生质体融合的影响
原生质体融合过程中需要一定量的Ca2+和Mg2+促进融合，而 K+、Na+会显著降低融合率。
• 融合剂PEG对原生质体融合的影响
仅将原生质体混合在一起融合率并不高，需要添加融合剂来提高 融合率。PEG较常使用。PEG的相对分子质量和浓度高低对融合都有 较大的影响。PEG浓度过高会导致原生质体皱缩甚至是中毒，过低导 致原生质体破裂。
融合子的筛选
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取材：大田叶片（消毒灭菌）、无菌试管苗叶片、 愈伤组织或悬浮细胞
预处理：黑暗、低温、叶片萎蔫处理、预培养、 和不同光质照射等，可提高原生质体产量和代谢活力。
二、原生质体的分离和纯化
1 原生质体的分离
原生质培养首先在烟草上获得成功Nagata&Takebe（1971），到1993 有49个科，146个属的320多种植物培养成功，得到再生植株。
2、原生质体培养的意义
① 比较容易摄取外来的遗传物质（壁中有活性很强的核酸 酶）—研究植物原生质体培养和再生植株技术，有可能采 用细胞遗传工程的方法培育出新品种。
界面法的优点：可收集到较大的纯净的原生质体， 同时避免收集过程中原生质体的破损。
13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
原生质体分离纯化流程图
三、原生质体培养
1.原生质体的培养方法 (1) 固体培养法（平板法）：
将原生质体均匀固定于琼脂培养基上进行培养的方法。首先把制 备好的融化的琼脂培养基冷却至40℃，与等量原生质体悬浮液共同倒 入培养皿中，迅速而微轻摇动，使原生质体均匀铺在琼脂之中。 优点：
(2) 悬浮法（漂浮法）
原理：采用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后， 使原生质体漂浮于溶液表面，而残渣碎屑沉淀于底部。
过程：加0.5M蔗糖溶液，原生质体浮于表面，取出浮于表面 的原生质体，反复操作。
这种方法可收集较纯的原生质体，原生质大小较一致，但 获得原生质数量少，而且高渗溶液对原生质体有害，收集 较沉降法困难。
使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对 单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。
第四章 原生质体培养与细胞融合
第一节 原生质体培养
一、 原生质体的培养概况
1、概念：
植物的原生质体(Protoplast)指除去细胞壁以后的裸露细胞。 原生质体培养（Protoplast culture）是将植物细胞游离成原生质体， 在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进而细胞进行持续分裂形成 细胞团，进一步生长形成愈伤组织或胚状体，最后分化或发育形成完 整植株的过程。 原生质体培养特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便 于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍 可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
叶肉组织是制备原生质理想的材料，遗传性状一致。 细胞壁主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质等。
分离原生质的方法主要有以下两种：机械法和酶解法 （1）机械法： ①首先将细胞放在高渗的糖溶液中（水势低），使细胞发生质壁 分离（细胞失水），原生质体收缩成球状； ②破碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。 缺点：获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。
步骤：取材→预处理→酶液配制（过滤灭菌，包含果胶酶和 纤维素酶及渗透调节剂和质膜稳定剂） →酶处理(10ml/g， 抽真空，摇床，40r/s，26℃ 2～8h) →过滤离心。
优点：可以获得大量的原生质体，适用于几乎所有植物和器 官，双子叶植物叶肉细胞比单子叶更易分离。
缺点：酶制剂含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶及酚类物 质，会影响原生质体的活力。
(5) 渗透压的稳定剂种类:甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖 等，如甘露醇一般为0.5-0.7M。
(6) 原生质膜稳定剂 (CaCl2：0.1mM,葡聚糖硫酸钾 0.20.3%；葡聚糖硫酸钾0.2%-0.3%)
(7) pH影响 5.4-6.0
酶解时间
酶浓度
酶解温度
3 原生质体的纯化（净化）
指将酶解后的溶液中的原生质体与组织残渣（如去未脱 壁的细胞、细胞碎片）分开的过程。
(1) 沉降法
原理：利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中进行过 滤离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。
过程：首先将含有原生质体与酶混合液过网筛（44～ 169μm孔径），除去叶脉大组织块。然后低速离心 （900～4500r/min）收集沉于底部的完整的原生质体。
一般叶肉原生质体均采用沉降法，优点是采集方便，缺 点是不能完全除去少量的细胞和破碎的原生质体。
一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。 但可避免酶制剂对原生质体的某些破坏作用（优点）。
液 泡
细胞溶质 质膜
植物细胞壁胞间层 初Fra bibliotek壁 次生壁（2）酶解法 采用多糖水解酶将细胞壁降解而获得原生质的一种方法。 常用于降解细胞壁的酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、 蜗牛酶和胼胝质酶（成熟花粉粒、四分体小孢子）等。 1960年，Cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中大量分 离原生质体的可能性。
2 影响原生质体数量与活力的因素
(1) 光:一般在黑暗静止条件下进行.
(2) 温度:酶解温度25-30℃,兼顾原生质稳定性及酶活性.
(3) 时间:几小时到几十小时,太长影响原生质活力,一般小 于24小时,如烟草叶片保温24小时叶肉细胞解离完毕.
(4) 细胞壁降解酶的种类和组合:一般植物细胞使用(纤维素 酶0.7-1%,果胶酶0.5-1%),花粉细胞和四分体小孢子,可 使用蜗牛酶和胼胝质酶。
(3) 界面法
原理：利用两种比重不同的溶液，使完整的原生质体处 于两液相的界面之中。
在离心管中依次加入一层溶于培养基中的500 mmol/L蔗糖，一层溶于培养基中的140 mmol/L蔗糖和360 mmol/L山梨醇，最后一层加入悬浮于酶溶液中的原生质 体（含有300 mmol/L山梨醇、100 mmol/L CaCl2）,轻轻 混合，经5℃, 400g条件下，离心5min，完整的原生质体 悬浮在两层液体之间，叶绿体和破碎原生质体均在下面 液体中，取出界面中的原生质体，按上述方法再重复进 行一次。
② 便于进行细胞融合，形成杂交细胞—可广泛地重组植物 界优良遗传性状，创造新物种和新品种（如能固N的禾本 科植物，高光效植物，高抗植物）
③ 原生质体可作为遗传理论研究的材料—细胞生物学、植 物生理学、遗传学、分子生物学等，如细胞起源、壁生物 合成、胞间相互作用、不亲和性、激素作用机理等
3、原生质体培养程序