牦牛乳碱性磷酸酯酶的分离、纯化与部分性质测定

牦牛乳碱性磷酸酯酶的分离、纯化与部分性质测定*张良1，徐志浩1，毛海岩2，吴达2，种惠君2，邵宝平1，王建林11．兰州大学生命科学学院，兰州(730000)2．甘肃出入境检疫检验局，兰州(730000）E-mail：jlwang@摘要：从青海牦牛牛乳中提取和纯化碱性磷酸酯酶（ALP），并对其性质进行测定。

纯奶经正丁醇处理得粗酶液；粗酶液依次经盐析、Sephadex G-25层析柱、DEAE-Cellulose 52离子交换层析柱和Sephadex G-200层析柱纯化制得样品。

以对硝基酚磷酸酯(p-NPP)为底物测定该酶的性质，其最适温度为41.5℃，最适pH值为10.0，以双倒数法作图，测得该酶米氏反应常数K m=7.39mmol/L。

关键词：碱性磷酸酯酶、牦牛、分离和纯化中图分类号：Q9551．引言碱性磷酸酯酶（Alkaline phosphatase, ALP）是乳中普遍存在的一种酶，是乳细胞代谢的产物，缔合在乳脂球膜上，该酶热稳定性高，在巴氏杀菌条件下，62.8℃，30min或71.7℃，5s，可完全灭活，届时乳中其他无芽孢致病微生物也全部杀死[1]。

因此，其活性的测定被普遍用来作为检测巴氏杀菌效果是否完全和是否再被微生物污染常见方法[2, 3]。

据Hammer和Olson报道，经完全巴氏杀菌后的牛奶，如果检测出ALP活性，这是微生物产生热稳定性ALP的干扰[4]；Knight和Fryer，对此做了进一步研究，发现在实验室条件下重新进行完全巴氏杀菌后的所有样品均能检测出ALP活性[5]。

常规检测ALP活性的方法，大多采用磷酸苯酯为底物，以生成的苯酚作为测定的依据。

但是以测定苯酚浓度为依据，存在着诸多干扰，如人为添加杀虫剂，如残杀威和西维因[6]，或者抗生素，如青霉素和土霉素[7]，可引起假阳性干扰。

如添加磷胺[6]和链霉素红霉素[7]，可引起假阴性干扰。

牦牛是我国西部特有种，其乳制品干酪素是甘肃省以及西北地区重要、特色的出口贸易产品。

根据我国国家标准（GB 5424-85，GB 10797-89），对干酪素的产品要求未提及碱性磷酸酯酶活性。

欧盟是干酪素主要出口地区之一，欧盟委员会2003年发布了EC1774/2002 号非食用动物产品法规，在证书方面却要求阐明磷酸酯酶为阴性[8]。

目前国际上对乳制品中ALP活性的测定标准和方法很少见报道，据加拿大官方检测方法，仍采用分光光度法测定，存在着诸多干扰[9]。

目前，对牦牛乳中ALP的研究，未见报道。

对牦牛乳源干酪素中ALP 活性检测也未有相关标准。

因此，亟待制定我国自己的与国际标准相符合的检测标准。

本研究就我国青海牦牛牛乳中的碱性磷酸酯酶进行了分离和纯化，并对其性质进行了测定。

2．实验原料与方法2.1 原料与试剂新鲜的青海牦牛牛乳，葡聚糖G-25凝胶，葡聚糖G-200凝胶，DEAE-Cellulose 52离子交换树脂。

2.2 实验方法*本课题得到国家质检总局科技计划项目（2006IK025）的资助。

2.2.1 粗酶液的制备将新鲜牦牛乳冷却至4℃，取1L预冷的牛乳，不断搅拌条件下，缓慢加入预冷的等体积正丁醇，搅拌均匀，2,500g 4℃下离心30min，取下层水相，为粗酶液。

2.2.2 硫酸铵分级沉淀取800ml粗酶液，冰浴下逐渐加入研碎的冷硫酸铵，不断搅拌，防止局部浓度过大，使其饱和度达到30%，0℃放置30min。

4,000g离心5min，取上清，继续加入研碎的冷硫酸铵，使其最终饱和度达到60%，0℃放置30min，0℃下4,000g离心5min，弃上清。

用0.2M pH 7.0的PBS溶解沉淀。

2.2.3 葡聚糖G-25凝胶过滤脱盐将溶解后酶样品用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度[10]，蛋白浓度<70mg/ml情况下，过Sephadex G-25层析柱进行脱盐，用0.2M pH 7.0的PBS平衡和洗脱。

2.2.4 DEAE-Cellulose 52离子交换层析将G-25凝胶过滤后酶样品，4℃下用0.005M pH 6.0的PBS透析24小时后，过DEAE-Cellulose 52离子交换层析柱，分别用含0、0.05、0.15、0.25、0.35、0.45、0.55、0.65、0.75、0.85、0.95M NaCl的0.005M pH 6.0的PBS洗脱。

合并0.15M NaCl洗脱液，此处为洗脱峰。

2.2.5 酶液的浓缩将收集液测量体积，缓慢搅拌下加入10倍体积的0℃冷丙酮，低温放置4h。

7,000g离心30min。

沉淀用0.01M pH7.2的PBS溶解，测定蛋白浓度，控制其浓度50mg/ml左右，已备下步使用。

2.2.6 葡聚糖G-200凝胶过滤将酶样品过Sephadex G-200层析柱过滤，用0.01M pH7.2的PBS缓冲液洗脱。

2.2.7 磷酸酯酶活性测定蛋白含量测定用考马斯亮蓝法[10]。

活性的测定用对硝基酚磷酸酯法[11]（p-NPP）：以4mmol/L对硝基酚磷酸酯为底物，1min催化生成1nmol硝基酚的酶量为一个酶活力单位(1u=1nmol/min)。

3．实验结果与分析3.1 分离纯化效果在乳中，ALP是缔合在乳脂球膜上的，制备粗酶液时，必须将其从膜上释放出来。

据报道，含50%体积分数正丁醇的乳液，其膜上ALP释放比率最高,游离的酶活性最大[12]。

因此，制备粗酶液时，采用等体积的冷正丁醇进行处理。

表1 牦牛乳中碱性磷酸酯酶纯化效果Tab.1 Purification of alkaline phosphatase in yak milk纯化过程酶液总体积(ml) 总蛋白(mg)总活性(u) 比活(u/mg)收率(100%) 纯化倍数 粗酶液800 18613.36 2671 0.1435 100 1 葡聚糖G-25脱盐86 2525.46 1026 0.4060 48.4 2.83 DEAE-Cellulose 离子交换层析 19 542.73 370.7 0.6831 13.9 4.76粗酶液经硫酸铵分级沉淀，葡聚糖G-25脱盐和DEAE-Cellulose 52离子交换层析步骤后，其纯化倍数为4.76倍，收率13.9%（表1）。

3.1.1 硫酸铵分级沉淀效果各取粗酶液10ml ，0℃分别加入硫酸铵达到硫酸铵饱和浓度10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，0℃下放置30min ，4,000g 离心测上清酶活度，以原活度为100%，为了去除杂蛋白并提高收率，根据图1的结果，取硫酸铵30%相对饱和浓度时的上清。

然后再继续添加硫酸铵，至饱和浓度达60%，取此时沉淀，溶解后进行脱盐。

3.1.2 DEAE-Cellulose 52离子交换层析洗脱效果分别用含0、0.05、0.15、0.25、0.35、0.45、0.55、0.65、0.75、0.85、0.95M NaCl 的0.005M pH 6.0的PBS 洗脱，合并各浓度洗脱液，测酶活性，得0.15M NaCl 处的洗脱液相对活性最高（图2）。

3.1.3 葡聚糖G-200凝胶过滤经葡聚糖G-200凝胶过滤后，收集洗脱液分析酶活力仅有一个峰值，收集该峰值处洗脱液，经浓缩后，其浓度为91μg/ml3.2 碱性磷酸酯酶性质分析3.2.1 酶最适反应pH 值图3所示为pH 值对酶活性的影响。

在pH 值3-12之间，取pH=3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、图1 硫酸铵盐效果 Fig.1 Effect on salted out of ammonium sulfate 图 2 DEAE-Cellulose 离子交换层析分离效果 Fig.2 Isolation of phosphatase on DEAE-cellulose ion exchange column8.0、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、12.0，在37.5℃条件下测定酶活力。

从图上可以看出，在pH 3-6之间，碱性磷酸酯酶几乎没有活性。

当反应缓冲液pH 大于6后，酶活性逐渐升高，当pH=10.0时，酶活性最高。

当缓冲溶液pH 值大于10.0时，其活性又逐渐降低，且在pH 10-12间活性变化剧烈。

3.2.2 酶最适反应温度在pH=10.0，温度T=15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、40.5℃、41℃、41.5℃、42℃、42.5℃、43℃、44℃、45℃条件下，测定酶活力，得温度T=41.5℃时，酶活力最大，以此点酶活力为100%相对活性（图4），从图中可知，该酶的在温度为41.5℃，有最大酶活性。

但是，由图4可以看出，在温度40-45℃内，酶活性变化较剧烈，与经典酶活力-温度动力学曲线有差异，这与温度稍高，酶液预热时间（5min ）长，蛋白质发生变性有关，也说明该酶的热稳定性不是很高。

所以，后续测该酶活性时，均选择以温度37.5℃为反映条件，与41.5℃条件下相比，此时仍有约82%的相对活性。

3.2.3 酶的米氏反应常数Ｋｍ值在pH=10.0 温度37.5℃下，以不同浓度底物浓度测定酶活力，用Lineweaver-Burk 法作图计算出牦牛乳中碱性磷酸酯酶的K m =7.39mmol/L 。

与长毛对虾磷酸酯酶[13]的K m =0.08mmol/L ，南方磷酸酯酶[14]的K m =1.72mmol ，小鼠肝脏碱性磷酸酯酶[15]K m =1.0mmol/L 相比，本实验所纯化牦牛乳中ALP 稍高，说明其对底物p-NPP 的亲和力稍低。

图3 pH 值对酶活性的影响 Fig.3 Effect of pH on the ALP activity 图4 温度对酶活性的影响 Fig.4 Effect of temperature on the ALP activity4．结论据普遍报道，该酶活性受阳离子的影响，Mg 2+具有较大的激活作用[11,15]。

然而，Mg 2+却对巴氏杀菌样品中的ALP 检测具有很大影响，可引起部分失活的ALP 复性，得到假阳性结果[9]。

因此，该实验中未涉及该酶的离子干扰实验综上所述，目前对牦牛乳中碱性酯酶的研究未见报道，而据了解我国西北重要的出口产品-干酪素，由于缺乏与国际相接轨的检测标准，在出口过程中，质量检测成为难题。

因此，对该酶分离纯化成为首要问题。

以可见分光光度法、荧光分光光度法[1]、电化学法[16]，测定酶活性，直接使得测样品中酶与底物反应，存在着复杂的阳性与阴性干扰，不能区分本身碱性磷酸酯酶与微生物产生的碱性磷酸酯酶，因此，灵敏度与准确度受到限制。

以免疫学方法检测，制备该酶的多克隆抗体或单克隆抗体，可以排除众多干扰。

而多克隆抗体存在着不同程度的交叉反应[17]，单克隆抗体具有很高特异性，因此，制备该酶得单克隆经行免疫学方法检测，可以得到很高的灵敏度与准确度[12]。