基因工程育种技术

基因工程育种技术基因工程又称重组DNA技术，是指将一种或多种生物的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物(受体)，使受体按人们的愿望表现出新的性状。

基因工程诞生于1972年，在其后几年中由于担心重组生物对环境安全的影响，基因工程技术的发展曾一度受挫。

但随着人们对DNA重组所涉及的载体和受体系统进行有效的安全性改造，以及相应的DNA重组实验室设计和操作规范的建立，再加上重组DNA技术的巨大应用潜力的诱惑，重组DNA技术迅速发展，现在，基因工程已成为生物学实验室的一项常规技术，并广泛应用于医药、农业、食品、环保等许多领域。

第一节基因工程的基本过程和原理基因工程最典型的操作如图6-1所示一般包括以下三个步骤：1．外源DNA的获得与酶切；2．外源DNA与经同样酶切的载体的连接；3．连接产物转化受体细胞及阳性转化子的筛选；分离D NA酶切酶切供体细胞重组转化子图6-1 基因工程的基本过程由图6-1可见，基因工程操作过程需要以下基本材料：外源DNA(基因)、载体、DNA 体外重组用的酶以及宿主细胞。

一、 载体外源基因导入受体细胞一般都要借助于载体，基因工程中最常用的载体是质粒载体。

图6-2所示pUC19就是最常用的载体之一。

图6-2 载体pUC19及其多克隆位点载体一般含有以下几个基本元件：(一) 复制原点载体在宿主细胞中要独立存在则应具有独立复制的能力，复制原点又称为复制起始位点(Origin，简称ori)，控制载体复制。

不同生物的载体复制原点不同，同一种生物的不同载体拷贝数和稳定性有很大差别，这主要决定于载体的复制原点的性质。

图6-2所示的pUC 系列载体的复制原点是pAM1的一个突变体，在合适的大肠杆菌宿主细胞中(如大肠杆菌JM109)其拷贝数可达500。

整合型载体的复制原点被整合位点的同源序列替代。

(二) 筛选标记一般是载体上的一段编码酶的基因，能赋予转化子新的性状，便于转化子的筛选。

载体pUC19的筛选标记是β-内酰氨酶基因（常简写为bla或Amp r），能分解氨苄青霉素中的β-内酰氨环使其失活，因此在含氨苄青霉素的平板上，只有含质粒的转化子能生长而不含质粒的宿主细胞不能生长。

抗药性是细菌载体中最常用的筛选标记，除氨苄青霉素抗性外，卡那霉素、氯霉素、四环素等抗性也常用作载体的标记。

另一类常用的标记是营养缺陷型互补标记，在真核生物载体中更常用。

(三) 多克隆位点（multi cloning site, 简写为MCS）载体中用于插入外源基因的区域，往往是一段人工合成的序列，这一序列中含多种限制性核酸内切酶的识别位点。

图6-2下方即为载体pUC19的多克隆位点，这一段序列可被十多种限制性内切酶识别，酶切后能产生多种黏性末端，有利于外源DNA片断的插入。

除质粒载体，cosmid、细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)、酵母人工染色体(Yeast Artificial Chromosome，YAC)等也是基因工程中常用的载体，这些载体适合于插入长片段的外源DNA，主要在构建基因库时使用。

二、DNA重组用酶DNA重组过程最常用的酶是限制性核酸内切酶和连接酶，这两种酶几乎应用于DNA重组的所有实验中。

(一) 限制性核酸内切酶（Restriction Endonuclease）目前已发现的限制性核酸内切酶有600多种，根据性质不同分为3类，基因工程中常用的是II类酶，这类酶有比较专一的识别和切割位点，通常专一性的识别DNA序列中4～6个碱基的回文序列。

表6-1列出了几种最常用内切酶的识别序列。

表6-1 常用的限制性核酸内切酶限制性内切酶和后面介绍的连接酶都有商品出售，一般在需要时向有关厂商索取产品目录，再根据实验需要决定使用哪些酶。

(二) 连接酶DNA 连接酶催化的基本反应是将DNA双链上3’-羟基和5’-磷酸基共价结合形成3’－5’磷酸二酯键。

基因工程中最常用的DNA 连接酶是T 4-DNA 连接酶，反应机理如图6-3所示。

图6-3 T 4-DNA 连接酶的作用DNA 重组实验中，最常见的反应是将外源DNA 片段和载体用相同的核酸内切酶切开，使外源DNA 片断和载体带有相同的黏性末端，两者混合后迅速降温至14～20℃，由于带有相同的黏性末端一部分外源片段和载体互相退火，形成带切口（Nick ）的双链环装重组质粒，在连接酶的作用下切口被修复，形成完整的闭合环状重组质粒。

(三) 宿主细胞野生型细菌对外源DNA 的转化效率较低，需要进行遗传改造。

野生型细菌具有针对外源DNA 的限制和修饰系统，能降解外源DNA ，因此转化效率很低。

大肠杆菌的限制修饰系统主要由hsd R 基因编码，许多经改造的大肠杆菌宿主菌为hsd R －，转化效率大大高于野生型大肠杆菌。

以外源基因克隆和重组为目的的基因工程实验需要重组载体在宿主菌中自主复制，在野生型细菌中存在的rec基因家族的编码产物使外源基因能与染色体发生同源重组。

在野生型大肠杆菌中，存在着两条体内同源重组的途径，RecBCD途径和RecEF途径，两条途径均需要RecA重组蛋白的参与，RecA是同源重组所必须的。

rec A－型大肠杆菌体内的遗传重组频率降低106倍。

常用的大肠杆菌宿主菌常常是rec A－、rec B－、或rec C－，有些宿主则三个基因均被灭活。

为提高受体的转化率有时还通过遗传改造提高细胞壁的通透性。

目前基因工程实验中常用的大肠杆菌宿主有JM109、DH5α、TG1等，这些菌株经过复杂的遗传改造除具有很高的转化效率和很低的重组频率外还具有一些其他的特性便于重组质粒的筛选。

另一些大肠杆菌宿主菌如C600、JM101等保持了较完整的限制修饰系统或遗传重组系统，这些菌株的转化率要低一点，常用作一些穿梭载体的宿主，有时从这些宿主菌中提取的质粒用于转化野生型宿主时能获得较高的转化率，因此在工业微生物的改造中很有价值。

(四) 外源DNA外源DNA一般即为DNA重组的目的基因，获得目的基因是基因工程的核心问题，根据对目的基因的了解程度可采用鸟枪克隆法、cDNA克隆法、PCR法以及化学合成法等。

1. 鸟枪克隆法的原理鸟枪克隆法的基本过程如下：首先是构建供体菌的基因文库。

提取供体菌的染色体DNA，不完全酶切。

酶切染色体最常用的是一种叫Sau3 A的核酸内切酶，这种酶的识别位点是GATC，由于只有四个碱基，因此在染色体上出现频率很高，通过控制酶浓度和反应时间使只有一部分位点被切开，如控制得好几乎可以达到随机切割的目的，另外Sau3A酶切产生的黏性末端和Bam H I是相同的，因此酶切产物可以和用Bam H I酶切的载体连接。

根据目的基因的性质，可以采用不同的反应条件以分离不同长度的DNA片段，部分酶切后再通过电泳将DNA片段分开，从电泳凝胶上分离大小合适的片段。

克隆细菌或酵母的单个基因一般分离5Kb左右的片段就足够。

当然分离更长的片段有利于减小筛选的工作量，但要获得大的酶切片段首先要求提取的染色体足够长，另外在质粒载体中接入长片段的DNA特别是大于10kb的片段是很不容易的事。

将分离的DNA片段与用Bam H I酶切并去除5’端磷酸的载体连接转化大肠杆菌宿主。

在相应的选择性平板上筛选重组质粒。

如果实验成功则绝大多数的转化子应含有插入片段大小合适的重组质粒，同时转化子应该足够多以确保绝大部分基因被包含在转化子的质粒中。

将转化子收集起来就获得了该供体菌的基因库。

一个完整的基因库应收集的转化子的数量一般可用Charke-Carbon 公式计算：N ＝ln(1-P)/ln(1-f)。

其中N 为构建基因文库的重组转化子总数，P 为基因文库的完备性（即某一基因被克隆的概率），f 为克隆片段长度和生物单倍体基因组总长之比，例如酿酒酵母的基因组总长为12,068 kb ，如克隆片段的长度为5 kb ，如要求基因文库的完备性为，则根据上式计算N 应为5,550，即收集的重组菌落数应不少于5,550，在绝大部分情况下，P ＝是完全足够的。

第二步是从基因文库中筛选含目的基因的重组菌。

根据对目的基因的了解，可以采用不同的方法进行筛选，其中最常用的方法可能是菌落原位杂交法。

这种方法首先要求知道目的基因的部分序列。

利用这一部分序列制成带标记的探针，用探针去找出含目的基因的重组菌。

其过程如图6-4 所示。

重组菌平板用N aO H 处理变性中和、烘干D N A 固定于膜上将探针和尼龙膜放入杂交袋中作杂交反应，探针与互补的D N A 结合通过放射自显影显示杂交菌落，并在原平板找到对应菌落图6-4 菌落原位杂交首先将基因文库涂布相应的抗菌素平板，控制每块平板的菌落数在50～200。

将菌落影印到一形状与平板相似的尼龙膜上，将粘有菌落的尼龙膜用NaOH 处理使细胞破裂DNA 释放到膜上，同时DNA 在强碱性条件下变性为单链，烘烤使DNA 固定在膜上。

将粘有DNA 的尼龙膜适当处理后，放入杂交袋中，加入已被标记的探针。

标记常用放射性元素如32P ，当然在缺乏防护条件的情况下也可以用生物素和地高锌标记，不过灵敏度不如放射性标记。

将探针作预处理，使其成为单链，加入杂交袋中，杂交过夜。

探针和目的基因的对应片段是互补的，因此如某一菌落含有的重组质粒插入了目的基因则探针应与粘有该菌落的膜在对应位置结合并把标记也一起带到膜上，通过一定的方式这一位置可以被显示出来，在原平板上找到对应的菌落，这个菌落所含的质粒中应插入了目的基因。

如插入片段不是很长可以将插入片段的序列全部测出，通过序列比对找出目的基因。

如插入片段很长则可以将插入片段进一步酶切成小片段再寻找到含目的基因的小片段，这一过程常被称为亚克隆。

用菌落原位杂交筛选目的基因首先要获得目的基因的部分序列或至少是一段与目的基因序列相似性很高的DNA片段，显然这一序列还必须是宿主菌所没有的。

这一片段一般可以通过两条途径获得，一是将已知的来源于其他物种的同源基因的序列（一般采用保守性更好的氨基酸序列）进行比对，找出其中高度保守的序列，根据保守序列设计引物，以供体菌染色体DNA为模板通过PCR获得目的基因的部分片段，如果序列分析确认PCR所获片段确实是目的基因的片段则这一片段可以用于制作探针。

另一种方法是分离目的基因编码的蛋白质，通过分析氨基酸序列设计简并引物再通过PCR获得目的基因的部分序列，再根据这部分序列通过杂交“钓”出基因的全序列。

从基因库中筛选目的基因的另一类方法是通过目的基因的产物来筛选。

一般如果目的基因的产物很容易检测，如产物是淀粉酶、蛋白酶等则可以直接在平板上筛选。

有些目的基因还可以通过与宿主菌的功能互补来筛选，使用这一方法必须有相应的基因功能缺陷的菌株。

采用免疫学方法也能比较方便的检测基因的产物。