转染效率评价标准 - 360文档中心

转染

Stealth™RNAi or siRNA TransfectionStealth™RNAi or siRNA TransfectionStealth™RNAi or siRNA TransfectionStealth™RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。

注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。

2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。

B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。

C 将A B两管混合，放置20min。

3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。

将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

Plasmid DNA TransfectionPlasmid DNA TransfectionPlasmid DNA TransfectionPlasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。

1 中板。

贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。

2 转染。

A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。

B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem 无血清培养基中，混匀室温放置5min。

C 将A B两管混合，放置20min。

转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。

化学合成siRNA转染人羊膜的WISH细胞的效率检测

中国组织工程研究与临床康复第12卷第16期 2008–04–15出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research April 15, 2008 Vol.12, No.16 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH3115 1College of Animal Medicine, Northwest Agricultural & Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China; 2Institute of Obstetrics & Gynecology, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510150, Guangdong Province, ChinaHao Rong-zeng★, Studying for master's degree, College of Animal Medicine, Northwest Agricultural & Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China; Institute of Obstetrics & Gynecology, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China rongzenghao@ Correspondence to: Ma Bao-hua, Associate professor, College of Animal Medicine, Northwest Agricultural & Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi Province, ChinaSupported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30471828*; the Scientific Research Priming Foundation for Returned Persons of Ministry of Education, No. Jiaowaisiliu[2005] 383*Received:2008-01-02 Accepted:2008-02-13化学合成siRNA转染人羊膜的WISH细胞的效率检测**★郝荣增1,2，刘慧姝2，马保华1Chemosynthesis siRNA transfection efficiency in human amnionic WISH cellsHao Rong-zeng1,2, Liu Hui-shu2, Ma Bao-hua1AbstractAIM: Researching the pertinent literature in China Journal Full-text Database (CJFD) published between 2005 and 2008 indicatedthat the inhibitory effect of small interference RNA (siRNA) was determined by the transfection efficiency in RNA interference. Atpresent, there are few reports about detection of the transfection efficiency for human WISH cells with chemosynthesis siRNA. Inthis study， we use the flow cytometer detected the transfection efficiency and the effect on apoptosis of WISH cells after chemosynthesis siRNA transfected human WISH cells.METHODS: The experiment was performed at the Experimental Medical Research Center of Guangzhou Medical College fromMarch to December 2007. ①WISH cells were bought from Shanghai Life Science Academy of Chinese Academy Of Sciences. ②WISH cell line was transfected with CY3-Negative siRNA (0, 5, 10, 20, 30 nmol/L). Twenty-four hours later, transfectionefficiencies of different protocols were evaluated by fluorescent microscopy and flow cytometer. Apoptosis of WISH cells wasdetected with Annexin V-EGFP kit after 24-hours 20 nmol/L CY3-Negative-siRNA transfection.RESULTS: Red fluorescence was discovered under the fluorescence microscope with 5, 10, 20, 30 nmol/L CY3-Negative siRNAtransfected WISH cells, and no signals were discovered in control group. The transfection efficiency of 20, 30 nmol/L CY3-NegativesiRNA was remarkably higher than 5, 10 nmol/L CY3-Negative siRNA transfection groups (P < 0.05). There was no significant differencein transfection efficiency between 20 nmol/L and 30 nmol/L siRNA groups (P > 0.05). The apoptosis of WISH cells was detected after24-hours transfection with 20 nmol/L Negative siRNA. The apoptotic rates were 1.96% and 2.36% in the transfection and control groups,respectively. There was no significant difference in apoptosis of WISH cells between transfection group and control group.CONCLUSION：①The chemosynthesis siRNA can transfect human amnion-derive WISH cells successfully, and there is no effecton the apoptosis of WISH cells after transfection. ②Better transfection efficiency can be obtained in 20 nmol/L siRNA transfectedhuman WISH cells.Hao RZ, Liu HS, Ma BH.Chemosynthesis siRNA transfection efficiency in human amnionic WISH cells. Zhongguo ZuzhiGongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3115-3118(China)[/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3115(ps).pdf]摘要目的：检索中国期刊全文数据库2005/2008相关文献显示，RNA干扰研究中，转染效率的高低直接决定siRNA 的表达效果，目前关于应用小分子干扰RNA对人羊膜WISH细胞转染效率的检测研究少见。

细胞转染成功与否的八大要素

细胞转染成功与否的八大要素摘要: 转染是否成功的影响因素很多，如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此)，需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质)，转染试剂等。

但无论在何种情况下，转染的成功均取决于知己知彼，方能百战不殆。

做细胞转染也一样道理。

细胞转染实验的影响因素很多，如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此)，需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质)，转染试剂等。

但无论在何种情况下，以下八个要素都不容忽视。

要素一：细胞分裂细胞相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。

因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。

同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于过度生长的状态;此外，还常用促有丝分裂刺激物(如，病毒转化，生长因子，条件培养基，以及滋养细胞)来活化原代培养细胞。

贴壁细胞相比较悬浮细胞——在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。

相对于贴壁细胞(如HEK，CHO)，悬浮细胞(如HL 60，Jurkat)非常难以转染，可能是因为细胞间膜结构的差异，但目前还没有分子水平上合理机制的解释。

分板方案——在对培养细胞进行分板传代培养之前，必须把贴壁细胞用胰蛋白酶消化使之脱离培养基质。

这个常规操作可导致正常细胞功能受到严重损害。

因此分批方案的不同(如，胰蛋白酶消化时间的长短，胰蛋白酶的灭活等)需要优化。

传代次数——传代次数是指对一个细胞系进行分批传代的频度(通常在一个实验室范围内)。

某些细胞系相比较其他细胞系而言较不稳定，可能会随着培养时间的延长而改变，视不同的细胞系和培养条件而定。

因此名称相同的同一细胞系在生理学和形态学(以及转染能力)性质也可能会有很大的差异。

一般而言，细胞在冻存复苏后的一两代之内或直到它们完全复苏之前都很难转染。

细胞数量(融合率)——只要培养基质(组织培养皿)尚有空间，细胞就会按指数规律分裂。

对于正常细胞而言，细胞生长的速度受细胞密度大小的抑制(接触抑制)，但癌细胞则不受此限制而会继续生长并可互相叠加。

细胞转染效率低的原因及解决方案

细胞转染效率低的原因及解决方案
细胞转染是细胞生物学和分子生物学的一种常用的技术手段。

而转染效率低下却是实验人员经常遇到的问题，尤其是原代细胞转染，转染难度更大。

现分享几个细胞转染实验常见的几个陷阱，望实验人员能够注意。

1.准备不足
做细胞转染的时候，在开展正式实验前要多做预试验，优化转染条件。

优化转染条件包括：转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。

2.细胞污染
细胞污染也是造成细胞死亡，转染效率低下的一大原因。

首先，转染细胞用的质粒必须保证无菌。

而现在市场上的一般的质粒提取试剂盒都做不到绝对无菌。

分享一个小秘诀：将提完质粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，这样就除菌了。

3.质粒质量问题
转染用的质粒首先要保证数量，一般为2μg以上。

质粒纯度不够或者含有细菌LPS或其他对细胞有毒害作用的物质，也会影响转染效率。

这个时候，就应该对质粒进行纯化和浓缩。

4.细胞状态不好
细胞状态不好，会导致转染效率低下。

一般进行转染的细胞应该处于对数生长期。

如果是贴壁细胞的话，贴壁率应该在70-80%；如
果是悬浮细胞的话，应该是6×105个/孔（24孔板），一般是转染前一天换液，转染前用无血清培养基或PBS洗细胞一次。

5.转染试剂问题
脂质体试剂毒性较大，易造成细胞死亡和转染效率底下。

可选择非脂质体转染试剂，如Entranster试剂。

转染效率的测定方法

转染效率的测定方法
一、实时定量PCR检测
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。

通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

Real-time PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。

由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

但是，荧光定量PCR所检测的是转染后细胞中待测基因的mRNA的表达水平，对于目的基因的蛋白表达水平不能够检测；
二、Wester Blot检测
Western Blot又称蛋白质免疫印迹（免疫印迹实验），其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或者生物组织样品进行着色，并通过分析着色的位置和着色的深度获得特定蛋白在所分析的细胞或者组织中表达情况的信息。

Western Blot所检测的是组织或者细胞中蛋白质的表达水平。

三、流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在功能水平上对细胞或者其他生物粒子进行定量检测和分析的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中检测得到多个参数，与传统检测方法相比具有更加快速、准确以及定量等特点。

使用流式细胞术检测转染效率可以更加精que的确定转染的效率，对转染效率进行量化。

四、荧光显微镜观察
当我们转染的质粒DNA含有荧光蛋白基因是，可以通过荧光显微镜观察的方法来确定转染的效率，在荧光显微镜下，可以观察到荧光的强弱以及荧光的效率。

细胞转染成功与否的八大要素

细胞转染成功与否的八大要素摘要: 转染是否成功的影响因素很多，如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此)，需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质)，转染试剂等。

但无论在何种情况下，转染的成功均取决于知己知彼，方能百战不殆。

做细胞转染也一样道理。

细胞转染实验的影响因素很多，如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此)，需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质)，转染试剂等。

但无论在何种情况下，以下八个要素都不容忽视。

要素一：细胞分裂细胞相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。

因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。

同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于过度生长的状态;此外，还常用促有丝分裂刺激物(如，病毒转化，生长因子，条件培养基，以及滋养细胞)来活化原代培养细胞。

贴壁细胞相比较悬浮细胞——在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。

相对于贴壁细胞(如HEK，CHO)，悬浮细胞(如HL 60，Jurkat)非常难以转染，可能是因为细胞间膜结构的差异，但目前还没有分子水平上合理机制的解释。

分板方案——在对培养细胞进行分板传代培养之前，必须把贴壁细胞用胰蛋白酶消化使之脱离培养基质。

这个常规操作可导致正常细胞功能受到严重损害。

因此分批方案的不同(如，胰蛋白酶消化时间的长短，胰蛋白酶的灭活等)需要优化。

传代次数——传代次数是指对一个细胞系进行分批传代的频度(通常在一个实验室范围内)。

某些细胞系相比较其他细胞系而言较不稳定，可能会随着培养时间的延长而改变，视不同的细胞系和培养条件而定。

因此名称相同的同一细胞系在生理学和形态学(以及转染能力)性质也可能会有很大的差异。

一般而言，细胞在冻存复苏后的一两代之内或直到它们完全复苏之前都很难转染。

细胞数量(融合率)——只要培养基质(组织培养皿)尚有空间，细胞就会按指数规律分裂。

对于正常细胞而言，细胞生长的速度受细胞密度大小的抑制(接触抑制)，但癌细胞则不受此限制而会继续生长并可互相叠加。

转染资料整理终结版

转染转染——让克隆的核酸进入真核细胞中，已经成为研究和控制真核细胞基因表达的重要手段。

比如表达纯化特定的蛋白；鉴定一个基因的生物学特性；突变分析；研究基因表达对细胞生长的影响，研究基因表达的调控机制等等，等等。

如今广义的转染不单包括了DNA、RNA，还有蛋白质等生物大分子。

生物通在前面已经为大家集中介绍了8个不同的品牌的转染试剂——不是选美，没有包医百病的万灵丹，只是希望有助于你了解每种产品的特性。

这里我们最后“唐僧”一下，转染中一些值得注意的事项。

很多因素会影响转染效率，细胞株本身啦，细胞培养环境啦，转染的DNA、RNA 或者蛋白的质量和特性啦，转染方法啦，等等。

每个转染高手也必然有自己的独门心经，只可惜大家都为实验或者生活而疲于奔命，没有几个人愿意静下心情来仔细总结经验汇集成文字——那些曾经用无数失败的痛苦烦恼换回来的宝贵经验，那些曾经以为会永远铭刻于脑海的教训，随时间的流逝而终于渐渐褪色，到模糊。

即使偶尔有珠玉掩埋于浩瀚的口水中，也难以汇串成珠。

试剂盒的盛行，让实验更快，更简单，也更机械化，相信更多人更愿意先抓起Protocol 123地往下做，直到碰壁再苦思原因。

其实等碰得遍体鳞伤回头一看就会醒悟，很多坑，只要事前注意了就不会陷进去的。

幸好还有一些资料可寻，生物通姑且在这里抛砖引玉，罗列一些吧。

这一part很闷的。

DNA转染后，转入基因的表达可以在1－4天内检测到——仅有一部分转入细胞的DNA被转运到细胞核内进行转录并最终输出mRNA到细胞质进行蛋白合成。

几天内，大部分外源DNA会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了。

因此转染也可以分为瞬时转染和稳定转染。

瞬时转染（transient transfection）指的是转染的核酸不整合到染色体上，结果是短暂的高水平表达，可在24—96小时内检测表达效果，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件的影响。

瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定表达少，但因为DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，不长久也不稳定。

1. 吉玛293T转染oligo效率评价步骤

实验材料与方法一、细胞培养人胚肾293T 细胞，常规培养使用含10% FBS (Gibco)的DMEM 培养基(Gibco)(含1.5 mM L-Glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml Streptomycin)中，37ºC 5% CO 2饱和湿度培养箱中培养。

二、细胞转染实验材料及试剂D-Hank’s SolutionTrypsin-EDTA Solution (0.05% Trypsin - EDTA, Gibco)Lipofectamin2000转染试剂（Invitrogen ）siRNA-mate （genepharma ）Opti-MEM I Reduced serum medium(Gibco)96孔板（Corning ）步骤1. 293T 细胞在6cm dish 中培养至80-90%融合时，倾去培养液，用3ml D-Hank’s solution 洗涤细胞两次。

2. 加1ml Trypsin-EDTA solution, 混匀后，小心吸去胰酶溶液，37ºC 放置3-5分钟。

3. 在加入2 ml 含10%FBS 的DMEM 培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。

4. 血球计数板计数，将细胞稀释至3×105细胞/ml 。

5. 按3×104细胞/孔的浓度接种96孔板。

6. 转染试剂Lipofectamin2000，用于转染NC-FAM ，剂量如下，每个剂量设三复孔。

Lipofectamin2000 siRNA-mate 转染试剂用量(μl)0.1250.25 0.5 0.25 0.5 1 Oligo 用量（pmol ）10 10 10 10 10 10 吉玛基因7. 每1 OD 260 oligo 用125 μl DEPC-H 2O 溶解，终浓度约为20 μM 。

8. 在1.5 ml EP 管中加入75 μl （25μl/well*3well ）Opti-MEM I ，再加入根据上述表格算出的不同剂量的NC-FAM ，混匀；取另一1.5mlEP 管，加入75 μl （25μl/well*3well ）Opti-MEM I ，加入根据上述表格算出的相应剂量的Lipofectamin2000或siRNA-mate ，混匀，室温放置5分钟后将两组管混合，室温放置20分钟。

简析细胞转染

细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。

在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。

转染方式有瞬时转染：外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。

）和稳定转染： (外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。

)主要方法如下：
影响转染效率的因素有很多，具体如下：
1.转染试剂
要选择高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。

2.细胞状态
一般低的细胞代数（<50）能确保基因型不变。

最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞。

3.细胞密度
细胞密度对转染效率有一定的影响。

不同的转染试剂，要求转染时的最适细胞密度各不相同。

4.血清
血清的存在会影响DNA-转染复合物的形成，但只要在复合物形成时用无血清培养基或PBS来稀释DNA和转染试剂就可以了。

5.DNA质量
DNA质量对转染效率影响非常大。

一般的转染技术基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会影响转染复合物的形成及转染的进行。

细胞转染效率计算

细胞转染效率计算
细胞转染是将外源性DNA或RNA导入细胞内的技术，常用于基因功能研究以及疫苗、基因治疗等领域。

细胞转染效率是衡量转染成功的指标之一，通常是指成功转染的细胞数量与总细胞数的比例。

计算细胞转染效率的方法有很多种，其中常用的是荧光素酶报告系统。

该系统利用转染的DNA含有荧光素酶基因，当该基因在细胞内得到表达时，荧光素酶将催化荧光素底物发光，从而可定量测定转染效率。

具体计算方法如下：
1. 在转染前确定细胞密度，如1×10^6个细胞/ml。

2. 将转染质粒加入转染试剂中，并按照厂家说明进行转染。

3. 转染24至48小时后，用荧光素酶检测试剂盒检测转染效率。

该试剂盒可根据厂家说明选择细胞裂解液的用量和荧光素底物的浓度。

4. 将检测出的荧光素发光值与质控样品的发光值比较，可得到相应的转染效率。

例如，检测到转染后浓度为1000个荧光素发光单位(FLU)/分的细胞总数为8000个，细胞密度为1×10^6个细胞/ml，转染效率即为1000×8000/1×10^6=8000 FLU/μl。

细胞转染效率的计算对于转染实验的质量控制具有重要意义。

该方法可为研究人员提供高效、准确的转染效率评估手段，为细胞生物学、分子生物学等领域的研究提供有力的支持。

师姐整理之细胞转染技巧

师姐整理之细胞转染技巧1、细胞转染有脂质体转染，病毒转染、电转染、磷酸钙法、显微注射….下面主要讲最常用的脂质体lip2000介导的细胞转染。

2、转染效率影响因素：1、细胞种类，细胞状态，2、质粒大小，3、转染试剂。

3、转染前细胞的状态和密度都非常影响转染效率和后期的实验结果。

转染时细胞的密度为50%-80%较好，同时注意在转染后收细胞时的密度不要过爆。

比如转染质粒到细胞内，48小时后做WB，那么此时细胞的密度最好不要长满. 因为细胞长的过爆严重影响细胞的状态（周期进程阻滞，凋亡增加等）从而影响实验结果。

一般为前一天下午铺板，第二天上午进行转染，48小时候收细胞进行功能检测。

4、不同的质粒和脂质体最佳搭配比例不同，转染前，应该摸一个最佳配比。

质粒：脂质体=1：1， 1：1.5， 1：2， 1：2.5， 1：3，1：3.5的梯度比例来检测最佳转染比例（一般质粒有带荧光，可以通过观察每组荧光强弱来判断转染效率，没有荧光的只能通过qPCR来检测各组转染效率）。

5、质粒的纯度影响转染效率：1、脂质体转染基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。

2、含有内毒素的质粒对细胞有很大的毒性作用。

建议使用QIAGEN公司的超纯质粒抽提试剂盒。

6、转染时，小心轻柔的将lip2000加到培养基中并轻轻混匀（说明书上的用词为：Mix gently），避免粗暴用力吹打，会导致脂质体失效。

7、转染时各种培养皿添加的质粒和脂质体参考量见下表：8、虽然现在的大多数转染试剂可以使用带血清的培养基进行转染，但转染时建议用无血无抗生素的opti-MEM培养基提高转染效率。

转染后6小时更换培养基，一是lip2000具有一定毒性，二是培养基需要更换成有血清培养基。

9、支原体污染会严重影响细胞转染的效率，且支原体污染不会像细菌污染那么明显可见，转染前可以用环丙沙星杀一杀支原体。

细胞转染注意事项

细胞转染注意事项
1.如为贴壁生长细胞，一般要求在转染前一日，必须应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，转染当日的细胞密度以70-90%（贴壁细胞）或2×106-4×106细胞/ml（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4h换一次新鲜培养液。

2.用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。

3.培养基中的血清
在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。

其实，只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。

4.培养基中的抗生素
抗生素是影响转染的培养基添加物。

这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。

这降低了细胞的活性，导致转染效率降低。

这时候可以选择英格恩生物的Entranster转染试剂，非脂质体试剂，培养基可加抗生素，避免了细胞染菌。

5.设置阳性对照和阴性对照。

6.一般在转染24-48h，靶基因即在细胞内表达。

根据不同的实验目的，24-48h后即可进行靶基因表达的检测实验。

7.如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基
因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素和新霉素等。

car-t细胞转导效率标准

car-t细胞转导效率标准
CAR-T细胞转导效率标准是指将CAR（嵌合抗原受体）基因导入人体外周血中T细胞后，评估CAR-T细胞的转导效率，其中转导效率是指导入CAR基因的T细胞百分比。

CAR-T细胞转导效率的标准通常根据研究目的和实验条件不同而有所不同。

在临床试验中，常用的标准是在T细胞培养10天后测定CAR-T细胞的转导效率，一般要求达到50%以上。

在实验室中，转导效率标准根据具体实验目的而有所不同，一般要求高于20%。

在评估CAR-T细胞转导效率时，还需要考虑其他的因素，如CAR-T细胞的活性、生存时间、扩增能力等。

因此，转导效率的标准仅仅是衡量CAR-T细胞制备过程中一个重要的参数，不能完全代表CAR-T细胞的质量和效能。

细胞转染的影响因素有哪些？

细胞转染的影响因素有哪些？
转染过程中许多因素会影响转染效率：如细胞种类、细胞密度；质粒大小、质粒纯度；血清；抗生素；转染试剂等。

转染实验中，以下几个因素需多加注意。

1. 转染前的细胞状态和密度转染时细胞密度以70~90%（贴壁细胞）或2×106~4×106细胞 / mL（悬浮细胞）为宜，细胞密度过高会严重影响细胞状态（周期进程阻滞，凋亡增加等）。

转染效率随着细胞传代次数不同会发生很大变化，因为传代次数少的细胞转染率非常低，而对传代次数较多的细胞而言，其转染最佳剂量差别较大。

同时支原体污染会严重降低细胞的转染效率，因此转染前可用环丙沙星处理细胞以除去支原体。

2. 转染时的质粒纯度假使质粒不纯，如带少量盐离子，蛋白、代谢物污染等都会显著影响转染复合物的有效形成；而含有内毒素的质粒对细胞存在很大的毒性作用。

抗生素一般对真核细胞无毒，但转染过程中细胞通透性增加，使抗生素进入细胞，从而降低细胞活性，导致转染效率低下。

3. 转染后的筛选时间转染后筛选不能太早或太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷大，增殖较慢，太晚会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆。

一般要在转染 48 h 之后开始加抗生素筛选。

转染流程示意图
4. DNA 与转染试剂的比例许多转染方法需要优化 DNA 与转染试剂的比例。

不同细胞系转染效率通常不同，细胞系的选择通常根据实验需要确定。

在转染前应根据实验要求和细胞特性选择合适的转染试
剂，不同转染试剂转染效率差别很大，好的转染试剂能让您事半功倍。

基因治疗的基因传递策略与转染效率评估

基因治疗的基因传递策略与转染效率评估基因治疗是一种利用基因工程技术来修复、替代或增强异常基因或缺失基因的方法，旨在治疗各种遗传性疾病以及某些获得性疾病。

基因传递策略是基因治疗的关键步骤之一，它涉及将治疗性基因导入到人体细胞中，确保基因能够有效地表达，并达到所期望的治疗效果。

而转染效率评估是衡量基因治疗方法有效性的重要指标之一。

在基因传递策略中，常见的方法包括病毒介导基因传递和非病毒介导基因传递。

病毒介导基因传递通常利用逆转录病毒、腺相关病毒、腺病毒等病毒载体将治疗性基因导入到目标细胞中。

这些病毒载体具有高度的转染效率和目标细胞的选择性，但其存在潜在的安全隐患，如免疫反应、插入性突变等。

与之相比，非病毒介导基因传递则通过物理或化学手段，如电穿孔、超声波、脂质体介导等，将治疗性基因直接导入到细胞内。

尽管非病毒介导基因传递的转染效率相对病毒介导基因传递较低，但其更为安全，并且可以避免病毒载体可能引起的免疫反应和插入性突变等问题。

为了评估基因传递策略的转染效率，常使用荧光染料、报告基因和定量PCR等技术。

其中，荧光染料可通过显微镜观察细胞内荧光信号的强度和趋势，来初步判断基因传递的效果。

报告基因则是将感兴趣的基因与荧光素酶、绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白等标记在一起，通过观察细胞内的报告基因表达情况来评估转染效率。

此外，定量PCR则能够从分子水平对转染效率进行精确测量，它依赖于设计合适的引物和探针，以PCR扩增和检测目标基因的拷贝数。

除了基因传递策略和转染效率评估，还有其他影响基因治疗效果的因素需要考虑。

首先是目标细胞的选择性。

不同的基因治疗方法适用于不同类型的细胞，因此在选择基因传递策略时需要考虑到目标细胞的特异性。

其次是治疗性基因的选择。

治疗性基因应能够解决或缓解特定疾病的根源，确保基因治疗的有效性和安全性。

此外，还需要考虑基因的可溶性、稳定性和表达效率等因素，以确保基因能够在细胞内正确折叠、稳定存在并有效表达。

关于细胞转染实验，这些你应该知道

关于细胞转染实验，这些你应该知道细胞转染目前已经成为研究和控制真核细胞基因表达的重要手段。

本文整理了一些关于转染实验前的准备工作及一些实验过程中的小贴士，希望这些信息能够帮助各位科研君们做好转染实验及提高实验效率。

① 从健康细胞开始Ⅰ 转染实验前，细胞解冻后传代3–4次。

这使得细胞从解冻过程中恢复过来，并恢复正常的生长速度。

Ⅱ 仅使用活性 >90%的细胞——使用台盼蓝染色可轻松测定细胞活性。

Ⅲ 定期传代细胞，切勿让细胞长到汇合状态或过度生长。

如果让细胞长到汇合状态，可能会改变细胞的生长速度以及形态。

a. 请在汇合率达到90%之前对细胞进行传代。

我们建议您使用胰酶替代物Cellstripper™试剂(Corning 25-056-CI)使细胞脱壁。

Cellstripper™试剂可于室温下存储在通风橱中。

可通过添加过量的Cellstripper™来跳过PBS洗涤的步骤，然后吸弃全部液体，仅留可覆盖瓶子表面的液体。

* 非酶类细胞分离溶液，其配方是螯合剂的专利配方，可温和分离组织培养物的贴壁细胞。

性质比胰酶更温和。

b. 传代条件取决于所用的细胞系。

部分经验法则：对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时(如HEK-293)，按1：10的比例分瓶。

对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时(如原代细胞)，按1：5的比例分瓶。

Ⅳ 保留冻存的细胞系，并定期解冻新细胞。

传代次数高(>30–40)时，细胞的生长速度和形态会改变。

② 进行实验之前，请先规划您的实验。

务必要熟悉实验方案、确定所需的材料量，并在开始实验前确认所需的一切物品条件均已齐备。

Ⅰ 开始前，设计好铺板路线图，标注好每次处理或实验条件。

Ⅱ 计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认有足够的下列材料：TransfectGRO减血清培养基(Corning 40-300-CVR)，Lipofectamine® 2000 或Lipofectamine® LTX试剂，以及DNA(0.5–1 µg/µL)。

细胞转染成功与否的八大要素

细胞转染成功与否的八大要素第一篇：细胞转染成功与否的八大要素细胞转染成功与否的八大要素摘要: 转染是否成功的影响因素很多，如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此)，需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质)，转染试剂等。

但无论在何种情况下，转染的成功均取决于知己知彼，方能百战不殆。

做细胞转染也一样道理。

细胞转染实验的影响因素很多，如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此)，需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质)，转染试剂等。

但无论在何种情况下，以下八个要素都不容忽视。

要素一：细胞分裂细胞相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。

因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。

同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于过度生长的状态;此外，还常用促有丝分裂刺激物(如，病毒转化，生长因子，条件培养基，以及滋养细胞)来活化原代培养细胞。

贴壁细胞相比较悬浮细胞——在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。

相对于贴壁细胞(如HEK，CHO)，悬浮细胞(如HL 60，Jurkat)非常难以转染，可能是因为细胞间膜结构的差异，但目前还没有分子水平上合理机制的解释。

分板方案——在对培养细胞进行分板传代培养之前，必须把贴壁细胞用胰蛋白酶消化使之脱离培养基质。

这个常规操作可导致正常细胞功能受到严重损害。

因此分批方案的不同(如，胰蛋白酶消化时间的长短，胰蛋白酶的灭活等)需要优化。

传代次数——传代次数是指对一个细胞系进行分批传代的频度(通常在一个实验室范围内)。

某些细胞系相比较其他细胞系而言较不稳定，可能会随着培养时间的延长而改变，视不同的细胞系和培养条件而定。

因此名称相同的同一细胞系在生理学和形态学(以及转染能力)性质也可能会有很大的差异。

一般而言，细胞在冻存复苏后的一两代之内或直到它们完全复苏之前都很难转染。

细胞数量(融合率)——只要培养基质(组织培养皿)尚有空间，细胞就会按指数规律分裂。

转染效率

转染效率低的常见原因及其解决方案收藏HepG2用lipo2000在我们实验室做的转染效率很高的，可以到70－80％，不必担心。

不需要用电转，磷酸钙法也可以有40－50％的操作上主要注意：1，细胞铺板时的状态很重要，应该在铺板前尽量消化为单细胞悬液，trypsin＋EDTA充分吹打即可2，转染前1天铺板，待转染时密度刚好达到80－90％，不能太低，但是也不能长过（细胞成团，堆积）。

最好是刚刚长满，此时还在对数生长期3，加入的质粒要去除内毒素，plasmid:lipo约为1:0.5-1:5。

实际上采用说明书的推荐量就很好，1：2.54，用前自己好好看一遍说明书，哈哈HepG2细胞的确相对于CHO等细胞而言转染效率比较低，但也只是相对。

据我们实验室的经验，用lipofectamine 2000转染HepG2完全没有问题，无论是瞬时转染还是稳定转染，也无论是转一个质粒还是共转染两个质粒（转两个以上没有试过）。

但有些问题需要注意一下：1、lipofectamine 2000毒性比较大，所以建议转染6 h后换去转染培养基；2、采用先铺板再转染的方式比采用同时转染的方式效率会高，但需根据实验需要设计，如果采用前种方式，细胞的汇合度一定要在80%以上再转染（说明书上好像是达到90%）；3、采用0.25%的trypsin+0.02%EDTA消化细胞传代，弯头吸管稍加吹打，可使细胞分散的很均匀，消化的时间一定要掌握好，时间不够不易吹下且对细胞造成机械损伤，消化过了成片脱落，再想吹打成单细胞悬液就不容易了；4、根据脂质体介导细胞转染的原理，在质粒提取时要除去内毒素，否则会降低转染效率；5、对于转染时DNA和脂质体的量说明书上有个推荐的范围，DNA (μg):Lipofectamine™ 2000 (μl) =1:0.5 ~ 1:5，可在此范围内设几个梯度摸索一下，从而找到最适比例；6、转染时用于稀释脂质体和DNA的培养基一定是无血清的，血清会干扰转染，还有脂质体稀释液和DNA稀释液要充分混匀并孵育足够时间，以使脂质体将DNA颗粒包裹好进入细胞质粒浓度多少?一般不低于1微克/微升,这是效率底的常见原因质粒是4ug ,lifpo2000 10ul是一个孔的?加入转染试剂细胞是否有损失你的详细步骤是否可以写一下我有点不懂你的细胞饥饿和转染时间是什么意思，但是我可以说说我做转染的过程，我用的是HELA和sf9,转染试剂是lipofectamin2000是invitrogen公司的，转染前一天铺板，细胞密度要高使得转染当天密度达到80－90％，质粒是1ug/孔（6孔板），转染试剂是3ul/孔，不加血清培养基分别稀释之后混合约30min,之后直接将质粒和转染试剂混合液加入含血清培养基的细胞中48h 后观察荧光，转染效率还是很高的。

原代细胞转染条件

原代细胞转染条件
原代细胞转染是一种将外源DNA或RNA转移到原代细胞内的技术，可以用来研究细胞功能、基因表达和信号传导等方面。

然而，原代细胞转染技术因为细胞的易损性和复杂性而非常具有挑战性。

以下是一些常见的原代细胞转染条件和技巧：
1. 转染试剂的选择：选择适当的转染试剂是成功的关键。

有许
多转染试剂可供选择，如脂质体、聚合物、病毒和电穿孔等。

各种试剂的效果因细胞类型而异，因此需要根据实验目的和细胞类型进行选择。

2. 细胞密度：细胞密度也是影响转染效率的因素之一。

通常，
细胞密度应该适中，太多或太少都会影响转染效率。

一般来说，最佳细胞密度是在80-90％的细胞对数生长期。

3. 转染时间：转染时间也是影响转染效率的重要因素。

转染时
间过长或过短都会导致低转染效率。

通常，最佳转染时间取决于转染试剂的类型和细胞类型。

4. 转染浓度：转染浓度也是影响转染效率的因素之一。

通常，
过高或过低的转染浓度都会影响转染效率。

一般来说，最佳转染浓度应该是根据细胞类型和转染试剂的类型进行优化。

5. 转染前的细胞处理：在转染之前，需要对细胞进行处理，以
提高转染效率。

例如，可以预处理细胞，将其暴露于低渗透压的缓冲液中，以增加细胞膜通透性。

总的来说，原代细胞转染技术需要根据不同的细胞类型和实验目
的进行优化。

正确选择转染试剂、控制细胞密度和转染时间、调节转染浓度和进行细胞前处理等技巧都可以提高转染效率并确保实验成功。