氯霉素速测金标试纸条及其保护剂配方研究

收稿日期：2007-09-29；接受日期：2008-06-24 基金项目：宁波市科技计划项目（2005C100018） 作者简介：王姝婷（1980－），女，新疆乌鲁木齐人，博士研究生，研究方向免疫化学。Tel：0571-86971220；E-mail：wst_water@。通讯作
者朱国念（1957－），男，浙江诸暨人，教授，研究方向为农药残留与环境毒理学。Tel：0571-86971220；E- mail：zhugn@
紫外可见光分光光度计（UV 7504pc 型，上海欣 茂仪器公司）；冷冻离心机（Anke GL-20G-Ⅱ，上海 安亭科学仪器公司）；恒温磁力搅拌器（85-2 式，上 海志威电器有限公司）；冷冻干燥机（Labconco，USA）； 划膜仪（IsoFlow，USA）；切割机（A-Point Guillotine， USA）；氯霉素 ELISA 检测试剂盒（荷兰 ED 公司）。 1.2 试验方法 1.2.1 胶体金颗粒制备及鉴定 采用柠檬酸钠还原 法[6]制备理论粒径为 25 nm 的胶体金颗粒。在搅拌下， 150 ml 0.01%氯金酸水溶液加热回流至沸，迅速加入 2.4 ml 1%柠檬酸钠水溶液，观察溶液颜色由浅黄转变 为蓝色再变成红色。当溶液的颜色完全变为亮红色时 继续回流 5 min 后停止加热，自然冷却后于 4℃下保 存。用分光光度计对胶体金溶液在可见光范围（400～ 600 nm）内进行光谱扫描，测定最大吸收波长（λmax） 及吸光值（OD 值），并在透射电镜下观察胶体金颗 粒大小及均匀程度，拍片放大估测金颗粒直径[7]。 1.2.2 抗氯霉素单克隆抗体制备 按照本实验室黄 雅丽等人[8]的方法制备氯霉素半抗原 CAP-HS1 及人工 抗原 CAP- HS1-BSA 和 CAP- HS1-OVA 后，按王自良 等 人 的 方 法 [4] 制 备 抗 CAP-HS1 单 克 隆 抗 体 （CAP-HS1-McAb）。步骤分为：以 CAP- HS1-BSA 免疫 Balb/c 小鼠；末免后取小鼠脾脏与 SP2/O 细胞融 合；杂交瘤细胞经选择培养，间接竞争 ELISA 法筛选 得到目的细胞株；将克隆化后的细胞株注入小鼠腹腔， 产生腹水；纯化腹水并制成抗体冻干粉。 1.2.3 金标抗体的制备
关键词：氯霉素；胶体金；试纸条；保护剂
Study on Chloramphenicol Gold Immunostrip and Its Protectants
WANG Shu-ting1, GUI Wen-jun1, GUO Yi-rong1, YANG Ting2, ZHU Guo-nian1
(1Institute of Pesticide and Environmental Toxicology, Zhejiang University, Hangzhou 310029; 2Ningbo Academy of Agricultural Sciences, Ningbo 315040, Zhejiang)
12 期
王姝婷等：氯霉素速测金标试纸条及其保护纸条保存期研究提供一些思路和借 鉴，有利于免疫金标试纸条的产业化开发。【前人研 究进展】以膜为固相载体的胶体金免疫层析试纸条 （简称金标试纸条）快速诊断法，是 20 世纪 90 年代 以 来 在 单 克 隆 抗 体 技 术 、 金 免 疫 层 析 技 术 （ gold immunochromatographic assay，GICA）和新材料技术 基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，其操作便 捷、结果判断直观、无需特殊仪器设备，已广泛应用 于生物医学领域特别是临床检验[1]，并逐步在动植物 检疫、环境质量监控、食品安全督管等领域日益发挥 出显著作用。近些年来，用于检测小分子物质（如滥 用药物、毒品、兴奋剂等）的金标试纸条也不断研发 成功，但关于兽药、农药残留检测的金标试纸产品还 比较少见[2]。关于氯霉素金标试纸条研制的报道[3-4]已 有一些，但都未涉及保护剂的内容。另外，在小分子 化合物速测金标试纸的同类产品中，尚未对保护剂问 题公开报道；国外有学者提出单一保护剂用于大分子 物质诊断的夹心式金免疫测试条，但对于不同保护剂 组合的协作效应没有指明[5]。【本研究切入点】当前， 农副产品中氯霉素残留问题仍受到人们的高度重视。 研发稳定可靠、灵敏度高的氯霉素速测金标试纸条, 对于实现大批量样品中氯霉素残留的现场快速筛查有 着重大意义。氯霉素属小分子化合物，采用竞争性金 免疫层析法进行诊断，故检测试纸条上含有的主要生 化试剂是：结合垫（玻璃纤维膜）上包被的抗氯霉素 单克隆抗体-胶体金标记物（简称金标抗体），硝酸纤 维素膜（NC 膜）测试带上包被的氯霉素半抗原-卵清 蛋白偶联物和质控带上包被的羊抗鼠 IgG。这些物质 尤其是抗体的分子结构稳定性，很大程度上决定了试 纸条的货架寿命。抗体属热敏性蛋白，其失活速度直 接决定于暴露温度，因而研究稳定蛋白的方法和测量 试纸条的货架寿命，即保持最初活性 90%的持续时间， 很是重要[5]。对该试纸条添加辅助剂，即是改善上述 三类蛋白质的稳定性能，以保护各自在膜固相上的活 性结构，从而解决氯霉素金标试纸条的保存期问题。 本研究通过经验法，筛选出一种氯霉素速测金标试纸 条的复合保护剂，是由二糖、聚合物、蛋白质、表面 活性剂、防腐剂溶解在缓冲溶液中形成的。该保护剂 成本较低，使用方便，经加速贮存试验表明，其作用 效果可使氯霉素速测金标试纸条的在 4℃下保存期至 少半年。【拟解决的关键问题】保护剂配方的筛选， 使得试纸条的保存期满足商品化需要。
Abstract: 【Objective】 To obtain a gold immunostrip for rapid detection of Chloramphenicol (CAP), and to obtain protectants for the immunostrip, with which the storage life of the strip could conform to the commercial need after treated. 【 Method 】 A gold immunostrip for rapid detection of Chloramphenicol (CAP) was developed based on competitive immunochromatographic assay. And the mixtures of saccharose, dextran, polyvinylpyrrolidone (PVP), polyethylene glycol (PEG), bovine serum albumin (BSA), tween20 and antiseptic, etc, as protectants were designed and prepared. Different part of the strip was treated with the protectants, and then thermo-stability of the strip was investigated with storage at 4℃, 37℃ and 60℃. The strips without treatment were as controls. The feasible protectants for the CAP immunostrip were thus obtained. 【Result】 Results showed that, for standards, the limit of detection (LOD) of the strip was 1.5ng·ml-1. And CAP immunostrip treated with the above-mentioned multiple protectants, could retain the stability performance for 180 d at 4℃, 30 d at 37℃ and 10 d at 60℃, respectively, while the controls were lost the stability rapidly after stored for 60 days at 4℃, for 3 days at 37℃ and for 1 day at 60℃, which could not be applied for test.【Conclusion】The obtained strip had the high sensitivity (0.75-1.5 ng·ml-1 for spiked samples), its storage life was at least half a year after treated with the obtained protectants.
摘要：【目的】研制出一种适合于氯霉素残留快速测定的金标试纸条，并对该试纸条的保护剂进行研究，使 得研制出的试纸条保存期足够的长。【方法】根据竞争性金免疫层析法原理，研制了氯霉素速测金标试纸条，并选 择了蔗糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙二醇（PEG）、牛血清蛋白（BSA）、表面活性剂 Tween20、防腐 剂等物质，采用经验尝试法配制了一系列的配方，对试纸条不同部位进行处理，通过 37℃和 60℃下热稳定性测试， 并与未经稳定剂处理的对照进行比较，筛选出适宜的试纸条保护剂。【结果】经该复合保护剂处理的氯霉素速测金 标试纸条，在 4℃、37℃和 60℃下分别保存 180 d、30 d 和 10 d，显色基本不变，对于标准溶液，其检测灵敏度 （目测）可达到 1.5 ng·ml-1。未经该复合保护剂处理的氯霉素速测金标试纸条，在 4℃、37℃和 60℃下保存 60 d、 3 d 和 1 d 后就迅速失活，无法用于检测。【结论】 研制出的氯霉素金标试纸条检测灵敏度较高（对于添加样品， 检测灵敏度为 0.75～1.5 ng·ml-1），经保护剂处理后，4℃下至少可保存半年。
中国农业科学 2008,41(12):4372-4380 Scientia Agricultura Sinica