柑橘溃疡病生防细菌的分离鉴定

柑橘溃疡病生防细菌的分离鉴定

陈娇梅;蔡学清;邱思鑫;胡方平

【摘要】为了从柑橘上获得能防治柑橘溃疡病的生防细菌,从福州3个地区的柑橘园采集不同柑橘品种的叶片、春稍和花,用稀释分离法分离得到84株细菌菌株,用平板抑菌圈法筛选获得11株对柑橘溃疡病菌具有拮抗作用的菌株;用离体叶片防效筛选获得39株对柑橘溃疡病具有50％以上防效的菌株,占菌株总数的46.4％.对3株防效显著的拮抗菌株YH1、YS5和NY20进一步进行防效测定,结果表明:菌株培养液的防治效果最好,菌体次之,代谢产物最差;对这3株细菌的β-1,4-葡聚糖酶、蛋白酶和β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活性进行测定,结果表明酶活性的强弱与防病效果有一定的相关性.经过16S rDNA序列分析,革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色和生理生化测定,确定这3个菌株均属于芽孢杆菌属,其中菌株YH1鉴定为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus.

【期刊名称】《热带作物学报》

【年(卷),期】2014(035)007

【总页数】6页(P1398-1403)

【关键词】柑橘溃疡病;拮抗菌;芽孢杆菌;生物防治

【作者】陈娇梅;蔡学清;邱思鑫;胡方平

【作者单位】福建农林大学植物保护学院,福建福州 350002;福建农林大学植物保护学院,福建福州 350002;福建省农业科学院作物研究所,福建福州 350013;福建农林大学植物保护学院,福建福州 350002

【正文语种】中文

【中图分类】S476

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.025

柑橘溃疡病（Xanthomonas axonopodis pv.）是影响全球柑橘产业发展的重大顽固细菌性病害，已经被世界上30多个国家和地区定为植物检疫性有害生物[1]。目前中国以广东、福建、台湾、广西、四川等省区的柑橘受害最重，湖南和其他柑橘产区也都有不同程度受害[2]。该病害可危害芸香科数十种植物，传播途径广、传染迅速、危害严重，对农业生产造成巨大损失[3-5]。生产上主要使用的化学农药依然是常见的几种，缺乏推陈出新[6]。长期使用化学农药不但会使病菌产生抗性，而且会污染环境，造成农药残留，对人体产生负面影响。近年来，随着人们对农产品品质和安全性要求的提高，使柑橘溃疡病的生物防治得到了重视，并开展了一系列的研究工作。如周吉奎等[7]报道了从柑橘叶片和果实表面分离的K-2与K-8两株拮抗细菌在温室和大田防治试验中对柑橘溃疡病都有良好的防治效果；张洪波等[8]在柑橘表面分离到的葡萄糖杆菌属Kx15菌株和乳酸杆菌属Kx48菌株，在温室对柑橘溃疡病的防治效果分别达到45.6%和55.6%；陈力等[9]研究确定了从柑橘叶表面分离的枯草芽孢杆菌CQBS03抑菌活性成分是蛋白质，对柑橘溃疡病的抑菌活性高并且稳定。易龙等[10]从脐橙根际土壤分离的枯草芽孢杆菌G32，在室内对柑橘溃疡病的预防效果达60.7%。谭小艳等[11-13]研究报道，从柑橘园土壤中、柑橘叶片表面和柑橘叶片中分别分离的鲍氏不动杆菌Bt8、枯草芽孢杆菌Bv10和洋葱伯克霍尔德氏菌Bc51，在温室测试中，分别获得了55.2%、42.9%和60.3%的病斑抑制效果；以上这些研究主要集中在湖南、江西等地，为获得对福建柑橘溃疡病有较好防效的菌株，本研究拟从福建福州3个柑橘园采摘叶片、春稍和花进行分离筛选，并对其抑菌、防病作用及其分类学地位进行研究，为柑橘

溃疡病的生物防治提供理论依据。

1.1 材料

1.1.1 供试植物福桔（8年生）、脐橙（6年生）和南丰蜜橘（3年生）于2011年4～5月份分别从福州闽侯南通镇、福清渔溪镇和东张镇柑橘园采集。

1.1.2 供试菌株柑橘溃疡病菌（K5）Xanthomonas axonopodis pv.citri（Xac.）由本实验室鉴定保存和枯草芽孢杆菌（BS168）Bacillus subtilis由美国芽孢杆菌

遗传保藏中心（Bacillus Genetic Stock Center，BGSC）惠赠。

1.1.3 供试试剂Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]、16S rDNA扩增的上游引物（27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCT CAG-3′）和下游引物（1492R：5′-TACGGYTACCTT GTTACGACTT-3′）[14]（上海生物

工程技术服务有限公司）、Taq DNA聚合、dNTPS、10×PCR Buffer [宝生物工

程（大连）有限公司]、琼脂糖、TBE[15]、Biospin胶回收试剂盒[宝生物工程

（大连）有限公司]、TaKaRa pMD 18-T Vector[宝生物工程（大连）有限公司]。

1.1.4 供试培养基[16]柑橘细菌的分离和培养采用NA、NB培养基。

1.2 方法

1.2.1 柑橘组织细菌的分离用清水将样品（叶片、春稍、花）冲洗干净，晾干；在无菌操作台用无菌水漂洗3次，晾干后转入灭菌过的研钵中，加适量无菌水研磨

成浆（无菌水量没过研磨浆为准），静置30min，取25、50、100μL在NA培

养基平板涂布。28℃恒温箱中培养48～72 h，根据菌落形态、颜色等分别挑取不同类型单菌落，纯化保存备用。

1.2.2 拮抗菌株的平板筛选以柑橘溃疡病菌为靶标菌，采用平板抑菌圈法筛选其中的拮抗菌株[17]。先把培养48h的柑橘溃疡病菌用无菌水配成悬浮液

（OD600=0.5），然后将100mL NA培养基融化并冷却至45℃左右加入病原菌

的悬浮液1mL，倒好平板，吹干后在每个平板上等距离点接5株待测细菌，28℃

恒温箱中培养，并于48、72 h观察抑菌情况，并测量其抑菌透明圈半径。

1.2.3 分离细菌离体叶片防效的测定参照李云锋等[18]方法采摘无虫无病的新抽出的功能叶（品种福桔），洗净，晾干，每张叶片背面用灭菌大头针预先针刺5个孔。本实验共设3个处理，（1）先用灭菌滤纸沾70μL的待测分离菌株培养液（28℃摇床培养2 d，浓度约为5×108cfu/L）贴于叶片针刺伤口上，将叶片置于无菌培养皿中，底部滤纸用无菌水润湿，然后将培养皿置于塑料盆中，套袋保湿，置28℃恒温箱中培养24 h后，将原先的滤纸取下，在叶片针刺伤口处贴上沾

70μL的柑桔溃疡病菌（OD600=1.0）的灭菌滤纸。（2）先用灭菌滤纸沾70μL 的清水，24 h后撕下并贴上沾有70μL的柑橘溃疡病原菌菌液（OD600=1.0）。（3）单接清水。每个处理重复3次，置于28℃恒温箱中培养并定期观察结果。统计公式：发病率/%=（发病针孔数／总针孔数）×100；防治效果/%=[(病菌处理区发病率－生防菌处理区发病率)／病菌处理区发病率]×100

1.2.4 拮抗菌防效的测定取1 mL拮抗菌菌株培养液（28℃摇床培养48 h，浓度约为5×108cfu/ L）12 000 r/min离心10min，分别收集其菌体和上清液（即代谢产物），上清液用细菌过滤器（滤膜孔径0.22μm）过滤1次，菌体用无菌水清洗1次，再用1mL无菌水配成菌体悬浮液，备用。接种方法、发病率和防治效果的统计方法同1.2.3。

1.2.5 拮抗菌胞外酶活性的测定β-1,4-内切葡聚糖酶活性参照范晓静等[19]方法测定；β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶活性参照张秀艳等[20]方法测定；蛋白酶活性参照何召明等[21]的方法进行测定。

1.2.6 拮抗菌株的鉴定（1）16S rDNA测序。拮抗菌株16S rDNA测序包括总DNA的提取、PCR扩增、连接转化等，参照分子克隆第三版[15]的方法进行。将回收的16S rDNA片段送到上海生物工程技术服务有限公司序列测定，对测序得到的基因序列利用GenBank中的BLAST软件进行同源性分析，利用MEGA3.1