植物生理生化测定

2.1.8转基因植株在盐胁迫下的超氧化物歧化酶(SOD)活性测定
将转基因植株与非转基因对照植株继代于含有0.5% NaCl的MS固体培养上进行胁迫培养，培养条件为27±1℃，每天13 h、3000 lux光照。

胁迫培养4 w后，取其叶片测定其SOD 活性，每个样品设3次重复，求其平均数，并进行多重比较。

2.1.8.1主要试剂及配方
（1）0.1 mol/l pH 7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液
A液（0.1 mol/l Na2HPO4溶液）：称取Na2HPO4·12H2O 7.163 g，用少量蒸馏水溶解后定容至200 ml，4℃冰箱中保存备用；
B液（0.1 mol/l NaH2PO4溶液）：称取NaH2PO4·2H2O 0.780 g，用少量蒸馏水溶解后定容至50 ml，4℃冰箱中保存备用；
取上述A液183 ml与B液17ml充分混匀后即为0.1 mol/l pH 7.8的磷酸钠缓冲液，4℃冰箱中保存备用。

（2）0.026 mol/l甲硫氨酸（Met）磷酸钠缓冲液
称取甲硫氨酸（C5H11NO2S）0.388 g，用少量0.1 mol/l pH 7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，再用相同磷酸钠缓冲液定容至100 ml，现用现配，4℃冰箱中保存可用1～2 d。

（3）7.5 × 10-4 mol/l NBT溶液
称取NBT（C40H30Cl2N10O6）0.153 g，用少量蒸馏水溶解后，定容至250 ml，现用现配，4℃冰箱中保存可用2～3 d。

（4）含1.0 μmol/l EDTA的20 μmol/l核黄素溶液
A液：称取EDTA 0.003 g，用少量蒸馏水溶解；
B液：称取核黄素0.075 g，用少量蒸馏水溶解；
C液：合并A液和B液，定容至100 ml，此溶液即为含0.1 mmol/l EDTA的2 mmol/l 核黄素溶液，避光保存（可用黑纸将装有该液的棕色瓶包好），4℃冰箱中可保存8～10 d，当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0 μmol/l EDTA的20 μmol/l核黄素溶液。

（5）含2% PVP的0.05 mol/l pH7.8磷酸钠缓冲液
取0.1 mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液50 ml，加入2 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮），充分溶解后移入100 ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀，4℃冰箱中保存备用。

2.1.8.2提取及测定方法
（1）称取1.0 g样品叶片于预冷的研钵中，加入4 ml预冷的提取介质（含2% PVP的0.05 mol/l pH7.8磷酸钠缓冲液），冰浴研磨匀浆，转入10 ml离心管，并用提取介质定容至
5 ml；
（2）4℃10000 rpm离心10 min，取上清即为酶液提取样品；
（3）取透明度好的10 ml离心管，每个株系3次重复，按照下表加入试剂：
试剂用量（ml）
0.05 mol/l磷酸缓冲液（2% PVP）0.875
0.026 mol/l Met缓冲液 1.5
750 μmol/l NBT 0.3
1 μmol/l EDTA及20 μmol/l核黄素0.3
酶提取液（对照管以磷酸缓冲液代替）0.025
总体积 3.0
（4）设3个对照（CK1、CK2、CK3），将CK1包上铝箔避光，与其它样品管（包括CK2和CK3）同时置于4500 lux日光灯下反应25 min，反应温度28℃；
（5）SOD活性测定与计算：至反应结束，立即用黑布遮蔽以终止反应。

以遮光的对照管CK1作为空白调零，在560nm波长下测定各管的吸光度，CK2和CK3的平均值作为对照，按下例公式计算SOD活性（SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位）：SOD活性（U/g）=（OD0 -OD560）×V T／（OD0×0.5×FW×V1）
OD 0——光照对照管的光吸收值；
OD 560——样品管的光吸收值；
V T——样液总体积（ml）；
V1——测定时样品用量（ml）；
FW——样品鲜重（g）。

2.1.9转基因植株在盐胁迫下的丙二醛(MDA)含量测定
将转基因植株与对照植株继代于含有0.5%NaCl的MS固体培养上进行胁迫培养，培养条件为27±1℃，每天13 h、3000 lux光照。

胁迫培养4 w后，取整株测定其丙二醛含量，每个样品设3次重复，求其平均数，并进行多重比较。

2.1.9.1主要试剂及配方
（1）5%三氯乙酸（TCA）：称取5 g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，再定容至100ml；
（2）0.5%硫代巴比妥酸（TBA）：称取0.5 g硫代巴比妥酸，用5%TCA定容至100 ml。

2.1.9.2提取及测定方法
（1）称取1.0 g材料，加入10 ml 5%三氯乙酸（TCA）和少量石英砂，研磨至匀浆；
（2）3000 rpm离心10 min，取上清即为丙二醛提取液；
（3）取1.5 ml上述提取液（对照管取1.5 ml 5% TCA），加入2.5 ml 0.5% TBA，混匀后于沸水浴中反应15 min，迅速冷却；
（4）1800 g离心10 min；
（5）取上清液测定532和600 nm波长处的吸光度，以蒸馏水调零；
（6）含量计算：
丙二醛含量（nmol/g）=（OD532-OD600）×A×V /（0.155×FW×a）
OD532——样品管在532 nm处的光吸收值；
OD600——样品管在600 nm处的光吸收值；
A——反应液总体积（ml）；
V——提取液总体积（ml）；
FW——样品鲜重（g）；
a——测定用液总体积（ml）。

2.1.10转基因植株在盐胁迫下的脯氨酸含量测定
将转基因植株与对照植株继代于含有0.5%NaCl的MS固体培养上进行胁迫培养，培养条件为27±1℃，每天13 h、3000 lux光照。

胁迫培养4 w后，取其叶片测定其脯氨酸含量，每个样品设3次重复，求其平均数，并进行多重比较。

2.1.10.1主要试剂及配方
（1）6 mol/l 磷酸：量取102.5 ml 85%的磷酸，定容至250 ml；
（2）2.5% 酸性茚三酮：称取2.5 g茚三酮，加入60 ml冰醋酸和40 ml 6 mol/l磷酸，于70℃下加热溶解，冷却后贮存于棕色瓶中尽快使用，4℃可保存3 d。

2.1.10.2提取及测定方法
实验分为脯氨酸标准曲线的制作和植物样品的提取及测定两个部分，具体步骤如下：脯氨酸标准曲线的制作：
（1）称取10 mg脯氨酸溶于少量无水乙醇中，用蒸馏水定容至100 ml，配成100 μg/ml 的母液；
（2）取上述母液0，1.25，2.5，5.0，7.5，10，12.5，15 ml分别放入8个25 ml的容量瓶中，再分别加入蒸馏水定容至25 ml，配制成0，2.5，5.0，10，15，20，25，30 μg/ml 系列浓度的溶液；
（3）分别取上述溶液2 ml，加入2 ml冰醋酸，2 ml酸性茚三酮（注意不要接触皮肤），
摇匀，沸水浴显色15 min，冷却后于520 nm处测OD值；
（4）以OD值为横坐标，脯氨酸含量为纵坐标，绘制标准曲线。

植物样品中脯氨酸的提取及测定：
（1）称取胁迫处理过的植株叶片1.0 g，剪碎，加入5 ml 80% 乙醇于研钵中研磨成匀浆；
（2）将匀浆液体全部转移至25 ml刻度的试管中，加水补足25 ml，混匀，80℃水浴提取20 min；
（3）加入0.5 g人造沸石，0.2 g活性炭，于振荡器上振荡1 min混匀，过滤；
（4）取2.5 ml滤液，按制作标准曲线的方法测定各个样品的OD值；
（5）从制作得到的标准曲线上检出被测样品中脯氨酸的含量，最后换算得到游离脯
氨酸的平均含量：
脯氨酸含量（μg/g）=（C×V/a）/FW
C——曲线查C值（μg）；
V——提取液总体积（ml）；
a——测定液体积（ml）；
FW——样品质量（g）。

2.1.11转基因植株在盐胁迫下的叶绿素含量测定
将转基因植株与对照植株继代于含有0.5%NaCl的MS固体培养上进行胁迫培养，培养条件为27±1℃，每天13 h、3000 lux光照。

胁迫培养4 w后，取其叶片测定其叶绿素含量，每个样品设3次重复，求其平均数，并进行多重比较。

2.1.11.1主要试剂及配方
80% 丙酮：量取80ml丙酮，定容至100 ml。

2.1.11.2提取及测定方法
（1）称取胁迫处理过的植株叶片0.2 g，剪碎至研钵中，加入 5 ml 80% 的丙酮，研成匀浆；
(2) 用一层加丙酮润过的滤纸过滤，再用少量丙酮将滤纸和研钵上的色素冲洗干净，定容至10 ml，摇匀；
(3) 吸取2 ml 含有叶绿素的丙酮提取液，加80% 的丙酮2 ml 稀释后，倒入比色杯中，用分光光度计分别在645 nm、663 nm、652 nm下测吸光度，以80% 丙酮为空白对照。

用下列公式计算：
Ca(mg/l)=12.7OD663－2.69 OD 645
Cb(mg/l)=22.9 OD 645－4.68 OD 663
Ct1(mg/l)= 8.02 OD 663＋20.21 OD 645
用下式计算叶绿素在叶片中的含量：
Ct（叶绿素mg/g 鲜重）= Ct1×提取液总量×稀释倍数×10-3/样品（g）。