最新干细胞的体外培养
小鼠干细胞实验报告
一、实验目的本研究旨在探讨小鼠干细胞的生物学特性及其在组织再生和疾病治疗中的应用。
通过体外培养和观察小鼠干细胞，分析其增殖、分化和迁移能力，为干细胞在临床治疗中的应用提供理论依据。
二、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）小鼠脾脏、骨髓等组织；（2）DMEM/F12培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素；（3）小鼠成纤维细胞；（4）表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子；（5）流式细胞仪、细胞培养箱、倒置显微镜等。
2. 实验仪器：（1）流式细胞仪；（2）细胞培养箱；（3）倒置显微镜；（4）超净工作台；（5）离心机。
三、实验方法1. 小鼠干细胞分离（1）取小鼠脾脏、骨髓等组织，用眼科剪剪成1mm³大小的组织块；（2）将组织块放入DMEM/F12培养基中，加入Ⅰ型胶原酶，37℃消化1小时；（3）用200目尼龙网过滤，收集细胞悬液；（4）用离心机离心，弃去上清液，用DMEM/F12培养基重悬细胞。
2. 小鼠干细胞体外培养（1）将细胞悬液接种于培养瓶中，放入细胞培养箱，37℃、5%CO2条件下培养；（2）每3天更换一次培养基，观察细胞生长情况。
3. 小鼠干细胞表型鉴定（1）用流式细胞仪检测细胞表面标记，如CD29、CD44、CD45等；（2）用倒置显微镜观察细胞形态。
4. 小鼠干细胞增殖实验（1）取对数生长期的干细胞，以1×10⁵个/孔的密度接种于96孔板；（2）每24小时更换一次培养基，观察细胞增殖情况；（3）计算细胞增殖倍数。
5. 小鼠干细胞分化实验（1）将干细胞接种于培养皿中，加入表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，诱导细胞分化；（2）观察细胞形态和生物学特性，如神经细胞、成骨细胞等。
6. 小鼠干细胞迁移实验（1）将干细胞接种于培养皿中，加入细胞迁移实验试剂；（2）观察细胞迁移情况，记录细胞迁移距离。
四、实验结果1. 小鼠干细胞分离成功，细胞生长旺盛，呈梭形、椭圆形等；2. 表型鉴定结果显示，小鼠干细胞表面表达CD29、CD44、CD45等干细胞标记；3. 小鼠干细胞增殖实验结果显示，细胞增殖倍数为10倍；4. 小鼠干细胞分化实验结果显示，细胞可分化为神经细胞、成骨细胞等；5. 小鼠干细胞迁移实验结果显示，细胞迁移距离为1.5mm。
体外培养人胚胎干细胞饲养层的研究进展
ｇｏ ｈｆｃｏ ，ＧＦ 等 ， 到既 促 进 增殖 又抑 制 分 化 ｒｗｔ ａｔｒ Ｓ ） 起 的双重 作用 。
饲 养 层 细 胞 的 来 源 与 筛 选
验 证实 维持 Ｅ Ｃ的效 果可 靠 ， 仍有 自身弊 端［ ： １ Ｓ 但 ３ （） ］ 小 鼠来 源 的饲 养 层 细胞 可 能 给培 养 体 系 带 来 异 种 蛋 白和遗 传物 质 ， 引起 不 良反 应 ； ２ 小 鼠源 性 饲养 层 可 （） 能会 引入小 鼠携 带的病 原微 生 物 ， 造成 污 染 ； ３ 通 常 （）
需 定期 制备 ， 大 了 Ｅ Ｃ培 养 的工 作量 和经 济 负担 ； 加 Ｓ 且 随着 传代 的增 加 ， 生 长 活性 和分 泌 Ｌ Ｆ Ｆ 其 Ｉ 、 ＧＦ等
因子 的能力 将逐 渐下 降 ； 同时 饲养 层 细胞 种类 发 生 变
制备 的条件培 养基 ；３ 以人 胚胎 成 纤 维细 胞 、 人输 （） 成
化 ， 利于 深入分 析其 成分 ；４ 成纤 维 细胞 耐硫 代 鸟 不 （） 嘌 呤和耐 乌本苷 亚 系由于 长期 体 外 培养 ， 色 体 已发 染
生 畸 变 ， 能有效 地 抑 制 Ｅ Ｃ 的分 化 和 维 持 Ｅ Ｃ 的 不 Ｓ Ｓ
二倍 体核型 。
来源于 人或 鼠的饲 养 层 制 备 并 添 加 细胞 外 基 质 以保 持 人 Ｅ Ｃ 的所有特 性 ， ２种培养体 系避 免 了人 Ｅ Ｃ Ｓ 这 Ｓ 与饲养 层直接 接触 ， 但仍 有不 足 ：１ 培 养体 系 仍 存在 （）
卵管上 皮细胞 、 包皮 成纤 维 细胞 、 宫 内膜 基 质 细胞 、 子 小 鼠成 纤维 细 胞 等 为 来 源 的 饲 养层 。前 ２种 体 系 又称无 饲养 层 培 养 体 系 。无 血 清无 饲 养 层 培 养 体 系 需添加 各种细 胞因子 和血 清 替代 品 ， 件培 养 基需 要 条
最新干细胞的基础研究与临床应用PPT课件
4、用于移植治疗的可能机制：
A、可分化为功能细胞，促进缺损组织更新； B、可分泌多种细胞因子和营养因子，通过旁分泌作用改善受体微环境； C、能通过细胞与细胞的直接接触及分泌可溶性因子的方式抑制免疫反
干细胞应用前景：
★现有的基础研究和临床应用结果证明，干细胞在治疗中确实 发挥了作用，应用前景非常乐观。
★国内外知名干细胞研究机构有：
国外
国内
加州再生医学研究所
科技部国家干细胞工程技术研究中心
哈佛干细胞研究所
细胞产品国家工程研究中心
京都大学iPS细胞研究与应用中心 人类胚胎干细胞国家工程研究中心
澳大利亚干细胞中心
神经干细胞（neural stem cells, NSCs）：
1、定义：NSCs是来源于中枢神经系统的多能干细胞，具有自我更新和多向 分化潜能，可以分化成中枢神经系统的各类细胞，包括神经元、星形胶 质细胞和少突胶质细胞（1992）。
2、鉴定标志物：表达Nestin（Neuroepithdial stem protein）。
截至2010年4月，全球被批准进行利用MSCs治疗的临床试验已有80项。 且MSCs已被FDA批准用于治疗GvHD。
脐带来源MSCs的优势：
1、来源更容易，废物利用，不涉及伦理道德问题； 2、采集方便，易于保存和运输； 3、供者无痛苦，对母婴均无损害； 4、脐带中MSCs较骨髓中含量更为丰富； 5、细胞更原始，分化潜能更大，扩增效应更强； 6、组织相容性抗原表达低或不表达，更适宜于异体间的
干细胞的培养与扩增技巧
干细胞的培养与扩增技巧干细胞，作为一种具有自我更新及分化能力的特殊细胞，被广泛应用于生物医学研究和临床治疗。
为了获得足够数量的干细胞，培养和扩增技巧成为必不可少的步骤。
本文将介绍干细胞的培养和扩增技巧，帮助读者了解如何有效地进行干细胞培养。
首先，合理选择培养基是成功培养干细胞的关键。
常用的培养基包括表达钠离子通道的KSR培养基、mTeSR培养基、E8培养基等。
这些培养基中均含有必需的营养物质和生长因子，可以提供干细胞所需的环境。
对于不同类型的干细胞，选择适合其生长和分化的培养基是至关重要的。
其次，细胞传代的技巧是干细胞扩增的关键步骤。
传代是指将已达到一定密度的细胞转移至新的培养皿中，继续进行培养。
传代过程中，应注意以下几点：首先，防止细胞过度接合，应尽量减少细胞间的物理接触。
其次，选择合适的离心速度和时间，以确保细胞沉积在适当的位置。
最后，密切观察细胞形态的变化，如发现细胞生长异常或出现杂质，应及时采取措施。
此外，维持适宜的细胞密度也是干细胞扩增的重要方面。
过高或过低的细胞密度都可能影响到干细胞的增殖和分化能力。
一般而言，细胞密度不宜超过80%的培养皿表面积。
当细胞增殖达到一定程度时，应及时传代，以保证细胞在一个适宜的状态下进行生长。
除了基本的培养技巧外，还有一些其他的技术可用于干细胞的扩增。
例如，干细胞的分离技术可以通过采用不同的细胞表面标记物，将具有特定功能或特性的细胞选择性地分离出来。
此外，基因编辑技术的应用也使干细胞扩增变得更加高效和精准。
如果想要提高干细胞的扩增效率，还可以考虑使用辅助因子。
辅助因子是指可以促进干细胞增殖和保持干细胞状态的物质，如2i/LIF和bFGF等。
这些辅助因子可以显著提高干细胞的生长速度和倍增能力。
在进行干细胞培养和扩增时，还需要严格控制培养条件。
温度、湿度和氧气浓度等因素均会影响细胞的生长和分化。
因此，应确保培养箱内的环境稳定，并避免温度和湿度的剧烈波动。
另外，为了保持培养皿内良好的细胞状态，应避免震动和搅拌等可能造成机械损伤的情况。
神经干细胞体外培养技术
神经干细胞体外培养与鉴定一前言神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。
文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。
此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。
根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。
基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。
本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。
二实验所需仪器、试剂及其配制（一）实验仪器光学显微镜（Olympus,Japan）倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB）冰冻切片机（Leica CM1900，Germany）光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司)10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLINGCORP，BATON ROUGE，LOUISIANA，Made in USA）0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff）手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。
（二）试剂1. DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。
人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定
人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定何黎顾华昆明医学院第一附属医院皮肤性病科云南[摘要]目的：探索实验条件下人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定。
方法：利用细胞工程方法进行组织分离及细胞培养：通过免疫组化方法，利用角蛋白单克隆抗体对培养的角质形成细胞进行鉴定，并利用表皮干细胞的相对特异标识分子——CK19对其进行检测分析。
结果：表皮自真皮较完整分离，电镜及免疫组化证实培养细胞为角质形成细胞，免疫组化结果显示：CK反应阳性，部分细胞CK19阳性，表明有表皮干细胞存在。
结论：体外分离、培养角质形成细胞成功，且分离得到的角质形成细胞中有表皮干细胞存在。
[关键词]：角质形成细胞表皮干细胞细胞培养角蛋白——19对于烧伤、急性创伤、某些疾病导致的皮肤缺损，尤其是大面积烧伤一直以自体皮移植作为首选方案，而自体皮肤不足是临床遇到的主要问题。
随着细胞培养技术和组织工程的出现，使许多脏器或组织体外重建成为可能。
人工皮肤的研制就是一个典型例子。
在这一技术中，种子细胞——角质形成细胞的体外培养，以及体外分离到的角质形成细胞中是否有在体外能大量增殖的表皮干细胞决定了能否成功构建人工皮肤。
为此本课题采用组织分离方法及细胞培养方法进行角质形成细胞体外分离及培养；通过免疫组化方法，利用人广谱单克隆抗体对培养细胞进行鉴定；并利用CK19对体外培养细胞中是否有表皮干细胞进行检测。
材料和方法一、材料1、取材选择6-26岁健康男性，行包皮环切术切除的包皮。
2、主要培养基及试剂(1)磷酸盐缓冲溶液（PBS和D-Hank’s液）：（2）培养基：K-SFM（Gibco公司），编号：37010，内含2.5ug表皮细胞生长因子（EGF）和25mg小牛垂体(BPE)：（3）分离酶：dispase（4）胰蛋白酶；（5）抗人广谱角蛋白单克隆抗体；（6）CK19单克隆抗体；（7）SP 超敏免疫组化试剂盒。
二、方法1、取材将包皮环切术切除的健康包皮组织放入50ml离心管中（内装10mlDMEM培养基，含青、链酶素及硫酸庆大酶素）。
人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的分离、体外培养及诱导分化
万方数据
万方数据
人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的分离、体外培养及诱导分化
作者：丛姗， 宋瑾， 张惠娟， 李岩， 白立恒， 曹贵方， CONG Shan， SONG Jin， ZHANG Hui-Juan， LI Yan， BAI Li-Heng， CAO Gui-Fang
作者单位：丛姗,宋瑾,张惠娟,李岩,曹贵方,CONG Shan,SONG Jin,ZHANG Hui-Juan,LI Yan,CAO Gui-Fang(内蒙古农业大学兽医学院/动物组织胚胎学与发育生物学实验室,呼和浩特,010018)， 白立恒,BAI Li-Heng(内蒙古
妇幼保健医院妇产科,呼和浩特,010020)
刊名：
农业生物技术学报
英文刊名：Journal of Agricultural Biotechnology
年，卷(期)：2015,23(1)
引用本文格式：丛姗.宋瑾.张惠娟.李岩.白立恒.曹贵方.CONG Shan.SONG Jin.ZHANG Hui-Juan.LI Yan.BAI Li-Heng.CAO Gui-Fang 人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的分离、体外培养及诱导分化[期刊论文]-农业生物技术学报 2015(1)。
体外培养——精选推荐
体外培养：将活体细胞成分（活体组织、活体器官、活体细胞）甚至活的个体（病原微生物）从体内或寄生体内取出放在类似于体内生存环境的体外环境，让其生长发育的过程。
2、器官培养：将活体器官或器官原基放在体内生存环境的体外环境中，让其生长发育的过程。
3.器官的体外培养：值整个器官、器官的一部分或器官原基放在体外环境中，让其生存和生长的过程。
4、组织培养：将活体组织放在体内生存环境的体外环境中，让其生长发育的过程。
5、细胞培养：将活体细胞（分散的细胞）放在体内生存环境的体外环境中，让其生长发育的过程。
6.体内培养：将活体结构成分，从生物体内或寄生虫体内取出放在另一种生物体内然后进行生长发育的过程。
7.细胞系：原代培养植物经首次培养后获得的种群。
8、细胞株：通过选择法或克隆法，从原代细胞器中或培养物中获得的具有特殊性质或标志的培养物称为细胞株。
9、原代培养：指第一次培养将培养物放置在体外培养环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。
10、传代培养：指培养物长满培养空间，并发生相互接触性抑制现象，需要将培养物分割成小部分，重新将培养物放入另外的培养器皿内进行培养的过程。
11、生长基质：泛指培养物附着的各种介质。
狭义特指在塑料或玻璃表面涂布一层能够促进培养物吸附，帖壁与铺层的生物活性物质。
12、复苏：以一定的复温速率将冻存培养物恢复到常温的过程。
13、动物细胞大规模培养技术：人工条件下（设定PH值，温度溶氧，培养工艺等）在动物细胞生物反应器中高密度大量的培养有用动物细胞，以生产珍贵生物制品的技术。
14、悬浮培养：质细胞在生物反应器中自由悬浮培养的过程。
15、固定化培养：将动物细胞与水不溶性载体结合起来在进行培养的过程。
16、结缔组织：是动物体内主要的支持性组织，由结缔组织和大量间质构成。
17、寄生虫的体外培养：模拟宿主体内环境，对寄生虫某一生活史阶段的虫体或细胞进行离体培养过程。
间充质细胞：各种结缔组织细胞的干细胞。
骨髓间充质干细胞培养方法大全
一、四种方法简介及优缺点：骨髓间充质干细胞主要有4种体外分离方法：贴壁筛选法，密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。
贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的培养MSCS的方法。
贴壁分离培养法分离的MSCS能在体外培养条件下生长良好、可连续传代，体外培养扩增能力较强，其缺点是细胞纯度较低。
此方法简便，冲出骨髓直接培养，然后利用骨髓MSCS 贴壁生长特性，更换培养液逐步去处漂浮生长的造血系细胞即可获得较纯化的MSCS；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质，可促进MSCS 贴壁生长，因此全骨髓贴壁法更为可取。
密度梯度离心法梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。
梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同，使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，再进行贴壁培养，从而达到分离、纯化MSCS的目的。
Pittenger等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到95%。
常用的分离方法免疫磁珠法，是利用免疫学的技术分离MSCS，分离细胞的纯度高。
Phinney 用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来，提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法，但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记;而且，这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响，造成MSCS损伤，出现增殖缓慢等问题，这些技术问题很大程度上限制了这两种方法的应用。
因此，如何能简便高效地获得均质性的间充质干细胞和细胞群仍需要继续探索。
分离细疫磁珠分离和流式细胞仪筛选的方法，不仅对细胞活性影响较大，而且操作复杂，价格昂贵。
然而，这些纯化间充质干细胞的方法比较复杂，一般仅限于在各自的实验室应用。
二、具体实验流程1. 免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞：1 实验动物Sd大鼠2 试剂和仪器BSA、荧光标记小鼠抗体x、PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱。
大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定
大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定干细胞研究一直是生物医学领域的前沿热点，其中骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其具有多向分化潜能和低免疫原性而备受。
在众多研究中，大鼠BMSCs的体外培养和鉴定方法为其在科研和临床领域的应用提供了基础。
本文将就大鼠BMSCs的培养、鉴定方法进行详细介绍，并结合实验数据进行阐述。
BMSCs是一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，可以分化为多种细胞类型，如成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。
因其来源广泛，免疫原性低，大鼠BMSCs已成为再生医学、免疫调节等领域的重要研究对象。
近年来，随着生物技术的不断发展，BMSCs的培养和鉴定方法也得到了不断优化和改进。
BMSCs的培养需要无菌环境，常用的培养基为DMEM、F12等，添加适量的生长因子和抗生素以维持细胞的生长和存活。
细胞的鉴定主要包括形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实。
其中，表面标志物如CDCD90等可用来区分BMSCs和其他细胞，多向分化潜能的证实包括成骨、成脂和成肌等方向的诱导分化。
本实验采用大鼠BMSCs的常规体外培养方法。
具体步骤如下：采集大鼠骨髓：在无菌环境下，用注射器抽取大鼠股骨和胫骨骨髓，加入肝素抗凝。
细胞分离：将采集的骨髓用密度梯度离心法分离出单个核细胞。
细胞培养：将单个核细胞接种于培养瓶中，用含10%血清、1%抗生素和1%谷氨酰胺的培养基培养。
细胞鉴定：经过约7-10天的培养，细胞达到80%-90%融合时，进行细胞鉴定。
通过形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实，对BMSCs进行鉴定。
通过观察细胞的形态和生长情况，发现培养的BMSCs呈典型的长梭形，且细胞间连接紧密（图1）。
经表面标志物检测，BMSCs表达CD29和CD90等间充质干细胞表面标志物（图2）。
在多向分化潜能的证实中，我们发现BMSCs经成骨、成脂和成肌诱导后，可分别形成矿化结节、脂肪滴和肌纤维（图3）。
这些结果说明所培养的细胞为BMSCs。
胚胎干细胞体外培养
胚胎干细胞体外培养(一)胚胎干细胞的来源目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。
其中囊胚的ICM最为常用。
(二)胚胎干细胞的分离1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。
以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。
以PGCs取ES细胞时：小鼠取12.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或13.5～14.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。
2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。
从囊胚分离ICM的方法主要有三种：(1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。
这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。
(2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。
结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。
我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。
细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。
一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。
具体步骤一、ES培养基在LIF存在的条件下维持细胞培养。
二、EB培养基使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1. 分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）。
2. 纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50 ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15 ml管中离心3分钟。
3. 用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液4. 一个15 cm的细菌培养皿接种4～5x106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
5. 2天后更换培养基，将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。
弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6. 用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。
1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
7. 形成胚状体需要4天时间。
在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。
这一天被认为是第2步和第3步的分界。
三、ITSFn培养基在最少量培养基中选择神经前体细胞1. 胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。
2. 并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3. 保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
4. 观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。
当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。
造血干细胞体外培养
造血干细胞体外培养
在进行造血干细胞体外培养时，首先需要从骨髓、外周血或者
胎盘血等来源中获得含有造血干细胞的细胞样本。
然后，这些细胞
样本会被经过特定的处理和分离步骤，将造血干细胞分离出来。
接
下来，这些分离出来的造血干细胞会被放入含有适当营养物质和生
长因子的培养基中进行培养。
培养基的配方和条件需要精确控制，
以提供细胞增殖和生长所需的理想环境。
在体外培养的过程中，研究人员需要定期检测和评估造血干细
胞的生长状态、纯度和活性。
他们可能会对培养条件进行调整，以
确保造血干细胞能够在体外保持其干细胞特性和功能。
造血干细胞体外培养的成功对于临床移植和疾病治疗具有重要
意义。
通过体外培养，可以获得足够数量和质量的造血干细胞，用
于移植到需要再生造血系统的患者体内，如白血病或骨髓衰竭患者。
此外，体外培养也为研究人员提供了研究和了解造血干细胞生物学
特性的重要工具，有助于深入探究造血系统疾病的发病机制和开发
新的治疗方法。
总的来说，造血干细胞体外培养是一个复杂而重要的过程，它
在临床和科研领域都具有重要意义，对于促进医学进步和治疗疾病具有深远影响。
造血干细胞体外培养
造血干细胞体外培养
首先，造血干细胞体外培养的过程通常涉及到从骨髓、外周血或者脐带血等来源中分离出造血干细胞。
这些干细胞随后会被置于含有适当营养物质和生长因子的培养基中进行培养。
培养基的配方需要精确控制，以提供适当的营养和环境条件来促进干细胞的增殖和分化。
其次，体外培养的过程中需要严格控制培养条件，包括温度、湿度、氧气浓度等因素。
这些条件对于干细胞的生长和分化至关重要，因此需要精确监控和调节。
此外，体外培养的过程也需要考虑到细胞的纯度和活性。
在培养过程中，需要定期检测和评估干细胞的纯度和活性，以确保其符合临床应用的要求。
在实际应用中，体外培养的造血干细胞可以用于干细胞移植，用于治疗白血病、淋巴瘤、贫血等血液系统疾病。
此外，体外培养的造血干细胞也被用于研究干细胞生物学以及药物筛选等领域。
总的来说，造血干细胞体外培养是一项复杂而重要的技术，它
为干细胞移植和血液系统疾病治疗提供了重要的支持，同时也推动了干细胞生物学和临床应用的发展。
随着技术的不断进步，相信体外培养技术将在未来发挥更加重要的作用。
干细胞培养和扩增的最佳实践方法
干细胞培养和扩增的最佳实践方法干细胞是具有自我更新能力和分化为多种细胞类型的特殊细胞，对于生物医学研究和临床应用具有巨大潜力。
干细胞的培养和扩增是实现其研究和应用的关键步骤之一。
本文将介绍干细胞培养和扩增的最佳实践方法，以帮助研究人员获得稳定的细胞系和高效的细胞扩增。
1. 选择合适的培养基选择适合干细胞生长和扩增的培养基是培养成功的关键。
常用的培养基有无血清培养基、人胎牛血清培养基和去血清培养基。
无血清培养基避免了血清带来的不确定因素，但需要添加增殖因子和细胞外基质。
人胎牛血清培养基在人胎牛血清中提供丰富的营养物质，但存在批次差异和传染病传播的风险。
去血清培养基是一种全合成培养基，不含动物源成分，较为安全可靠。
2. 优化细胞培养条件干细胞对培养条件非常敏感，因此需要优化培养条件以获得最佳的生长和扩增效果。
细胞密度、温度、CO2浓度、培养时间等参数需要精确控制。
细胞密度不宜过高，以避免细胞过度接触和相互影响。
通常，培养温度设定为37°C，CO2浓度可调整到5%。
培养时间需根据细胞特性和实验目的确定，一般为2-3天。
3. 选择合适的培养基质培养基质是干细胞培养和扩增的重要组成部分，能够提供细胞附着、生长和分化所需的支持。
常用的培养基质有凝胶体、基质蛋白和金属氧化物。
凝胶体如明胶、琼脂、琼脂糖等可以提供细胞附着的基质，但对于干细胞的维持和扩增效果有限。
基质蛋白如胶原、纤维连接蛋白等能够模拟细胞在体内的生长环境，促进细胞增殖和分化。
金属氧化物如陶瓷材料、纳米材料具有优异的生物相容性和支持细胞生长的特性，被广泛应用于干细胞培养和扩增。
4. 加入适当的生长因子和激素生长因子和激素在干细胞培养和扩增中起到重要的促进作用。
人类胚胎干细胞通常需要外源性生长因子如Fgf、Tgf-β等，以维持其自我更新的能力。
对于多能性干细胞，添加适量的BMP、Activin等能够促进其向特定细胞类型的分化。
另外，激素如胰岛素、球囊素等可以提供能量和物质基础，促进干细胞的生长和分化。
造血干细胞体外培养
造血干细胞体外培养全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：造血干细胞是一类多能干细胞，能够自我更新并分化成各种类型的血液细胞，包括红细胞、白细胞和血小板。
这些干细胞的体外培养技术在医学研究和临床应用中具有重要意义。
造血干细胞体外培养技术是通过模拟人体骨髓或外周血中的生长环境，使干细胞在实验室中继续分化和增殖。
这种技术可以大幅增加干细胞数量，为临床干细胞移植和其他治疗方法提供更多的细胞来源。
造血干细胞体外培养的关键是提供适当的细胞培养基和生长因子。
细胞培养基需要包含足够的营养物质和生长因子，以维持细胞的生长和增殖。
生长因子是一类对细胞生长和分化起到重要作用的蛋白质分子，比如血细胞生成素、干扰素等。
在体外培养中，这些生长因子可以被加入到培养基中，以促进干细胞的增殖和分化。
另外，适当的细胞培养条件也是造血干细胞体外培养的关键。
温度、湿度、气体含量和pH值等因素都会对细胞的生长和分化产生影响。
保持培养环境的稳定和适宜可以提高干细胞的存活率和培养效率。
目前，造血干细胞体外培养技术已经广泛应用于临床医学领域。
例如，干细胞移植是一种治疗白血病、淋巴瘤等血液系统疾病的有效方法，而通过体外培养技术可以获得足够数量和质量的造血干细胞，为移植手术提供保障。
此外，造血干细胞还可以用于疾病模型的建立和药物筛选等研究领域。
然而，目前造血干细胞体外培养技术仍面临一些挑战。
一是干细胞的复杂性和多样性，不同类型的干细胞对于生长因子和培养条件的需求可能有所不同，需要进一步的研究和优化。
二是细胞培养的质量和成本问题，目前大规模生产合格的造血干细胞仍需要花费大量时间和成本。
因此，未来的研究和发展应该致力于解决这些挑战，提高造血干细胞体外培养技术的效率和质量，为临床和科研提供更好的干细胞资源。
同时，加强干细胞培养和应用规范化的研究也是未来发展方向之一，以确保干细胞治疗的安全和有效性。
希望在不久的将来，造血干细胞体外培养技术能够取得更大的突破，为医学和生命科学领域带来更多的福祉。
人骨髓间充质干细胞的体外连续传代及鉴定
广西 中医学 院学 报
人骨髓间充质干细胞 的体外连续传代及鉴定
岑妍 慧 ， 何国珍 ， 文文 ， 郭 陈 芳， 肖燕 子 ， 玉光 强 ５ ０２ ） ３０ １ （ 广西 医科 大 学 ， 西 南宁 广
摘
要 ： 目的］ ［ 将成人 骨髓 间充质干细胞（ Ｍ ｃ ） ｈ ｓ ｓ进行体 外连 续传代并对其进行干细胞 特性 的鉴定 。 方 法］ 用不连续密 ［ 采
１ 材 料与 方 法
１１ 材 料 ．
１１１ 实验 材料 ．．
骨髓标 本取 自本院 骨髓 检查正 常 的志愿
的培养瓶 中 ， 此时的细胞称为 Ｐ 代细胞。同法进行以后各 代 ｌ 细胞 的传代培养直至传 至 Ｐ 代 。采用 倒置显微镜下逐 日观 ５
察细胞形态 。
者， 性， 男 年龄 ２ ， ２岁 供者对 实验 知情 同意 。 １１ 主要试剂 ．． ２ ＬＤ Ｅ － Ｍ Ｍ培养基 、 Ｄ Ｍ培养基和胎牛 Ｈ— ＭＥ 血清均购 自美 国 Ｇ ｂｏ 司 ；胰蛋 白酶 、 Ｄ Ａ、 一 ｉｃ 公 Ｅ Ｔ Ｂ 甘油 磷酸 钠 、一 丁基一 一 ３异 １ 甲基 黄嘌呤 、 塞米松 、 地 维生素 ｃ均为美 国 Ｓｇ ａ公司产 品 ；ＩＣ标 志 的抗 Ｃ ４ Ａ ２ 抗 Ｃ ０ ｍ ｂ ｉ ｍ ＦＴ Ｄ ４ｍ ｂ 、 Ｄ１５ Ａ 、 抗 Ｃ ２ ｍ ｂ和抗 Ｃ ｇ ｍ ｂ及 其 同型 阴性 对照均 购 自美 国 Ｄ９ Ａ ＤＯ Ａ
ｅｉｓｉｎｅ 司 。 ｂｏｃｅｃ 公
ＭＳ ｓ并通过 观察其形态 学特征 和生长特性 、 Ｃ， 检测 细胞 表面 分子标 志物 的表达情况和验证细胞 向成骨细胞和脂肪细胞分
待原代培养细胞贴培养瓶底 面积达 ６％～０ ０ ７％左右 时 ， 吸
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进一步形成机体的所有组织、器官。为全能干细胞。
成体干细胞
是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种 以上子细胞的未成熟细胞。 来源于成年组织或器官，一般具有组织特异性， 只能分化成特定的细胞或组织。为多能干细胞 或单能干细胞，如造血干细胞和上皮干细胞等。
干细胞几个主要特征
具有自我更新能力与自我维持能力，可以无限增 殖分裂。干细胞一旦形成，在机体内终生都具有 自我更新能力，以维持自身数目的恒定。 既具有生理性的更新能力，也具有对损伤或疾病 导致的反应有修复能力，如骨髓间充质干细胞等。
干细胞维持自稳性的机制：对称分裂和不对称分裂
干细胞的对称分裂和不对称分裂
干细胞几个主要特征
干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境，也就是说 干细胞往哪一种方向分化，必须在该细胞生存的特定微 环境前提下进行分化。已有诸多的实验表明，如将ES细 胞种植入小鼠大脑内，这些干细胞将向神经系统分化。
在不同生长因子刺 激下干细胞可表现 出不同分化潜能
干细胞几个主要特征
干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运——保持 为干细胞或分化为特定细胞。
干细胞
分化细胞
干细胞
分 化 细 胞
对称分裂 （symmetry division）
不对称分裂 （asymmetry division）
4
干细胞几个主要特征
干细胞本身不是终末分化细胞；具有多向分化的能力 （多能性或全能性），即可以分化发育成各种胚层组 织的细胞（ES细胞），或可以分化成为本系统各谱系 的细胞（特定组织干细胞，如造血干细胞）。
干细胞的体外培养
一、干细胞的概念
干细胞 (stem cells, SC) 是一类具有自 我 复 制 能 力 (self-renewing) 的 多 潜 能 细胞，在一定条件下，它可以分化成多 种功能细胞。 干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的 细胞，具有再生各种组织器官和人体的 潜在功能，医学界称之为“万用细胞”。
1998年美国有两个小组分别培养出了人的多能干细胞： James A. Thomson在 Wisconsin大学领导的研究小组的 方法是：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取 inner cell mass细胞，建立细胞株。 John D. Gearhart 在 Johns Hopkins大学领导的另一个研究小组的方法是： 从受精后5－9周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞 ( primordial germ cell )，建立细胞株。 1999年12月，美国科学家在《美国科学院院刊》报告说， 小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化”为血液细胞。 随后，世界各国的科学家相继证实，成体干细胞，包括人 类的成体干细胞具有可塑性。 1999年12月，干细胞研究进展被《科学》杂志评选为该 年度世界十大科学进展之首。 2007年日本的Yamanaka研究小组和美国的James Thomson 研究小组分别获得诱导多能性干细胞 （induced pluripotent stem cell，iPS细胞）。
3、根据干细胞组织发生的名称进行分类:
胎胎干细胞 造血干细胞 骨髓间质干细胞 肌肉干细胞 成骨干细胞 内胚层干细胞 视网膜干细胞 胰腺干细胞
三、干细胞研究的历史情况
1959年，美国首次报道了通过体外受精（IVF）动物。 60年代，几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究表明其 来源于胚胎生殖细胞（embryonic germ cells, EG细 胞）,此工作确立了胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cells, EC细胞）是一种干细胞。 1968年，Edwards 和Bavister 在体外获得了第一个人 卵子。 70年代，EC细胞注入小鼠胚泡产生杂合小鼠。培养的EC 细胞作为胚胎发育的模型，虽然其染色体的数目属于异常。 1978年，第一个试管婴儿在英国诞生。
至今已分离得到的胚胎干细胞物种有：
小鼠的胚胎干细胞（1981） 金黄地鼠（1988）、貂（1993）、猪 （1994，1997）、鸡（1996）、恒河猴 （1995）、绒猴（1996）。 分离得到人的胚胎干细胞（1998），胚胎生 殖细胞（1998）， 目前不断报道成年组织来源的的干细胞。
二、干细胞的分类
1、按分化潜能大小来分类:
全能干细胞（ Totipotent stem cell ）：能分化成所有组织
和器官的干细胞，它具有形成完整个体的分化潜能。如受精 卵，胚胎干细胞。 多能干细胞（ pluripotent stem cell ），具有分化出多种组 织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育 潜能受到一定的限制。如骨髓多能造血干细胞是典型的例 子，它可分化出至少十二种血细胞 。 专能干细胞（ unipotent stem cell ），这类干细胞只能向 一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织 基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等。
1981年，从小鼠胚泡内细胞团分离出小鼠ES细胞， 并建立了小鼠ES细胞体外培养条件。将ES细胞注入小 鼠，能诱导形成畸胎瘤。 1984-1988年，Anderews 等人从人睾丸畸胎瘤细 胞系Tera-2中产生出多能的、可鉴定的（克隆化的） 细胞，称之为胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cells, EC细胞）。克隆的人EC细胞在视黄酸的作用下 分化形成神经元样细胞和其他类型的细胞。 1989年，Pera 等分离了一个人EC细胞系，此细胞系 能产生出三个胚层的组织。这些细胞是非整倍体的 （比正常细胞染色体多或少），他们在体外的分化潜 能是有限的。
2、根据来源来分:
来源于胚胎--- 胚胎干细胞 ESC
（Embryonic Stem Cell ）
胚胎性生殖细胞 EGC
（Embryonic Germ Cell ）
来源于成体组织--- 成体干细胞 ASC （Adult-derive（桑椹胚）或原始 生殖细胞获得的一种具有多潜能性、可发育成 为各种细胞、同时可保持不分化状态而持续生 长的克隆细胞系。