四质粒包装讲解
病毒包装与感染ppt课件
病毒包装与感染
基因载体系统
病毒载体系统
非病毒载体系统
DNA/RNA DNADNADNADNA
逆腺腺单慢
转病相纯病
录 病 毒 载
毒 载 体
关 病 毒 载
疱 疹 病 毒
毒 载 体
体
体载
体
裸
阳蛋 阳
离白 离
子质 脂复 质合 复物
子 多 聚 物
嵌 合 物
合
物
细胞内包装
细胞外包装
2
病毒载体系统
基本概念：即病毒载体介导基因技术，一种高效的基因转移工
➢ 将其包膜蛋白env基因换成鼠4070A病毒的双嗜性包膜蛋白，就产生
了能分泌双嗜性病毒的包装细胞。但这个细胞系所含的包装结构仅仅 缺失Ψ信号，只要它们与载体之间发生一次重组，就可以产生有复制 能力的野生型病毒，安全性很差。
➢ 第二代包装细胞
➢ 前病毒基因组除了包装信号缺失外，5’LTR的5’端顺序也缺失，病毒 剪接供体上游部位进一步缺失，3’LTR被SV40的转录终止多聚腺苷酸 信号取代。经过这样的改造，包装细胞与载体系列之间的共同顺序只 存在于紧接gag起始密码子上游53bp的区域。
1、体外细胞基因转导2、 全基因组插入失活突变筛 选3、功能基因库构建
腺病毒载体
➢ 无包膜的线状双链DNA病毒，宿主范围很广，适用于在分 裂或非分裂哺乳动物细胞中进行高效瞬时表达。
➢ 除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞，腺病毒系统可以在 任何哺乳动物细胞中高效瞬时表达，是可靠的基因递送平 台。它在感染宿主细胞时，病毒基因组及其携带的外源基 因独立于宿主基因组外游离表达，因此是无插入突变性， 安全性高。
➢ 第三代慢病毒载体系统由四质粒代 替原有的三质粒包装系统。
慢病毒使用操作手册
慢病毒使用操作手册：1 慢病毒使用操作2 慢病毒安全使用规范3 悬浮细胞感染方法概要4 相关专业术语(详情可参考公司网站FAQ)5 细胞培养器皿的相关参数1、慢病毒使用操作手册1.1 慢病毒的储存与稀释:1.1.1 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）A．病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
1.1.2 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。
1.2 慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞1.2.1 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）1.2.2 慢病毒感染目的细胞预实验1.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项A．测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。
B．在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
C． Invabio提供的病毒单位为TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。
质粒载体介绍(质粒基本特性和种类及标记基因)
质粒载体介绍（质粒基本特性和种类及标记基因）2010-01-25 13:25:29 来源：易生物实验浏览次数：6084 网友评论 0 条一、质粒的基本特性二、标记基因三、质粒载体的种类关键词：质粒载体质粒载体标记基因一、质粒的基本特性1．质粒的复制通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。
在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和θ复制。
在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。
图3-1 是其复制其始示意图。
在复制时，首先合成前 RNAⅡ，即前引物，并与 DNA 形成杂交体；而后RNase H 切割前 RNAⅡ，使之成为成熟的 RNAⅡ，并形成三叶草二级结构，该引物引导质粒的复制。
形成的 RNAⅠ可控制 RNAⅡ形成二级结构，同时Rop 增强 RNAⅠ的作用，从而控制质粒的拷贝数。
削弱 RNAⅠ和 RNAⅡ之间相互作用的突变，将增加带有 pMB1 或（ColE1）复制子的拷贝数。
图 3-1 带 pMB1（或 ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录的方向及其粗略大小。
2．质粒的拷贝数质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。
严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。
表 5-1 就是不同类的质粒与复制子及拷贝数的大致关系。
表 3-1 ：质粒载体及其拷贝数质粒 复制子 拷贝数pBR322 及其衍生质粒 pMB1 15～20pUC 系列质粒及其衍生质突变的 pMB1 500～700粒pACYC 及其衍生质粒 p15A 10～212pSC101 及其衍生质粒 pSC101 ～5ColE1 ColE1 15～20pUC 系列质粒的复制单位来自质粒 pMB1 ，但其拷贝数较高。
pMB1 质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA 聚合酶Ⅰ，DNA 聚合酶Ⅲ），依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶，以及宿主基因dnaB 、 dnaC 、 dnaD 和danZ 的产物。
四种质粒的类型
以下是四种常见的质粒类型：
1. 自复制质粒（Self-Replicating Plasmids）：这是最常见的质粒类型，它们能够在细胞内自主复制。
自复制质粒通常包含有自主复制所需的起始点（origin of replication，ori），以及其他必要的元件，如选择标记和基因表达元件。
2. 表达质粒（Expression Plasmids）：这种质粒被设计用于在宿主细胞中表达特定基因。
除了自复制元件外，表达质粒还包括启动子、编码目标基因的DNA序列、终止子和调控元件等。
3. 克隆质粒（Cloning Plasmids）：克隆质粒主要用于DNA片段的克隆和扩增。
它们通常包含有选择标记、限制性内切酶切位点以及DNA 插入区域。
克隆质粒在基因工程和分子生物学中广泛应用。
4. RNAi质粒（RNAi Plasmids）：这种质粒用于RNA干扰（RNA interference）研究。
RNAi质粒包含产生小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）或小髮夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）的序列。
这些RNA分子可以靶向特定基因的mRNA，并抑制该基因的表达。
这些质粒类型在分子生物学和基因工程研究中扮演着重要的角色，用于基因克隆、基因表达和基因沉默等研究领域。
不同的质粒类型具有不同的功能和应用，根据研究目的选择适当的质粒类型非常重要。
病毒包装
基因编码p55的蛋白前体,经蛋白酶裂解而形成病毒的核衣壳蛋白(p7) 、内膜蛋白(p17) 和衣壳蛋白(p24) 。
pol 基因编码病毒复制所需的酶类,env编码gp120 和gp41 两种包膜糖蛋白,决定病毒感染宿主的靶向性。
tat 基因编码的gp14 是一种反式激活的转录因子,与LTR 结合后能促进病毒所有基因的转录。
rev 基因编码的产物gp19 能促进未经拼接的大mRNA 分子从细胞核向胞浆转运,并相对减少拼接后小mRNA 分子的数量。
nef基因编码负调节蛋白,对病毒的结构蛋白和调节蛋白的表达均有下调作用。
vif编码产物与病毒体的感染性有关,vpu产物与病毒的装配、成熟和释放有关,而vpr编码产物的功能尚不清楚。
1.3 HIV-1 生活史HIV-1 病毒通过gp120 与宿主细胞的CD4 分子和趋化因子受体结合,然后将病毒的基因(RNA) 、蛋白及酶等释放到宿主细胞内;随后,逆转录酶将病毒RNA 转录成DNA,病毒DNA 在整合酶的作用下插入宿主细胞核的基因组中,此时的病毒DNA 也称为原病毒;紧接着,原病毒转录成mRNA ,mRNA 从细胞核进入细胞质,并利用宿主细胞的原料合成病毒的各种成分(蛋白质) ,新合成的各种蛋白、酶及RNA 等聚集在宿主细胞的膜下,病毒的包膜蛋白(gp120 ,gp41) 插入宿主细胞的细胞膜并形成一种未成熟的病毒(此时病毒无传染性) ;最后蛋白酶将病毒核心中的许多过长的蛋白及酶切短,便形成成熟的病毒。
病毒利用宿主细胞的细胞膜将自己包被起来,离开该细胞去寻找新的宿主。
1.4 慢病毒载体转导非分裂期细胞的分子机制慢病毒载体能转导非分裂期细胞,3 种分子元件决定了这种能力:MAN、IN 和vpr。
这3 类蛋白利用细胞核的输入机制,靶向作用于细胞核的前整合复合物( PIC)。
细胞核的输入系统包括: 胞质蛋白、importin-a 、importin-b 及核孔蛋白。
实验四 质粒pUC19转化大肠杆菌E. coli DH5a
实验四质粒pUC19转化大肠杆菌E. coli DH5a 内容提要采用质粒pUC19对实验三制备得到的大肠杆菌E. coli DH5α感受态细胞进行转化，并利用抗生素来筛选转化子。
本实验要求：1、掌握质粒转化实验操作技术。
2、能够计算感受态细胞的转化效率。
原理本实验以E. coli DH5a菌株为受体细胞，采用CaCl2法制备感受态细胞，并将pUC19 质粒转化至感受态细胞。
进入受体细胞的质粒通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R¯，M¯)，它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
由于pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Amp r)，可通过Amp抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pUC19，则在含氨苄青霉素的培养基上不能生长。
能在氨苄青霉素培养基上生长的受体细胞（转化子）说明已导入了pUC19。
转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切、测序等进一步鉴定。
一、主要仪器、材料和试剂1. 仪器移液器，水浴锅，台式离心机，摇床。
2. 实验材料大肠杆菌E. coli DH5α感受态细胞，1ml枪头，10ml离心管。
3. 试剂（1）100mg/ml 氨苄青霉素（ampicillin）溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
（2）LB液体培养基：蛋白胨（Tryptone）10g酵母提取物（Yeast extract）5 gNaCl 10g溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水定容至1升，高温高压灭菌20分钟。
（3）LB固体培养基：液体培养基中每升加15g琼脂粉，高温高压灭菌。
二、操作步骤1) 在冰上缓慢融解感受态细菌(对于新鲜制备的感受态就可以直接使用了)，如果检测感受态细菌的效率，加入100pg～10ng质粒，但质粒的体积不宜超过感受态细菌量的10%。
λ噬菌体包装质粒原理
λ噬菌体包装质粒原理
噬菌体包装质粒是通过利用噬菌体感染细菌并将质粒DNA包装入噬菌体颗粒中来制备。
其原理包括以下几个步骤：
1. 噬菌体感染：选择一种合适的寄主细菌，使其被特定的噬菌体感染，噬菌体一般是属于细菌的病毒，在细菌被噬菌体感染后，噬菌体将控制细菌的合成机制并复制自身。
2. 质粒DNA插入：将感兴趣的质粒DNA插入到被感染的细菌中，这一步骤一般通过细菌转化技术实现，使质粒DNA进入细菌细胞质。
3. 质粒DNA复制和包装：被插入的质粒DNA在被感染的细菌中进行复制，同时噬菌体的复制机制也被激活。
在病毒复制的过程中，质粒DNA被包装入噬菌体颗粒中，形成带有质粒DNA的新的噬菌体。
4. 细菌溶解和收集：当感染的细菌数量达到一定程度时，噬菌体会释放，溶解宿主细菌。
此时，溶解的细菌中含有大量包装有质粒DNA的噬菌体颗粒，通过离心等方法，可以收集到纯净的噬菌体和质粒DNA。
通过以上步骤，可以利用噬菌体包装质粒原理，制备纯净的质粒DNA。
这种方法在基因工程实验中被广泛应用，包括基因克隆、重组蛋白表达、基因组库构建等。
遗传学 实验四 质粒DNA的提取与鉴定
实验四质粒DNA的提取与鉴定一、实验目的1、熟悉细菌的培养和质粒的扩增。
2、学习和掌握从大肠杆菌中提取质粒DNA的原理和方法以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。
二、实验原理质粒广泛存在与原核细胞中，大多是双联的共价闭合环状DNA分子，长度可以从1kb 到200kb不等，是染色体外寄生性的自主复制子，在细胞分裂时能恒定地传递给子代细胞。
在分子生物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA，通常使用松弛型（其复制受宿主的控制不严格，在宿主细胞中拷贝数较多）质粒。
从大肠杆菌中分离质粒的方法很多，常见的有煮沸法和碱变性抽提法。
碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复兴差异而达到分离的目的。
在pH高达12.5的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时，变形的质粒DNA又恢复到原来的构型，通过离心保留在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。
在抽屉过程中，由于各种因素的影响，同一质粒DNA可能呈现以下不同的构型：①超螺旋型，即共价闭合环状DNA（cccDNA）；②一条链发生一处或多处断裂，致使另一条链发生自由旋转，分子内的扭曲折叠消失，形成松弛的分子即开环DNA（ocDNA）；③两条链都发生了随机的断裂成为线状DNA。
在这三种构型中，cccDNA由于扭曲折叠，体积很小，在具有分子筛效应的琼脂糖凝胶电泳中受到阻力最小，迁移速度最快；ocDNA因扭曲状态被破坏而呈松弛的环状，迁移速度较慢；线状DNA受到的阻力最大，迁移速度最慢。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，除受分子构型的影响，还受所带净电荷多少的影响。
因此在鉴定质粒DNA纯度时，应尽量减少电荷效应。
增大凝胶浓度可以在一定程度上降低电荷效应，分子的迁移速度主要取决于受凝胶阻滞程度的差异，由此将不同构型的质粒DNA 分开。
慢病毒包装总结
慢病毒包装总结慢病毒的成分现在的慢病毒包装系统通常包括几个质粒，这几个质粒上分别含有慢病毒复制的成分，这样做的目的就是为了增加安全性，毕竟如果只用一个成分的话，危险系数很高，人一旦接触这种病毒就有可能遇到危险。
而把这几个成分分散在几个质粒中，很难在体外形成危险的病毒颗粒。
第二代慢病毒包装系统含有3个质粒，第3代慢病毒包装系统含有4个质粒。
这两代病毒包装系统都含有以下相同的成分：第一，编码目的蛋白或转录目的基因的转移质粒。
其实就是你自己的目的质粒，也就是通常需要自己做载体的质粒。
目的基因的两侧都含有长末端重复序列（LTR，long terminal repeat），LTR的作用就是辅助目的基因插入到宿主细胞的基因组。
许多慢病毒质粒都是基于HIV-1病毒改造的。
为了安全目的，这些目的质粒的复能能力并不完全，它们的3'LTR有所删减，这样病毒插入到基因组后会自我失活（self-inactivating）（SIN）。
第二，包装质粒，毒包装的结构蛋白编码质粒。
第三，包膜质粒，编码蛋白质外壳。
第二代慢病毒利用病毒的LTR启动子用于基因的表达，第三代慢病毒利用一个杂合的LTR启动子进行基因表达。
第二代慢病毒下图是第二代慢病毒系统：这个系统含有3个质粒，第1个质粒：包装质粒，它编码Gag，PoI，Rev与Tat基因。
第2个质粒：包膜质粒，含有VSV-G，编码蛋白Env。
第3个质粒：目的质粒，含有病毒的LTRs和psi包装信号（图片未画出），除非有内部启动子，否则这个目的质粒的目的基因是由5'LTR驱动的，它是一个弱启动子，需要Tat元件的来激活它。
所有的第2代慢病毒目的质粒必须要用第2代慢病毒包装系统，因此它的LTR是Tat依赖性的。
第三代慢病毒第3代慢病毒如下所示：设计第3代病毒的目的主要还是提高安全性。
在第3代病毒中，将第2代病毒的包装质粒分成了2个质粒，一个编码Rev，另外一个编码Gag和PoI。
慢病毒包装原理-介绍
慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（Lentivirus ）载体是以HIV-1 （人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA 半衰期短，体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的siRNA 表达载体中，是由RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA 合成的，这是因为RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA 不会带poly A 尾。
当RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续4 个或5 个T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物3' 端形成1~4 个U 。
U6 和H1 RNA 启动子是两种RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA 和～50ntRNA茎环结构（stem loop ）。
在siRNA 表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA 聚合酶Ⅲ启动子和4 ～5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA 。
病毒包装原理及步骤
病毒包装原理及步骤
采用第3代重组慢病毒包装系统制备病毒颗粒。
为了增加慢病毒的安全性能，病毒制备所必需的元件序列被拆分到4个质粒当中，分别是：
1）1个编码目的基因的慢病毒转移质粒。
目的基因两侧各有一个LTR（long terminal repeat）序列，LTR序列促使目的基因整合到目的细胞基因组里。
为了提高安全性能，转移质粒的3’ LTR缺失了部分序列，使得整合后的病毒基因组失去自我复制能力。
2）2个包装质粒。
其中一个质粒编码Rev, 另外一个质粒编码Gag 和Pol。
3）1个编码包膜蛋白的质粒。
利用上述质粒包装出来的重组慢病毒颗粒，被称为自我失活VSV-G假型慢病毒（self-inactivating VSV-G pseudotyped lentivirus）。
每次包装重组慢病毒，包装质粒和编码包膜蛋白的质粒都是固定不变的，变的是编码目的基因的转移质粒。
首先将转移质粒、包装质粒和包膜蛋白质粒转染到293T细胞。
更换新鲜的培养基后，继续培养48～72小时。
收集培养液，进行离心浓缩后，就可得到转导细胞级别的病毒颗粒。
如果您想获得注射动物级别的超纯病毒颗粒，可以利用蔗糖超速离心进一步去除杂质，从而获得纯度更高的病毒颗粒。
四种质粒的类型
四种质粒的类型一、载体质粒载体质粒是生物技术中常用的一种质粒类型。
它是用来承载外源DNA序列的一种质粒，通常是圆形的、双链的DNA分子。
载体质粒中经常包含可扩增的选择标记基因和多个限制酶切位点，使其易于进行基因工程操作。
载体质粒的种类繁多，常见的有pUC、pBR322、pGEM和pBluescript等。
在基因工程中，将外源DNA 序列插入载体质粒中，并将其导入宿主细胞，实现外源基因的表达和功能研究。
二、表达质粒表达质粒是一种用于表达外源基因的质粒。
它通常包含启动子、转录终止信号和编码蛋白质的序列，使其能够在宿主细胞中进行高效的基因表达。
表达质粒的选择标记通常是抗生素耐受基因，这使得在宿主细胞中筛选转化成功的细胞变得更加容易。
常见的表达质粒有pET、pGEX和pMAL等，它们被广泛用于蛋白质表达、纯化和功能研究中。
三、RNA干扰质粒RNA干扰质粒是一种用于RNA干扰实验的质粒。
RNA干扰是一种通过寡核苷酸序列介导的RNA降解过程，被广泛用于基因沉默和功能研究中。
RNA干扰质粒通常包含小干扰RNA（siRNA）或小核RNA（shRNA）序列，这些序列可以与靶基因mRNA特异性结合并引导RNA酶介导的降解作用。
RNA干扰质粒的选择标记通常是抗生素耐受基因，使得在稳定转染宿主细胞的过程中能够筛选出成功转染的细胞。
四、CRISPR-Cas9质粒CRISPR-Cas9质粒是一种用于基因编辑的质粒。
CRISPR-Cas9技术是一种通过靶向DNA序列的RNA介导的基因编辑技术，被广泛用于基因功能研究和生物医学领域。
CRISPR-Cas9质粒通常包含Cas9蛋白质编码序列和靶向DNA序列的RNA序列，这些序列可以指导Cas9蛋白质靶向到特定的基因区域，实现基因编辑和修饰。
CRISPR-Cas9质粒的选择标记通常是抗生素耐受基因，使得在宿主细胞中能够筛选出成功转染的细胞，从而实现基因编辑的目的。
双报告基因骨架载体、四质粒假病毒包装系统、包装新冠肺炎假病毒
专利名称：双报告基因骨架载体、四质粒假病毒包装系统、包装新冠肺炎假病毒
专利类型：发明专利
发明人：吴飞,秦晓峰,韦治明,杜晓红,杨仁祥
申请号：CN202010191574.7
申请日：20200318
公开号：CN111593073A
公开日：
20200828
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：双报告基因骨架载体，包括双报告基因骨架载体，其双报告基因选自荧光素酶和荧光蛋白，荧光蛋白报告基因优选mGFP基因，荧光素酶报告基因优选Fluc基因；双报告基因四质粒假病毒包装系统包括双报告基因骨架载体以及分别整合慢病毒gag‑pol基因、慢病毒rev基因以及含有目的病毒的包膜蛋白基因的3种真核表达包装质粒；包装新冠肺炎假病毒包括双报告基因四质粒假病毒包装系统、宿主细胞，所述宿主细胞优选自293T‑hACE2细胞。
本发明对SARS‑CoV‑2进行具体实施，可快速包装出单周期感染且安全性更高的假病毒，可用于SARS‑Cov2等冠状病毒的研究，为抗病毒制剂和疫苗的评价提供了有力的筛选工具,具备广泛的应用价值。
申请人：苏州奥特铭医药科技有限公司
地址：215000 江苏省苏州市苏州工业园区仁爱路150号第二教学楼
国籍：CN
代理机构：宿迁市永泰睿博知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：刘慧
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CAR-T系列之慢病毒包装质粒生产纯化及质量控制
CAR-T系列之慢病毒包装质粒生产纯化及质量控制1 概述嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（Chimeric AntigenReceptor T-Cell Immunotherapy，简称CAR-T），是一种新型精准靶向，有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法，近几年在临床肿瘤治疗上取得很好的治疗效果。
它是通过基因工程技术，把T细胞“组装”上能定位导航的肿瘤嵌合抗原受体（CAR），能专门识别体内肿瘤细胞，并通过免疫作用释放大量的效应因子，能高效地杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。
▲图1. CAR-T细胞结构及作用原理2017年8月FDA批准了全球首个CAR-T细胞治疗产品上市（商品名：Kymriah），用于治疗复发或难治性B细胞急性淋巴细胞白血病及弥漫性大B细胞淋巴瘤患者。
同年10月FDA批准了第二款CAR-T产品上市（商品名：Yescarta），主要用于治疗复发或难治性B细胞急性淋巴细胞白血病的治疗。
这两款CAR-T的上市极大地鼓舞了细胞免疫治疗研发热情，CAR-T疗法在某些血液肿瘤中具有显著的疗效，并预示着肿瘤治疗模式的变革。
全球首个接受CAR-T治疗的白血病女孩Emily，在5岁时被诊断患有急性淋巴细胞白血病（ALL），6岁Emily两次白血病复发而生命垂危，2012年她参加了CAR-T临床试验，现在她癌细胞完全消失，过着健康的生活。
1.1 CAR分子结构及发展史CAR分子是一种由抗体衍生的片段组成的可识别结合肿瘤并促进T细胞扩增的共刺激分子偶联肿瘤嵌合抗原受体，它包含一个胞外配体结合区（scFV）、一个跨膜区和一个胞内信号区。
胞外配体结合区能特异性靶向肿瘤表面的特定抗原，胞内的信号区有驱动CAR-T细胞效应子的功能，共刺激信号结构域可以使T细胞持久活化。
▲图3. CAR结构及发展史第一代青铜段位：针对的是肿瘤的CD19或CD20抗原，信号转导区由胞内的CD3ζ链组成。
第一代CAR-T细胞在体内生存能力不强，也不能产生足够的IL-2，仅具有限的抗肿瘤作用。
pdm4质粒序列
pdm4质粒序列
pDM4质粒序列是一个大肠杆菌表达载体，Tac强启动子可以驱动GST促溶标签和目的基因融合表达，LacI阻碍蛋白和Laco操作子使本质粒在没有加入IPTG之前禁止表达，防止其影响细菌生长。
表达后的融合蛋白可用凝血酶蛋白酶切割，再过一次GST柱子即可清除掉GST标签。
pDM4质粒序列收到货后请根据标签上文字判断产品属性（质粒/甘油菌）
1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl无菌水溶解质粒，室温放置1min；
2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态，置于冰盒上解冻，并做好标记；
3、取2μl质粒加至100μl感受态中，冰浴30min；
4、42℃热激90s，再冰浴2min；
5、加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；
6、6000rpm离心5min，仅留100ul上清混匀菌体沉淀；
7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上，倒入适量玻璃珠，涂匀液体；
8、将平板正向培养1h，再倒置培养12h~16h；
9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中，震荡培养12h~16h，根据实验需要提取质粒。
三质粒包装系统原理
三质粒包装系统原理一、概述三质粒包装系统是一种常用于基因工程研究中的技术，它可以将外源DNA转化为质粒，并通过细胞内的生物合成机制进行表达。
该系统由三个部分组成：辅助质粒、感染性噬菌体和目标质粒。
本文将介绍三质粒包装系统的原理及其应用。
二、辅助质粒辅助质粒是三质粒包装系统中的一部分，它通常是一个小型环状DNA 分子，大小约为4.9kb。
辅助质粒中含有多个噬菌体所需的基因，这些基因可以促进噬菌体在宿主细胞内的复制和转录。
此外，辅助质粒还可以提供必要的蛋白质，如结构蛋白和酶等。
在三质粒包装系统中，辅助质粒通常与感染性噬菌体一起转化到宿主细胞中。
当感染性噬菌体侵入宿主细胞时，噬菌体会利用辅助质粒提供的基因和蛋白质来进行复制和转录。
这些基因和蛋白质的存在可以增加噬菌体在宿主细胞内的存活率，并促进目标质粒的包装和释放。
三、感染性噬菌体感染性噬菌体是三质粒包装系统中的另一部分，它是一种寄生于细菌上的病毒。
感染性噬菌体通常由一个线性DNA分子组成，大小约为50kb。
该DNA分子被包裹在一个蛋白质外壳中，称为噬菌体头部。
在三质粒包装系统中，感染性噬菌体被用作载体来将目标质粒包装和释放到宿主细胞内。
当感染性噬菌体侵入宿主细胞时，其头部会与目标质粒结合，并将其DNA转化为自身DNA分子的一部分。
此后，感染性噬菌体会利用辅助质粒提供的基因和蛋白质来进行复制和转录。
最终，感染性噬菌体会将新合成的目标质粒封装在自身头部中，并释放到宿主细胞外。
四、目标质粒目标质粒是三质粒包装系统中的最后一部分，它是一个环状DNA分子，大小可以从几kb到数百kb不等。
目标质粒通常含有外源DNA序列，这些序列可以用于表达所需的蛋白质或RNA。
在三质粒包装系统中，目标质粒被用作外源DNA序列的载体。
当感染性噬菌体侵入宿主细胞时，其头部会与目标质粒结合，并将其DNA转化为自身DNA分子的一部分。
此后，感染性噬菌体会利用辅助质粒提供的基因和蛋白质来进行复制和转录。
第四章(质粒载体)ppt课件
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6.质粒的复制类型
• 两种不同的复制型：
• “严紧型” (stringentplasmid)；
• “松驰型” (relaxedplasmid)。
• 质粒拷贝数的定义：
•
每个细菌细胞中所含有的质粒DNA
•
分子的数目
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7．质粒的不亲和性
(1) 质粒的不亲和性现象 (2) 质粒不亲和性的分子基础
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第四节重要的质粒载体
• 一.大肠杆菌质粒载体
•ห้องสมุดไป่ตู้
1．pSCl01质粒载体
•
•
2．Co1E1质粒载体
•
3．pBR322质粒载体
•
4．pUC质粒载体
•
5．丧失迁移功能的质粒载体
6.能在体外转录克隆基因的质粒载体
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一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体的形体图
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大肠杆菌F因子基因图
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20
(3)质粒DNA的接合转移机制
•
①细胞交配对的形成： 大肠杆菌F质粒编
码的特异性性须，在受体细胞的识别以及在确立
配对细胞之间的表面接触中起着重要的作用。它 至少需要25种以上的转移基因编码产物的参与。
•
②质粒DNA的转移F质粒DNA的转移是从转
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pBR322质粒载体的构建过程
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pBR322质粒载体的形体图
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pBR322质粒载体的结构来源
质粒
但在某些情况下，尤其是在 recA+ 的宿主细胞中， ColE1 常能彼此重组而形成多聚体(multimer)，从而使单个细胞 内质粒的拷贝数减少，并增加产生无质粒细胞的可能性。 而ColEl质粒含有不依赖于recA的cer基因，负责多聚体的 解聚作用，使之重新转变为单体质粒以保证质粒在细胞 分裂时的稳定性。
sopB sopC
SopB SopA
质粒
细菌质粒DNA的分配模型图
复制
分配复合体 复制体 质粒分配
细胞分裂
寄主致死体系 F 质粒的寄主致死体系主要由其基因组中控制寄主致死 功 能 的 基 因 ccdA 和 ccdB 负 责 。 在 含 质 粒 的 细 胞 中 ， CcdA 蛋白作为解毒剂专门与毒剂 CcdB 蛋白结合，并使 之失效。
质粒可根据其拷贝数分为严谨型质粒（Stringent plasmid）和 松弛型质粒（Relaxed plasmid）。 质粒在细胞内复制时受到控制而与染色体复制同步进行，被称 为严紧型质粒。其拷贝数也低，通常只有1-3个拷贝。如F质粒。
另一类质粒的复制与染色体复制不同步，称为松驰型质粒。通 常每个细胞含有10-100个拷贝，属于高拷贝质粒。如分子量小 的ColEl质粒。
八、以λ噬菌体DNA为基础的载体及其应用
九、广寄主范围质粒载体 通过双亲杂交和三亲杂交方法进行转移。 EcoR1
Tet Tet
pLAFR1 21.6kb
(pRK290+COS) oriT
COS
Cosmi.coli
根瘤菌7653R-1（Nod-） 根瘤菌7653R-1（pLAFR1基因） 紫云英植株幼苗R100
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四质粒包装讲解
质粒是一种广泛存在于细菌、酵母菌等生物中的小型环状 DNA 分子，常被用于基因工程等领域。
四质粒包装是一种将四个不同质粒组装在一起的技术，从而实现对基因的复杂调控。
本文将介绍四质粒包装的原理、构建方法和应用。
下面是本店铺为大家精心编写的3篇《四质粒包装讲解》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
《四质粒包装讲解》篇1
一、四质粒包装的原理
四质粒包装是一种基于质粒的基因工程技术，它可以将四个不同的质粒组装在一起，形成一个复杂的调控系统。
四质粒包装的原理基于细菌的遗传学特性，即细菌可以同时携带多个质粒，并且这些质粒可以相互作用，共同调控基因的表达。
在四质粒包装中，每个质粒都包含一个启动子和一个报告基因。
启动子可以驱动报告基因的表达，而报告基因则可以用于检测质粒是否被转染到细胞中。
通过将四个质粒组装在一起，可以实现对基因的复杂调控，例如对基因的表达量、时空调控等。
二、四质粒包装的构建方法
四质粒包装的构建方法主要包括以下步骤:
1. 构建四个不同的质粒，每个质粒包含一个启动子和一个报告基因。
2. 通过基因克隆技术将这四个质粒组装在一起，形成一个四质粒系统。
3. 将四质粒系统转化到细胞中，使其能够在细胞内协同作用。
其中，构建四个不同的质粒是四质粒包装的关键步骤。
这需要选择合适的启动子和报告基因，并将其克隆到质粒中。
一般来说，选择不同的启动子和报告基因可以实现对基因的不同方面的调控，例如表达量、时空调控等。
三、四质粒包装的应用
四质粒包装技术可以广泛应用于基因工程、代谢工程、合成生物学等领域。
例如，在基因工程中，四质粒包装可以用于构建复杂的基因调控网络，从而实现对基因的精确调控。
在代谢工程中，四质粒包装可以用于构建不同的代谢途径，从而实现对特定代谢产物的合成。
在合成生物学中，四质粒包装可以用于构建不同的生物电路，从而实现对生物系统的精确调控。
四质粒包装是一种基于质粒的基因工程技术，可以实现对基因的复杂调控。
通过构建四个不同的质粒，并将它们组装在一起，可以形成一个复杂的调控系统，从而实现对基因的精确调控。
《四质粒包装讲解》篇2
四质粒包装是一种基因工程技术，用于将多个质粒同时转化到细胞中。
这种技术通常用于构建基因组规模的基因转移，以实现特定功
能。
以下是四质粒包装的详细讲解：
1. 构建四质粒表达载体：首先需要构建四个表达载体，每个载
体包含一个质粒和一个特定的基因。
这些质粒通常是在细菌中复制的，并包含一个选择标记，以便在转化后筛选转化细胞。
2. 制备转化混合物：将四个表达载体混合在一起，并制备成转
化混合物。
该混合物包含每个质粒的 DNA，以及一个选择标记，以便在转化后筛选转化细胞。
3. 转化细胞：将转化混合物接触到细胞中，并通过转化过程将
质粒 DNA 引入到细胞中。
通常使用化学法或电穿孔法将质粒 DNA 导入细胞。
4. 筛选转化细胞：使用选择标记筛选转化细胞。
只有那些包含
所有四个质粒的细胞才能在含有选择标记的培养基中生长。
这些细胞被称为四质粒转化细胞。
5. 表达和功能分析：通过检测四个质粒的表达产物，评估四质
粒包装的效果。
可以使用 Western blot、qRT-PCR 等技术进行表达
分析，也可以进行功能实验，如荧光素酶活性检测等。
四质粒包装技术是一种强大的基因工程技术，可以实现多个质粒的同时转化。
该技术可用于构建基因组规模的基因转移，以实现特定功能。
在实际应用中，需要根据具体需求选择合适的质粒和基因，并进行相应的构建和筛选。
《四质粒包装讲解》篇3
四质粒包装是一种基因工程技术，用于将多个质粒同时转化到细胞中。
这种技术通常用于制备基因组文库、构建基因组合并表达蛋白质等。
以下是四质粒包装的详细讲解：
1. 构建四质粒表达载体：首先需要构建四个表达载体，每个载体包含一个质粒和一个目的基因。
这四个质粒需要具有相同的启动子和转录因子，以便在转化后能够同步表达。
2. 转化细胞：将四个质粒同时转化到细胞中需要使用一种特殊的转化技术，例如电穿孔或化学法。
通常使用大肠杆菌或其他常见宿主细胞进行转化。
3. 筛选阳性克隆：通过抗生素抗性筛选或其他标记基因筛选，筛选出成功转化的四质粒克隆。
4. 表达和纯化蛋白质：使用诱导剂或化学物质诱导四个质粒的表达，然后通过离心或过滤等方法纯化蛋白质。
四质粒包装技术的优点是可以在同一时间内表达多个基因，提高基因组文库的构建效率和蛋白质表达的稳定性。
此外，该技术还可以用于制备复杂的基因组合，以实现特定的生物学功能。