谷胱甘肽转移酶抑制剂筛选方法一

谷胱甘肽转移酶（GST）

还原型谷胱甘肽占绝大多数。

谷胱甘肽转移酶 (GST) 是广泛分布于哺乳动物、植物、鸟类、昆虫、寄生虫及微生物体内的一组多功能同工酶。GST是由23-29KDa的不同亚基构成的同源二聚体，每一类GST同工酶中组成的亚基种类有多种，因此编码GST同工酶的基因是一个巨大的超基因家族。

GST主要功能是催化某些内源性或外来有害物质(过氧化物、α, β2不饱和醛酮、烷基或芳香基化合物)的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基偶联，增加其疏水性使其易于穿越细胞膜，分解后排出体外，从而达到解毒的目的，有抑制细胞癌变的功能。

通常认为，谷胱甘肽转移酶的作用是催化谷胱甘肽与外来的或内在的有害物质亲电结合排出体外而起到解毒的作用，但是对于治疗癌症药物的研究主要是针对能够抑制谷胱甘肽转移酶（GST）活性的酶抑制剂，而不是GST催化解毒作用。

研究表明，GST的酶活性水平与肿瘤的耐药性密切相关心。因此，GST可能是治疗耐药肿瘤的潜在药物作用靶点。

与GSTs相关疾病有：人类癌症包括胃癌，结肠癌，胰腺癌和肺癌动脉粥样硬化和冠心病。

近年来对GST抑制剂的研究越来越多，研究报道的GST抑制剂主要有：依他尼酸（EA）及其类似物、TLK199及其类似物、黄酮类化合物、双功能基化合物，还有其他一些抗虐药物如乙嘧啶和奎尼丁等等。

抗肿瘤药物与GSH作用模式图：

图中GST-∏是人体内一种Ⅱ相代谢酶，其对肿瘤的耐药作用主要由其解毒功能引起，

其作用机制：①催化谷胱苷肽(GSH)与亲电子药物如各种烷化剂结合，增加其水溶性，加速其排泄而使药效减低；②清除葸环类药物等产生的自由基，减轻药物自由基对细胞的损伤；

③通过直接与药物结合的形式降低药物活性等。

机理解释：图中是一个肿瘤细胞，当治疗肿瘤的药物顺铂进入细胞时，GST就会催化谷胱甘肽GSH与顺铂结合而将其排出体外，所以为了加强药效，就需要使GST的功能受到抑制，GST 抑制剂占据GST酶活性位点，使GST无法催化GSH与顺铂结合，这样就会降低抗肿瘤药物的耐药性。

筛选方法：

方法一：比色法

在该酶的抑制剂筛选中，采用比色法直接测定底物浓度，主要依据产物有紫外或可见光的特征吸收，通过测定反应体系的OD值变化，测定酶和抑制剂的活性。

实验原理：1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）与谷胱甘肽（GSH）在谷胱甘肽转移酶(GST)的作用下生成复合物CDNB-SG,该化合物在340nm 下呈现最大的光吸收值，根据加入样品前后酶活性的变化情况测定样品对GST的抑制活性。

实验材料：

试剂：还原型谷胱甘肽；1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）；次氯酸钠溶液；待筛选样品。

仪器：SpectraMax M5 型连续光谱酶标测试仪；Costar 384孔微板。

实验步骤：

1.在384孔板中，分别加入3.5 mmol/L CDNB底物和酶液各10uL，待测样品孔中加入样品5uL，阳性对照孔中加入NaOCl 5uL，空白对照孔中加入PBS 5uL；

2.振荡混匀，30℃保温1 h；

3.然后，各孔加入3.5mmol/L GSH底物10uL，反应总体积35uL；

4.振荡混匀，于340 nm测定各孔吸收度(A1)；

5.30℃保温2 h，测定各孔吸收度(A2)。

实验步骤流程图：

3.5 mmol/L CDNB底物和酶液各10uL 振荡混匀

待测样品孔中加入样品5uL 各孔中加入 3.5mmol/L GSH底物10uL

阳性对照孔中加入NaOCl 5uL 30℃保温1 h

空白对照孔中加入PBS 5uL

振荡混匀 30℃保温2 h

于340 nm测定各孔吸收度(A1) 测定各孔吸收度(A2)

实验数据处理：

根据下式计算样品对GST的抑制率(％)：

抑制率(％)=[(空白对照A2-1A一样品A2-A1)／空白对照A2-A1]×100％

然后再以抑制率与样品剂量对数作图，可以得到一条S形曲线，得到待测样品的IC50。

IC50值越小，GST抑制剂效果越好。

实验结果:

NaOCl是强效GST抑制剂，反应2 h，NaOCl抑制GST的IC50为0.597 8 mmol/L。通过以上实验步骤，我们可以对大量化合物进行初筛。

按上述方法确定的最佳条件，文献中对31 098个化合物进行筛选，初筛发现抑制率大于85％的样品185个，复筛活性较高、量效关系较好的样品有4个，其编号分别为W3437、W3438、DF00197及DF00200，IC50值分别为3.94、4.05、74.85及77.41 mg/L。

如下图：

（注：这张图是31098个化合物对于GST抑制活性的分布图，通过初筛，其中有185个化合物抑制率超过85%。可以看出，随着抑制率数值的升高，达标的化合物越来越少。）

实验优点：以CDNB和GSH为底物的比色法操作简便，对仪器要求简单，试剂成本低。

实验缺点：该方法灵敏度相对较低，有时为了达到信号在线性范围内，需要较大的酶量和底物浓度。