生化实验期末考资料

● 氨基酸的分离鉴定（纸层析法）

分配层析：是一种连续抽提法。一种溶剂通常是被结合在固定的惰性支持物（柱、膜、纸）上的水，另外一相由流动的被水饱和的有机溶剂构成，它流过固定相。如果某一混合物的各组分在这两相中的分配系数有足够的差异，它们就可以被分离。（固定相和流动相） 分配系数：在一定条件下，某一组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值。

纸层析法：是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置使用R ƒ值（比移）来表示：

影响Rf 值的因素：在一定的条件下某种物质的Rf 值是常数。Rf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。

纸层析过程：点样，扩展，显色，计算

扩展剂（展层剂）：4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20mL 正丁醇和5mL 冰醋酸放入分液漏斗中，与15mL 水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，上层即为扩展剂。

显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液

● 蛋白质的性质实验（等电点测定和显色反应）

等电点：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH 达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH 值称为此种蛋白质的等电点（pI ）。

蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。（水化层和双电层）

蛋白质的沉淀反应可分为两类：可逆的沉淀反应（蛋白质分子的结构尚未发生变化。如盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。）不可逆的沉淀反应（蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，如加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类)

0.4%酪蛋白醋酸钠溶液：称取0.4g 酪蛋白（干酪素），加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬浮液移入200mL 锥形瓶内，用少量40～50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10mL 1mol/L 醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移至100mL 容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。

0.2mol/LpH4.7醋酸-醋酸钠的缓冲液：先配制A 液与B 液，取A 液1770mL ，B 液1230mL 混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000mL 。A 液（0.2mol/L 醋酸钠溶液）：称NaAc •3H2O 54.44g ，定容至2000mL 。B 液（0.2mol/L 醋酸溶液）：称优级纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g 定容至1000mL 。

● 透析实验

透析：蛋透析是利用半透膜进行的一种选择性扩散操作，通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。（白质的透析和糖类的透析）

● 蛋白质的含量测定（一）——考马斯亮蓝染色法

分光光度法：是一种利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法。

分光光度计都包括光源、单色器、吸收池、检测器和显示装置（显示仪表）。

在紫外光波区检测选用石英、蓝宝石比色杯；在可见光波区检测可选用有机玻璃比色杯。

考马斯亮蓝G-250染色法优点：简单迅速，灵敏度高，一些阳离子如K+、Na+、Mg2+、NH42+以及乙醇等物质都不干扰测定。缺点：但一些去污剂如TritonX-100、SDS 等严重干扰测定，且样品测定后不能回收。

考马斯亮蓝G-250原理：（染料结合法）在游离状态下呈棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色，前者的最大光吸收在465nm ，后者在595nm ，在一定蛋白质浓度范围内（0.01～1.0mg/mL ），蛋白质-色素结合物在595nm 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。 ● 蛋白质的含量测定（二） ——紫外吸收法

紫外吸收法的原理：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm 。在一定波长处，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度成正比，因此可以进行蛋白质含量的测定。

紫外吸收法的优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用；低浓度的盐和大多数缓冲液都不干扰测定，适合柱层析洗脱液的快速连续检测。

紫外吸收法的缺点：准确度较差，干扰物质多；在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差；样品中若含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰；测定时受样品的pH 影响较大， ● 蛋白质的性质实验（蛋白质及氨基酸的橙呈反应）

双缩脲反应：尿素加热至此180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，结构与双缩脲相似，能发生此反应。故该方法可用于蛋白质的定性或定量测定。

原点到溶剂前沿的距离

原点到层析中心的距离 R f

茚三酮反应：所有的α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质，除了脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质。该反应十分灵敏，1﹕1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。

茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮结合另一分子水合茚三酮和氨缩合生成有色物质。

黄色反应（Pauly反应）：含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。

●肌糖原的酵解作用

用乳酸的生成来检查糖原或淀粉的酵解作用：糖类和蛋白质干扰乳酸的测定，因此在除去蛋白质与糖后，乳酸可与硫酸共热产生乙醛，后者再与对羟基联苯反应产生紫红色物质。此法比较灵敏，每毫升溶液含1～5μg乳酸即可检出。

●酵母核糖核酸的分离及组分鉴定：RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到

RNA的粗制品。

酵母核糖核酸的分离步骤:1、将5 g酵母粉悬浮于30mL0.04mol/LNaOH溶液中，并在乳钵中研磨均匀。2、将悬浮液转移至100mL锥形瓶中，在沸水浴中加热30min，冷却。3、将悬液转入离心管中，3000r/min离心15min，将上清液缓缓倾入10mL酸性乙醇溶液中。（注意：要一边搅拌一边缓缓倾入。）4、待核糖核酸沉淀完全后，3000r/min离心3min，弃去清液。5、用95%乙醇洗涤沉淀2次，乙醚洗涤沉淀1次后，用乙醚转移沉淀至布氏漏斗中，抽滤。6、沉淀在空气中干燥，得到酵母核糖核酸。

核糖核酸组分：含有核糖、嘌呤碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解。

测定核糖的常用方法是苔黑酚法（又称地衣酚，3，5-二羟基甲苯）（Orcinol反应）。测定脱氧核糖常用的方法是二苯胺法。

核糖核酸组分的鉴定:称取200mg提取的核酸，加入1.5mol/L硫酸溶液10mL，在沸水浴中加热10min，制成水解液。

嘌呤碱的鉴定：取水解液1mL加入过量的浓氨水，然后加入约1mL0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。

核糖的鉴定：取1支试管，加入1mL水解液、2mL三氯化铁浓盐酸溶液和0.2mL苔黑酚乙醇溶液，置沸水浴中10min。（注意：溶液变成绿色说明核糖的存在。）

磷酸的鉴定：取1支试管，加入1mL水解液和1mL定磷试剂，在水浴中加热，观察溶液变成蓝色，说明磷酸的存在。

●酪蛋白的制备

原理：牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。

●酶的特性

温度对酶活性的影响：酶的催化作用受温度的影响，在最适温度下，酶的反应速度最高。酶对温度的稳定性与其存在形式有关，有些酶的干燥制剂虽加热到100℃，其活性并无明显的改变，但在100℃的溶液中却很快地完全失去活性。低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。

pH对酶活性的影响：唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。

唾液淀粉酶的活化和抑制：氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。

酶的专一性：唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，用Benedict试剂检查糖的还原性。

用碘液检查淀粉水解情况：淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色。在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。

Benedict试剂：无水硫酸铜17.4g溶于100mL热水中，冷却后稀释至150mL。取柠檬酸钠173g，无水碳酸钠100g和600mL水共热，溶解后冷却并加水至850mL。再将冷却的150mL硫酸铜溶液倾入。本试剂可长久保存。

●血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳

影响泳动速度的因素：内在：质点所带净电荷的量、质点的大小、形状；外界：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度、电渗现象。

●血糖的定量测定

GOD-PAP法原理：即氧化酶-过氧化物酶法测定血糖依据的酶反应为：葡萄糖+O2+H2O→葡萄糖酸+H2O2

2H2O2+4-氨基安替吡啉+酚→醌亚胺+4H2O 醌亚胺在A480nm~A550nm波长有最大吸收，所产生颜色的深浅与血清中葡萄糖的量成正比。在同样条件下，测定葡萄糖标准液和样品的光吸收值，即可求出样品中葡萄糖的含量。

葡萄糖浓度计算公式：

●脂肪酸的Β-氧化

脂肪酸β-氧化所生成的乙酰辅酶A在人及哺乳动物肝外组织中，大部分可迅速通过三羧酸循环氧化成二氧化碳和水，并产生能量，或被某些合成反应所利用。但是在肝脏中，脂肪酸的氧化不很完全，经β-氧化作用生成的二分子乙酰辅酶A可缩合生成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可以还原生成β-羟丁酸。乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮统称为酮体。肝脏中有活力很强的生成酮体的酶。(碘量法计算生成丙酮的量）

计算丙酮的量：每1克肝脏反应生成丙酮的量（mmol/g）=(B－A)×CNa2S2O3×1/6(CNa2S2O3=0.01mol/L)(标准硫代硫酸钠C)