微生物基本操作规范(4)接种、分离纯化

图4-5 倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解
1.菌悬液 2.熔化的培养基 3.培养物 4.无菌水
稀释倒平板和涂布法
4.2.6涂布平板法
首先把微生物悬液通过适当的稀释， 取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的 琼脂平板上，然后用灭菌的L型玻璃棒把稀 释液均匀地涂布在培养基表面上，Байду номын сангаас恒温 培养后即可观察。（图4-5 b）
4.1.1接种工具
图4-1 接种和分离工具
1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀
4.1.2无菌操作
培养基经高压灭菌后，用经过灭菌 的工具（如接种针和吸管等）在无菌条 件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌 悬液等）于培养基上，这个过程叫做无 菌接种操作。 在实验室检验中的各种接种必须是 无菌操作。
4.将已灭菌的接种环伸入菌种管中，从斜面上 取菌少许，迅速伸入待接种的培养基管中， 在斜面底部向上划一条直线，然后从底部起 向上作曲折连续划线，直至斜面上方顶端。 5.取出接种环，火焰灭菌管口，塞上棉塞（先 塞内管）；最后将接种环经火焰灭菌放好。 6.做好标识，置35℃培养 箱中培养18~24小时。 斜面培养一般形成均匀一 致的菌苔。一般可观察表 面、透明度、色泽等特征。
菌落形态观察
1)大小:以mm表示。菌落的大小随细菌种类、 培养基及培养时间等条件而不同。同一种细 菌在同一平板上，在密集处的菌落比疏散处 小。因此，表示菌落大小时，应注明培养基 名称。一般以培养18~24小时后，选散在处的 菌落大小。1mm左右为小菌落；2~3mm为中 等大；3mm以上为大菌落。 2)形状及边缘：圆形、不规则、放射状、树根 状、边缘整齐、波形、锯齿状、卷发状等。 3)隆起：平的、突起的、凸面的、凸形的等。 4)表面：光滑（S型）、粗糙（R型）；有无光 泽等。
5)构造:均匀、露滴状、颗粒状、发状、皱招状等。 6)颜色：无色、白色、灰色、灰白色或乳白色、荧 光绿、金黄色、柠檬色、红色等、 7)透明度：透明、半透明、不透明、微透明等。 8)硬度：硬、软、干燥、湿润，是否附着于培养基 上或嵌入培养基内不易刮取。 9)质地：脂状、粘液状、膜状等。 10)乳化性：在盐水中研磨是否形成均匀乳剂或颗 粒状。 11)溶血性：在血平板上，菌落周围有无溶血环。
3.方格划线法
将培养物涂布于平板上1/5处，接种环经 火焰灭菌后，自1/5划线处作平行划线5~6条， 将接种环灭菌后，划垂直线5~6条，使呈正方 形格。其他操作同前。
细菌在固体培养基表面只能在固定的 地方生长繁殖，经过一定的培养时间后， 可形成肉眼可见的菌落。菌落中只含有一 种细菌，而每种细菌的菌落各有其特征。 菌落形态往往有助于初步识别细菌；还可 以由此获得细菌而进行一系列的鉴定。 识别菌落的能力是从事微生物检验人 员的极为重要的基本功。
接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接 种的器具必须经干热或火焰等灭菌。 接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上 充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过 火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环 冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体， 迅速地接种到新的培养基上。然后，将接种环从柄 部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环， 以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。 平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿 的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养 基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边， 试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。
a.发育程度：有无生长、微弱、中等、旺盛。 b.混浊度：有无及程度（混、中等、微混、透明）、均匀混浊、 有颗粒、絮状生长。 c.沉淀:有无及量多少、性状（粉状、颗粒状、絮状、沾性）。 d.表面：有无生长、性状（膜状、环状）、菌膜厚薄及表面特征 （光滑、颗粒、皱状）。 e.其他：有无特殊气味，色素。如果是糖发酵培养基则主要观察 是否产酸和有无气体。
4.2.4 穿刺接种法
多用于保存菌种、观察动力及厌氧培养等 也可以用于观察细菌的某些生化反应。 1.如斜面接种法持好菌种管及培养基管。 2.以灭菌接种针从菌种管取菌，垂直刺入培养基 的中心（半固体或一般琼脂高层）直达近管底 部（但不能完全刺到管底），接种针应沿原路 退出。 3.经培养后半固体培养基可观察到：沿穿刺线生 长，线外的培养基清亮表示细菌无动力；穿刺 线模糊不清，或沿穿刺线向外扩散生长，或整 个培养基混浊表示细菌有动力。
食品微生物检验 规范操作基础培训
4 接种、分离纯化
福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室 2010.05
主要内容：
§
1 § 2 § 3
§
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清洗、消毒和灭菌操作 培养基的制备 采样和取、制样
4
接种、分离纯化
制片、染色及显微观察 实验室安全基础知识
5 § 6
§4接种、分离纯化
4.1接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人 工培养基上或活的生物体内的过程叫做 接种。
图4-3 细菌的培养特征 1.点状 2.圆形 3.丝状 4.不规则形 5.假根状 6.纺锤状 7.扁平 8.隆起 9.凸起 10.垫状 11.脐状 12.边缘整齐 13.波状 14.裂片状 15.啮蚀状 16.丝状 17.卷发状 18.丝线状 19.刺毛状 20.串珠状 21.疏展状 22.树根 状 23.假根状 24.丝状 25.串珠状 26.乳头状 27.绒毛状 28.树根状 29.量杯状 30.萝卜状 31.漏斗状 32.囊状 33.层状 34.絮状 35.环状 36.蹼状 37.膜状
4.2.2 斜面接种法
主要用于经划线分离培养所获得的单个菌 落的移种，以及观察细菌的某些培养特征。 以菌种移种为例，其接种方法是： 1.取一菌种管和培养基管，置左手食指、中指、 无名指间，拇指压住两管底部上侧面，使菌 种管位于外侧，培养基管位于内侧。 2.右手拇指和食指分别旋松两管棉塞。火焰灭菌 接种环。 3. 以右手小指与手掌，小指与无名指分别夹取 棉塞（先外管后内管），将两管口迅速通过 火焰1~2次。
图4-4 斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞
4.2.3 液体接种法
1.如斜面接种法持好菌种管及培养基管。 2.灭菌接种环，从菌种管取菌，伸入培养基管中，在接近 液面的管壁上方轻轻研磨，并沾取少许培养基液体调和， 使细菌混合于培养基的液体中。液体培养基一般以 18~24小时培养后观察生长特征。 肉汤培养可观察如下几项：
图4-2 平板划线分离法 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
1.曲线划线分离法
1)先将接种环火焰灭菌,待冷后取培养物少许; 2) 左手拿起平板，以中指为支点，并用拇指和 食指将平板盖打开； 3)右手迅速将取有培养物的接种环从打开的空 间插入平板内，使接种环与培养基表面呈 45℃角，在酒精灯上方5~6cm处划线接种。先 在平板上1/5处轻轻涂布，然后即可左右来回 以曲线形式作连续划线接种，线与线间留有 适当距离，将整个平板表面划满曲线； 4)注明标识后，置35℃培养箱中培养，一般在 18~24小时后观察结果。
4.2接种法与纯培养的分离技术
含有一种以上的微生物培养物称为 混和培养物（Mixed culture）。 如果在一个菌落中所有细胞均来自 于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯 培养（Pure culture）。 在进行菌种鉴定时，所用的微生物 一般均要求为纯的培养物。得到纯培养 的过程称为分离纯化。
4.2.1平板划线分离培养法
平板划线分离培养法，用无菌的接种环取培养 物少许在平板上进行划线，使培养物中混在的多种 细菌在培养基表面分散生长，各自形成菌落，根据 菌落的形态及特征，挑选单个菌落，经过移种而获 得纯种细菌（纯培养）。 分离细菌的方法很多，最常用的是平板划线分 离法。根据划线的方式不同有斜线法、曲线法、方 格法、放射法、四格法等。（图4-2）
4.2.5倾注平板法
首先把微生物悬液通过一系列稀释，取 一定量（1mL）的稀释液加入已熔化并冷却至 45~50℃的15mL（使用直径90mm的平皿时）普 通琼脂管中，立即摇匀，趁琼脂未凝固前倾 注于已灭菌的平皿中，待凝固之后，将平板 倒置在培养箱中培养。 （图4-5 a） 培养后观察，细菌大部分分散于琼脂层 内，形成深层菌落，有一部分可生长于表面。
2.斜线(分区)划线分离法
1)用接种环先将培养物涂布于平板1区并作数次 划线,再在2、3……区依次划线。 2)每划完一个区域，均将接种环灭菌一次，待冷 后再划下一区域。 3)每一区域的划线均接触上一区域的接种线1~2次， 使接种量逐渐减少，以获得单个菌落。 4)其他操作与上述曲线划线分离法相同。
斜线接种示意图
4.3.2 微生物的培养方法
根据培养时是否需要氧气，可分为：
1.好氧培养：
(1)固体表面培养法 ：斜面、培养皿、克氏瓶等 (2)液体培养法：静止、摇瓶振荡
2.厌氧培养：
(1)深层穿刺培养 (2)化学吸氧与深层穿刺相结合 (3)抽气法：干燥器、简易的真空和气体交换法、厌氧罐
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4.3 微生物的培养
研究和鉴定细菌时所提到细菌的特征指的是细菌 菌落的特征，而不是单个细菌的特征。大量食品微 生物的质量检测是对可见菌株的检测，现在衍变到 给待检测细菌提供适当的条件使之代谢繁殖后再进 行检测。因此在细菌学研究中，最基本的要求是有 能促使单个细菌生长和繁殖的物质和方法。能给细 菌提供适当生长环境的营养物质称为培养基。 根据接种培养方式的不同，可将培养基以多种形 式分装到试管、三角瓶或螺帽瓶中，试管或三角瓶 的瓶口可用适当的棉塞、金属帽、塑料帽等盖紧。 螺帽的优势是能够阻止蒸汽蒸发，避免培养基在保 存过程中干燥。
4.3.1 培养的类型
1.液体批量培养：在液体培养基中培养，培养过程不 需要加入新的培养基。 2.琼脂斜面培养：在试管中装入约5mL固体培养基融 化后摆成斜面冷却。将接种物涂布到斜面或用接种 环在斜面上划线。 3.穿刺培养：将含琼脂培养基的试管或瓶子垂直放置， 使培养基凝固，用接种针挑取少量接种物垂直穿入 至容器的中部。 4.半固体培养：菌株生长的培养基含有足够的琼脂 （0.02%~0.3%）使其有一定的黏度，但却没有完全 固化。 5.振荡培养：用摇床进行微生物振荡培养。 6.平板培养：平板划线法、倾倒平皿法。