实验一 叶绿体的分离与荧光观察

实验一叶绿体的分离与荧光观察

一、实验目的：

（1）通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。（2）观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。

二、实验原理：

将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。一次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。

叶绿体的分离应在等身溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体损伤。将匀浆液在1000r/min的条件下离心2分钟，以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min 的条件下离心5分钟，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在0℃~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。

利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油。

三、实验用品：

1、材料：新鲜菠菜

2、试剂：

（1）0.35mol/L氯化钠溶液

（2）0.01%吖啶橙（acridine orange）

3、器材：

（1）主要设备：普通离心机，组织捣碎机，粗天平，荧光显微镜。

（2）小型器材：500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管20支，10ml刻度离心管20支，试管架5个，纱布若干，无荧光载玻片和盖玻片各4片等。

四、实验方法：

1、叶绿体的分离与观察：

（1）选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。

（2）利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆2~3分钟。

（3）将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。

（4）取滤液4ml在1000r/min下离心2min。弃去沉淀。

（5）将上清液在3000r/min下离心5分钟。弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。

（6）将沉淀用0.35mol/L NaCl 溶液悬浮。

（7）取上述叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察：①在普通光镜下观察；②在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光；

③在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光，取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载玻片

上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料，加盖玻片后即可在荧光显微镜下观察。

2、菠菜叶手切片观察：

用剃须刀片将新鲜的嫩菠菜叶切削出一斜面置于载玻片上，滴加1-2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖玻片后轻压，置显微镜下观察。

（1) 在普通光镜下观察。

（2)在荧光显微镜下观察其直接荧光。

（3)观察其间接荧光：向所制手切片上滴加1-2滴0.01%吖啶橙染液，染色1分钟，洗去余液，加盖玻片后即可在荧光显微镜下观察其间接荧光。

五、实验结果：

1、叶绿体的分离和观察：

（1）在普通光镜下，叶绿体呈现绿色的长椭圆形。

（2）在荧光显微镜下，当用绿光照射时，叶绿体发出红色荧光；

而用蓝光照射时，同样发出红色荧光，相对绿光照射时的较暗。

而用吖啶橙染色后，叶绿体发出红色荧光，而混杂在其中的细胞核细胞核发出绿色荧光。

2、菠菜叶手切片观察：

1）在普通光镜下可以看到3种细胞：

（1）表皮细胞（边缘锯齿状，细胞整体呈鳞片状）

（2）保卫细胞（成对存在，肾形）

（3）叶肉细胞（排列成栅状，细胞整体成长方形）

（4）叶绿体（绿色，长椭圆形）