致病性分析生化鉴定

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鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验

２．５ｍｍ的小菌落；在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色、具有金属光泽的小菌落；在普通琼脂斜面上的菌落为灰白色；在普通肉汤中呈均匀浑浊，管底有灰白色沉淀，并有粪臭味。２．２形态学观察经镜检可见到革兰氏阴性，两端钝圆，长约１．５～３．Ｏｍ的短小杆菌，多单在，偶有２ — ３个菌体相连，无芽孢。２．３生化鉴定将分离到的６８个菌株，经生化试验鉴定，符合大肠杆菌特征见表１：
１．１．４仪器及设备
１．２方法
光学显微镜、恒温箱、高压灭
菌器、无菌实验台、微量移液器等
１．２．１大肠杆菌的分离培养
以无菌操作的方法，
肝周炎、输卵管炎、气囊炎、关节炎等多种病型。近年
来，随着集约化养禽业的迅速发展，在一些养殖密集区广泛流行，个别地方已呈爆发流行的趋势，发病率
获得更好的临床应用效果。
１材料与方法
１．２．２形态学观察取伊红美蓝琼脂平板上紫黑色带金属光泽的单个菌落涂片，革兰氏染色镜检，观察记录菌体形态和染色特征。１．２．３生化鉴定取微量生化管及各种生化培养
基，将分离菌纯培养物的菌种接入后封口，置于３７ ℃培养箱中培养１８～２４ｈ，观察结果。
穆●
●・
试验上，而四环素、链霉素、阿莫西林等药物的敏感性较低。统计情况见表２。

细菌分布实验报告原理(3篇)

第1篇一、实验背景细菌是自然界中广泛分布的微生物，它们在人类的生活和环境中扮演着重要的角色。

了解细菌的分布情况，对于研究细菌与人类健康、环境以及生态系统之间的关系具有重要意义。

细菌分布实验旨在探究细菌在不同环境中的分布规律，分析影响细菌分布的因素，为细菌的防治和利用提供理论依据。

二、实验原理1. 细菌分布与生态环境细菌分布受多种生态环境因素的影响，包括温度、湿度、pH值、营养物质、氧气含量等。

这些因素共同构成了细菌生长的微环境。

实验中，通过对比不同环境条件下细菌的分布情况，可以了解生态环境对细菌分布的影响。

2. 细菌培养与计数细菌培养是研究细菌分布的基础。

实验中，采用适宜的培养基和培养条件，使细菌在培养基上生长繁殖。

通过观察菌落形态、颜色等特征，可以初步判断细菌的种类。

利用计数器对菌落进行计数，可以得到细菌的浓度。

3. 细菌分离与纯化为了研究特定细菌的分布情况，需要对混合细菌进行分离和纯化。

实验中，采用平板划线法、稀释涂布法等方法，将混合细菌分离成单个菌落。

通过纯化后的细菌，可以进一步研究其生物学特性。

4. 细菌鉴定细菌鉴定是研究细菌分布的关键步骤。

实验中，根据细菌的形态特征、生理生化特性、分子生物学方法等进行鉴定。

常用的鉴定方法包括显微镜观察、生化反应、DNA指纹分析等。

三、实验方法1. 空气中细菌分布检测（1）采样：采用无菌采样器采集空气样品，如空气采样管、空气采样盒等。

（2）培养：将采样器中的空气样品注入含有适宜培养基的培养皿中，进行培养。

（3）计数：培养一段时间后，统计菌落数量，计算细菌浓度。

2. 土壤中细菌分布检测（1）采样：采用无菌工具采集土壤样品，如土壤采样管、土壤铲等。

（2）培养：将土壤样品进行稀释，将稀释后的样品接种于培养基上，进行培养。

（3）计数：培养一段时间后，统计菌落数量，计算细菌浓度。

3. 水体中细菌分布检测（1）采样：采用无菌采样器采集水样，如无菌水桶、无菌试管等。

（2）培养：将水样进行稀释，将稀释后的样品接种于培养基上，进行培养。

仔猪致病性大肠杆菌分离鉴定

．２每伊红美兰琼脂平板上长出紫黑色、金带通肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基、伊红２４致病性试验取健康小白鼠２只，
只，１将纯培养的各菌属光泽的圆形菌落。美兰琼脂培养基、糖发酵培养基、枸橼酸组２随机分为１组，．／含菌数２￣／３２生化试验结果见下表０Ｌ．盐、Ｍ—Ｒ试剂、Ｐｖ— 试剂、吲哚试剂等均株以０２ｍＬ只腹腔注射（购自山东省卫生防疫站。
维普资讯
猪业科学
仔猪致病性大肠杆菌分离鉴定
钱凤芹
（山东省农业科学院高新技术研究中心，山东济南２０Ｏ）５１０
仔猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆血清，自中国兽药监察所。购
培养、生化试验、致病性试验鉴定为致病
菌引起的猪的一种急性传染病，它包括１５药敏纸片１种药敏纸片由北京天性强菌株，纯培养物接种普通琼脂平．２将
仔猪出生后一周内所发生的仔猪黄痢，坛生物制品检定所生产。板上，７３ ℃培养１～２，８４ｈ用无菌生理盐水制成浓菌液，２ ℃高压２ｈ，１１破坏其Ｋ
验，为临床合理选择药物，有效防治仔猪
大肠杆菌病提供依据。
后取出，测量抑菌环直径。
１材料
１１病料来源用无菌棉拭子从患病仔．
３结果
３１细菌分离培养结果在普通琼脂平．圆形、隆起、光滑、湿取纯培养物以无菌操作板上长出中等大小、
从生化试验
１０ｍＬ）同时以无菌普通肉汤按同剂量腹腔结果可以看出：株菌均符合大肠杆菌，

金黄色葡萄球菌的致病性及检测技术

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此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。
检测与诊断
标本采集
采自不同感染部位的各种标本，包括血液、脑脊液、穿刺液；痰液、脓液、创伤分泌物、尿液、粪便和呕吐物等。
直接涂片镜检
直接涂片检查在正常情况下呈无菌状态的体液标本如血液、脑脊液、穿刺液等，若有检出革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列、无芽胞、荚膜，直径0.5-1μm的球菌。即具有重要的临床价值。
显色培养基A计数法：稀释好的菌液0.2 mL涂布接种培养基平板上，36℃±1℃培养24 h，按说明书判读，可疑菌落做补充实验（血浆凝固酶试验，目标菌落血浆凝固酶试验为阳性）。显色培养基B计数法：稀释好的菌液0.2 mL涂布接种培养基平板上，36℃±1℃培养24 h，按说明书判读，可疑菌落做补充实验（滴加1 mol/L盐酸，目标菌落有透明圈）。
鉴别实验
一、血浆凝固酶试验
血浆凝固酶是金黄色葡萄球菌所产生的，与其致病力有关的一种侵袭性酶，其作用是使血浆中的纤维蛋白在菌体表面沉积和凝固以阻碍吞噬细胞的吞噬。血浆凝固酶分为结合型和游离型。前者结合在细菌的细胞壁上，能直接作用于血浆中的纤维蛋白原，使之转化为纤维蛋白，环绕菌体而形成凝块。而游离型血浆凝固酶则在产生后被分泌到菌体外，不能直接作用于纤维蛋白原，但可以激活血浆凝血酶原，使之转化成凝血酶，后者再作用于纤维蛋白原使其转化为纤维蛋白。具体的测量方法也因此分为玻片法和试管法两种。
金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶： a.溶血毒素：外毒素，分α、β、γ、δ四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死 b.杀死白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞
c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关

大肠埃希氏菌生化鉴定结果

大肠埃希氏菌生化鉴定结果大肠埃希氏菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，可以引起多种感染性疾病，包括腹泻、尿路感染和食物中毒等。

鉴定大肠埃希氏菌的生化特征可以帮助确定病原菌的身份以及其潜在的耐药性和毒力因子。

本次实验目的是对一株致病性大肠埃希氏菌样本进行生化鉴定，以确认其菌株的性质和特征。

首先，我们进行了气体产生实验。

在Triple Sugar Iron Agar（TSI）培养基中，观察到菌落周围发生了气体产生，此结果表明该菌株具有产气性。

产气性通常意味着大肠杆菌等需要葡萄糖产生酸，进而分解产生气体的细菌。

其次，我们进行了甲烷发酵试验。

在Methyl Red（MR）试剂中，当菌液发酵产酸时，溶液颜色由黄色变成红色。

然而，该菌株在MR试剂中没有产生红色反应，这表明它无法通过甲烷发酵产酸。

这一结果与典型的大肠杆菌不同，因为大肠杆菌通常可以通过此途径产酸。

进一步，我们进行了亮氨酸脱氨酶试验。

使用亮氨酸脱氨酶（LDC）培养基，如果菌株具有亮氨酸脱氨酶活性，菌液会变色。

然而，我们观察到该菌株在培养基中没有出现任何颜色变化，这表明它不具备亮氨酸脱氨酶活性。

亮氨酸脱氨酶活性通常是大肠杆菌的典型特征之一。

此外，我们还进行了尿素酶试验。

使用尿素平板培养基，如果菌株具有尿素酶活性，培养基颜色将由黄色变为粉红色。

然而，我们观察到该菌株在培养基上未显示出任何颜色变化。

这暗示着该菌株可能缺乏尿素酶活性，与大肠杆菌的典型特征不同。

最后，我们进行了青霉素酶试验。

使用青霉素酶试纸进行反应检测，在试纸上出现蓝色点状斑点表示菌株具有青霉素酶活性。

而对于这个菌株，我们观察到在试纸上没有出现蓝色斑点。

这意味着该菌株可能对青霉素类药物敏感，这对于抗生素选择治疗提供了重要信息。

综上所述，通过对致病性大肠埃希氏菌样本进行生化鉴定，我们发现该菌株具有产气性，但与典型的大肠杆菌不同，它不表现出甲烷发酵、亮氨酸脱氨酶和尿素酶活性。

API20E生化鉴定条在致病菌检验中的应用

API20E生化鉴定条在致病菌检验中的应用摘要】目的提高API20E鉴定系统在肠道致病菌鉴定中的应用。

方法应用API20E和国产生化鉴定管对13株阳性菌株（4株致病性大肠埃希氏菌、7株志贺氏菌、2株甲型副伤寒菌）进行鉴定比较，并经血清学凝集验证。

结果表明API20E鉴定系统方法程序简化，检测结果准确可靠，对致病菌鉴定有现实的指导意义，可作为常规致病菌检测方法。

【关键词】API20E生化鉴定条、生化鉴定管、沙门氏菌、志贺氏菌【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）30-0305-02近年来新的生化鉴定系统不断推出，以传统的试验方法来鉴定致病菌已不能适应准确、快速诊断的需求。

API20E生化鉴定系统是由法国生物梅里埃公司生产细菌数值分类鉴定系统，它的鉴定能力强，数据库不断更新和补充完善，已被许多国家和组织列入标准方法。

现在就API20E生化鉴定系统与国产生化鉴定官的鉴定效果进行比较对比，报告如下：1、样品、材料和检测依据1.1样品来源：本地区历年检测出的阳性菌株13株（4株致病性大肠埃希氏菌、7株志贺氏菌、2株甲型副伤寒菌）1.2、材料：API20E生化反应试剂条（法国生物梅里埃公司生产），批号：1002230950；API-Plus鉴定软件；国产细菌生化鉴定管（北京路桥公司生产），批号：20140218；志贺氏菌属诊断血清22种（宁波天润生物药业公司生产），批号：20140201；肠道致病性大肠埃希氏菌诊断学清15种（宁波天润生物药业公司生产）批号：20140201；沙门氏菌属诊断血清30种（宁波天润生物药业公司生产），批号：20140201。

1.3、检验依据：沙门氏菌检验方法：GB/T4789.4-2010、志贺氏菌检验方法：GB/T4789.5-2012、致泻性大肠埃希氏菌检验方法：GB/T4789.6-2003。

API20E生化反应试剂条和国产细菌生化鉴定管按厂家操作说明书进行操作。

211240638_一株鸭腺病毒3型的分离、鉴定及致病性分析

畜牧兽医学报 2023,54(5):2050-2061A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.05.026开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析曹秀芸1,刘吉文1,汤智辉1,郑紫怡1,闫丽萍1,2*,宋素泉1*(1.南京农业大学动物医学院动物健康与食品安全实验室,南京210000;2.南京农业大学免疫研究所,南京210000)摘要:从现地分离一株3型鸭腺病毒(d u c k a d e n o v i r u s 3,D A d V -3)并命名为D A d V -3Y N 株,分析该毒株的基因特征与致病特性,本研究选用L MH 细胞进行病毒分离与纯化,并对Y N 株的h e x o n ㊁p e n t o n b a s e ㊁f i b e r 1和f i b e r 2基因进行测序分析㊂通过腿部肌肉注射病毒感染7日龄番鸭,观察番鸭精神状态,记录体重变化㊁脏器剖检特征㊁组织病理学变化㊁计算脏器载毒量㊁泄殖腔拭子排毒量以及血清生化等数据,同时测定法氏囊与脾内凋亡相关基因转录水平以探究Y N 株对宿主免疫功能的影响㊂结果显示,番鸭感染Y N 株后体重增长受到显著抑制(P <0.01;P <0.0001);体内各脏器均出现不同程度病变,攻毒组鸭的肝组织与肾组织脏器系数均大于对照组且在攻毒后第7天差异极显著(P <0.01);攻毒组番鸭血清内丙氨酸氨基转移酶㊁天冬氨酸氨基转移酶和尿素氮含量均显著高于对照组(P <0.001,P <0.0001);同时,法氏囊与脾内细胞凋亡相关基因m R N A 水平显著上升(P <0.01;P <0.001)㊂以上结果提示,Y N 株感染7日龄番鸭后,可以导致肝和肾等脏器损伤,同时可以诱导法氏囊与脾内细胞凋亡从而影响番鸭免疫功能㊂关键词:鸭腺病毒3型;基因特征;致病力;免疫功能中图分类号:S 858.32 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)05-2050-12收稿日期:2022-05-18基金项目:禽腺病毒亚单位疫苗平台的构建及应用项目(J B G S 202103)作者简介:曹秀芸(1997-),女,浙江绍兴人,硕士生,主要从事病毒分离工作,E -m a i l :1677588114@q q.c o m *通信作者:闫丽萍,主要从事动物传染病学研究,E -m a i l :y a n l i p i n g @n j a u .e d u .c n ;宋素泉,主要从事临床兽医相关研究,E -m a i l :s u q u a n .s o n g@n ja u .e d u .c n I s o l a t i o n ,I d e n t i f i c a t i o n a n d P a t h o g e n i c i t y A n a l y s i s o f a D u c k A d e n o v i r u s T y pe 3C A O X i u y u n 1,L I U J i w e n 1,T A N G Z h i h u i 1,Z H E N G Z i y i 1,Y A N L i p i n g 1,2*,S O N G S u qu a n 1*(1.A n i m a l H e a l t h a n d F o o d S a f e t y L a b o r a t o r y ,C o l l e g e o f V e t e r i n a r y Me d i c i n e ,N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210000,C h i n a ;2.N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y I n s t i t u t e of I mm u n o l og y ,N a n j i n g 210000,C h i n a )A b s t r a c t :T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y wa s t o i s o l a t e a n o v e l D u c k a d e n o v i r u s 3(D A d V -3)Y N s t r a i n a n d e l u c i d a t e i t s g e n e t i c c h a r a c t e r i s t i c s a n d p a t h o g e n i c i t y.L MH c e l l s w e r e s e l e c t e d f o r v i -r u s i s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n ,a n d t h e n t h e v i r u s g e n e s ,i n c l u d i n g h e x o n ,pe n t o n b a s e ,f i b e r 1,a n d f i b e r 2w e r e s e q u e n c e d a n d a n a l y z e d .S e v e n -d a y s -o l d M u s c o v y d u c k s w e r e i n f e c t e d b y i n t r a -m u s c u l a r i n j e c t i o n i n t h e l eg s ,a n d th e m e n t a l s t a t e o f t h e d u c k s w a s o b s e r v e d .B e si d e s ,t h e b o d yw e i g h t c h a n g e s ,n e c r o p s y c h a r a c t e r i s t i c s o f o r g a n s ,h i s t o p a t h o l o g i c a l c h a n ge s ,v i r a l l o a d of o r -g a n s ,c l o a c a s w a b d e t o x i f i c a t i o n ,a n d s e r u m b i o ch e mi s t r y w e r e r e c o r d e d a n d a n a l y z e d .F u r t h e r -m o r e ,t h e t r a n s c r i p t i o n l e v e l s o f a p o p t o s i s -r e l a t e d g e n e s i n t h e b u r s a a n d t h e s pl e e n w e r e m e a s -u r e d t o e x p l o r e t h e e f f e c t o f Y N s t r a i n o n i mm u n e f u n c t i o n .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e w e i gh t g a i n o f i n f e c t e d d u c k s w a s s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d (P <0.01,P <0.0001),a n d d i f f e r e n t d e gr e e s o f l e s i o n s a p p e a r e d i n v a r i o u s o r g a n s .T h e c o e f f i c i e n t s o f l i v e r s a n d k i d n e y s o f t h e e x pe r i m e n t a l5期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析g r o u p w e r e l a r g e r t h a n t h o s e o f t h e c o n t r o l g r o u p,a n d t h e d i f f e r e n c e w a s e x t r e m e l y s i g n i f i c a n t o n t h e7t h d a y a f t e r t h e c h a l l e n g e.A l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e,a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e,a n d u r e a n i t r o g e n i n t h e s e r u m o f t h e M u s c o v y d u c k s i n t h e c h a l l e n g e g r o u p w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h o s e i n t h e c o n t r o l g r o u p(P<0.001,P<0.0001).A t t h e s a m e t i m e,t h e m R N A l e v e l s o f a p-o p t o s i s-r e l a t e d g e n e s i n t h e b u r s a a n d t h e s p l e e n i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y(P<0.01,P<0.001).(C o n c l u s i o n)T h e a b o v e r e s u l t s s u g g e s t t h a t D A d V-3Y N s t r a i n c a n d a m a g e l i v e r s a n d k i d n e y s w h e n c h a l l e n g i n g t h e7-d a y s-o l d M u s c o v y d u c k s,s i m u l t a n e o u s l y,i t c a n a f f e c t t h e i mm u n e f u n c-t i o n o f M u s c o v y d u c k s b y c a u s i n g a p o p t o s i s o f c e l l s i n t h e b u r s a a n d t h e s p l e e n.K e y w o r d s:d u c k a d e n o v i r u s3;g e n e t i c c h a r a c t e r i s t i c s;p a t h o g e n i c i t y;i mm u n e f u n c t i o n*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:Y A N L i p i n g,E-m a i l:y a n l i p i n g@n j a u.e d u.c n;S O N G S u q u a n,E-m a i l: s u q u a n.s o n g@n j a u.e d u.c n鸭腺病毒(d u c k a d e n o v i r u s,D A d V)被发现最早可以追溯到1977年法国番鸭场中爆发的一场大规模疾病之中,在疫病中被感染的番鸭体重下降,站立不稳,直到1982年,B o u q u e t等[1]通过中和试验,确认该病毒不同于之前所知的禽腺病毒属成员,是一种新型腺病毒㊂2011年,H a r r a c h等[2]提议将这种病毒命名为2型鸭腺病毒(d u c k a d e n o v i r u s2, D A d V-2),但是因为缺乏全株基因序列,该提议并没有被国际病毒委员会(T h e I n t e r n a t i o n a l C o m-m i t t e e o n T a x o n o m y o f V i r u s e s,I C T V)所采纳㊂2014年,奥地利科学家M a r e k等[3]成功获得D A d V-2全基因组序列㊂同年在我国广东,部分番鸭养殖场也出现了类似D A d V-2感染的症状,对所分离毒株进行全基因组测序发现,分离株不同于先前的D A d V-2G R株,被认为是3型鸭腺病毒(d u c k a d e n o v i r u s3,D A d V-3)的候选毒株[4-5]㊂根据I C-T V最新分类,D A d V-2和D A d V-3均属于禽腺病毒属成员㊂目前,国内多地流行的鸭腺病毒仍以D A d V-3为主[6],被感染番鸭主要表现为肝㊁肾肿胀出血和轻微心包积液㊂发病率在40%~55%之间,死亡率可达35%~43%,给各地养殖场带来极大的经济损失[6]㊂2021年7月,云南某番鸭养殖场内7日龄雏鸭纷纷发病,呈现典型D A d V-3的感染症状,本实验室在此批病料中分离获得1株D A d V-3,命名为D A d V-3Y N株㊂本研究拟通过分析毒株的4段主要结构蛋白基因,并感染7日龄番鸭观察分析其临床症状㊁脏器变化㊁脏器载毒量以及法氏囊内细胞凋亡相关基因转录水平,对D A d V-3的遗传特性和致病特征做出全面系统描述,以期为临床对D A d V-3的科学防控提供理论支持㊂1材料与方法1.1试剂材料T r e l i e f T M A n i m a l G e n o m i c D N A K i t购自擎科生物有限公司,2ˑH i e f f P C R M a s t e r M i x㊁H i f a i r Ⅱ1s t S t r a n d c D N A S y n t h e s i s K i t㊁H i e f f U N I C O N q P C R S Y B R G r e e n M a s t e r M i x购自翌胜生物, R N A i s o l a t e r T o t a l R N A E x t r a c t i o n R e a g e n t购自诺唯赞生物公司;D L600D N A M a r k e r㊁D L2000 D N A M a r k e r㊁p M D T M18-T V e c t o r C l o n i n g K i t购自T a k a R a宝日医生物公司㊂1.2样品处理与病原检测2021年7月,云南某番鸭养殖场内7日龄番鸭广泛发病,主要临床病变为肝肾肿胀出血㊂无菌采集番鸭肝组织冷藏运送至实验室进行检测㊂取适量肝组织置于E P管内,充分研磨后取组织悬液上清,按照说明书提取组织D N A和R N A㊂使用常见鸭源病毒引物进行检测,P C R阳性产物连接T载体后送往擎科生物有限公司进行测序验证,每样质粒送3份样品㊂1.3病毒扩增与纯化选取雄性莱昂鸡肝癌(L e g h o r n m a l e h e p a t o-m a,L MH)细胞按照文献中内容进行病毒扩增,当80%以上细胞出现病变后收取培养上清[7]㊂采取有限稀释法进行病毒纯化,3轮有限稀释法后用P C R 方法检测无外源病毒,随后使用蚀斑试验进一步纯化病毒株㊂1.4病毒T C I D50测定L MH细胞接种于96孔板,根据文献中方法接毒[8-9],采用R e e d-M u e n c h两氏法计算T C I D50为107.8㊃m L-1㊂收集细胞培养上清用于后续试验㊂1502畜牧兽医学报54卷1.5Y N株主要结构蛋白基因序列分析参照N C B I上已有D A d V-3G D MM10株(MH777398)的h e x o n㊁p e n t o n b a s e㊁f i b e r1和f i-b e r2基因序列,设计5对引物进行序列扩增,引物由擎科生物有限公司合成,相关信息见下表㊂按照各自退火温度进行P C R扩增,在1%琼脂糖凝胶上电泳,切下明亮条带连接T载体后送往擎科生物有限公司进行测序㊂所得测序结果使用D N AMA N 软件进行序列拼接并使用M E G A7进行序列比对分析㊂表1测序引物信息表T a b l e1T h e i n f o r m a t i o n o f s e q u e n c i n g p r i m e r s引物名称P r i m e r n a m e 引物序列(5'ң3')S e q u e n c e(5'ң3')片段长度/b pP r o d u c t l e n g t h退火温度/ħA n n e a l i n g T e m p e r a t u r eD-h e x o n-A F:A T C G C G T A G A C G A A T GR:T G G C A G G T A A T C A G C A 140660D-h e x o n-B F:T A A T A T C C C G G C T T C T AR:G C T G A C T G T C G G T G G T T 156460D-p e n t o n F:T A G C C A A T A A C T T A C C G CR:A T C C T A G A G C A C G A C C T T 168162D-f i b e r1F:A A G G C A G G A T T C A G A G GR:C A G A A C G G A T A T G T T A G G T C 151357D-f i b e r2F:C G T A C C T A G C G A A G A T T GR:T G C C A T G C G A G T A C A T T 160053F.上游引物序列;R.下游引物序列㊂下同F.F o r w a r d p r i m e r s e q u e n c e.R.R e v e r s e p r i m e r s e q u e n c e.T h e s a m e a s b e l o w1.6D A d V-3Y N株动物致病性试验1.6.1试验动物分组与攻毒设计1日龄番鸭(购自南京特给力种植有限公司)适应性饲养至7日龄,随机分为攻毒组与对照组㊂对照组包含12只番鸭,攻毒组分为观察组与剖检组,每组各10只㊂攻毒组番鸭腿部肌肉注射0.3m L病毒液(3ˑ106.8㊃m L-1 T C I D50),对照组相同部位注射0.3m L P B S㊂攻毒组与对照组番鸭在不同房间饲养,并由不同人员管理,其余条件相同,连续观察14d,记录观察组番鸭临床变化,攻毒后每间隔2d称量番鸭体重并采集泄殖腔拭子㊂剖检组与对照组番鸭在攻毒后第3与第7天随机剖检3只㊂攻毒后14d安乐死剩余攻毒组与对照组番鸭并进行剖检㊂1.6.2剖检观察与切片制作番鸭静脉采血后处死㊂对番鸭进行解剖,观察有无脏器病变㊂称取心㊁肝㊁肾重量并计算脏器系数,脏器系数的计算公式为:脏器重量(g)/体重(g)*100%㊂采集脏器保存于-80ħ冰箱准备后续检测病毒,固定攻毒后第7天番鸭相应脏器,送往武汉皮诺飞生物公司制作切片㊂1.6.3血清生化检测攻毒后第3㊁7和14天分别采集攻毒组与对照组血清,使用南京建成生物工程研究所检测试剂盒检测番鸭血清内丙氨酸氨基转移酶(a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e,A L T)㊁天冬氨酸氨基转移酶(a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e,A S T)和尿素氮(u r e a n i t r o g e n,B U N)三种酶含量,每个样本重复检测3次㊂参照说明书计算分析酶活性㊂1.6.4番鸭排毒量与脏器病毒载量测定攻毒后第3㊁7和14天分别采集攻毒组与对照组番鸭脏器,攻毒后每隔2d采集泄殖腔拭子㊂依照说明书步骤提取病毒D N A㊂以D A d V-3Y N株h e x o n基因序列为模板,使用P r i m e r5软件设计引物,引物信息见表2,引物由擎科生物有限公司合成㊂以实验室所构建T-h e x o n质粒为阳性模板,按照文献方法[10],10倍比稀释制作荧光定量标准曲线㊂q P C R检测脏器与泄殖腔拭子所含病毒,将攻毒组C t值数据带入标准曲线公式内计算拷贝数㊂每个样品重复3次㊂根据10c o p i e s病毒量为界限, 3个重复孔C t值大于35的判定为阴性,反之则判断为阳性㊂1.6.5法氏囊与脾凋亡基因m R N A转录水平测定 T R I z o l法提取法氏囊和脾总R N A并反转录成c D N A,S Y B R G r e e n q P C R进行检测,所得数据基于2-әәC t的方式进行计算,获得促凋亡基因25025期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析B a x,B a k-1,c a s p a s e-3和c a s p a s e-9以及抑凋亡基因B c l-2的转录水平㊂引物参考现有文献内序列,相关信息见表3,由擎科生物有限公司合成㊂表2D A d V-3病毒定量P C R引物信息T a b l e2P r i m e r i n f o r m a t i o n o f q u a n t i t a t i v e P C R d e t e c t i o n f o r D A d V-3引物名称P r i m e r n a m e 引物序列(5'ң3')S e q u e n c e(5'ң3')片段长度/b pP r o d u c t l e n g t hD A d V-3-F G T C T G C T C A G G T A C G C T T A A T T CD A d V-3-R T C T A C T G C C T G A T T C C A T A G T G C149表3引物信息表T a b l e3P r i m e r i n f o r m a t i o n引物名称P r i m e r n a m e 引物序列(5'ң3')S e q u e n c e(5'ң3')片段长度/b pP r o d u c t l e n g t hB a x[11]F:A A AC C A A G C G G C T C A G C G A G TR:G G C C C C A G T T G A A G G C T C C G T C C 162B a k-1[12]F:G G T G A GC C A G C G T T A G A A A GR:G C T C C T G T C A C C A T G T T C C T 135B c l-2[12]F:G G A G G GC T G A A A G A A A A A GR:T A T G A T G C G G C A C G A C T G 213c a s p a s e-3[12]F:C G G A C T G T C A T C T C G T T C A G G C A CR:G T C C T T C A T C G C C A T G G C T T A G C 200c a s p a s e-9[11]F:A T C C T G T C C C A C G G C T G T C AR:T C G G G T G A A T C G C A A T C C A C T 212β-a c t i n[12]F:A T G T C G C C C T G G A T T T C GR:C A C A G G A C T C C A T A C C C A A G A A1651.7数据分析本研究中使用G r a p h P a d P r i s m整理试验数据并绘图,数据均表示为平均值ʃ标准误差(m e a nʃS E M) ,通过双因素方差分析(T w o-w a y A N O V A)对不同组数据之间的差异性进行统计学检验㊂*Pɤ0.05被认为具有显著性差异㊂2结果2.1病毒的分离番鸭样品经过检测发现禽流感病毒㊁减蛋综合征病毒㊁4型禽腺病毒等常见病原均为阴性,但D A d V-3呈强阳性,同时伴随着鸭瘟病毒(d u c k e n-t e r i t i s v i r u s,D E V)和番鸭细小病毒(M u s c o v y d u c k p a r v o v i r u s,M D P V)感染㊂P C R产物经过测序比对确认无误㊂选择L MH细胞进行病毒分离,病毒接种于L MH细胞24h后,细胞出现典型的细胞病变(图1A):细胞皱缩呈现葡萄串状,大量死细胞脱落漂浮于培养上清中,与腺病毒接毒后病变相似[13]㊂病毒在细胞上多次传代均可见一致的细胞病变㊂收取细胞培养上清,P C R结果显示培养上清中可扩增得到633b p的特异性条带(图1B)㊂2.2Y N株基因进化分析鸭腺病毒主要依据h e x o n与f i b e r等基因序列的同源性进行种属分类[6,14]㊂序列比对结果显示(图2),Y N株h e x o n,p e n t o n b a s e和f i b e r1基因与D A d V-3G D MM10株以及C H-G D-12-2014株高度同源(100%);f i b e r2在第1338个碱基处存在突变,由腺嘌呤(A)突变为胞嘧啶(C),翻译的氨基酸由异亮氨酸变为谷氨酰胺,与G D MM10等毒株相同源性99.93%㊂与禽腺病毒的一些血清型相比,Y N 株与G o o s e a d e n o v i r u s-4同源性更高,相比之下禽腺病毒虽然也能感染鸭,但与Y N株同源性相对较低㊂3502畜牧兽医学报54卷A.接毒后L MH 细胞产生病变;B .D A d V -3P C R 后电泳结果:M.D L 2000D N A M a r k e r ;1.阳性对照;2.细胞培养上清;3.阴性对照A.C y t o p a t h i c e f f e c t (C P E )w a s p r o d u c e d i n L MH c e l l s p o s t -i n f e c t i o n o f t h e v i r a l i s o l a t e ;B .E l e c t r o ph o r e s i s r e s u l t s o f D A d V -3a f t e r P C R :M.D L 2000D N A M a r k e r ;1.P o s i t i v e ;2.C e l l c u l t u r e s u p e r n a t a n t ;3.N e ga t i v e c o n t r o l 图1 Y N 株接毒后细胞病变与P C R 检测F i g .1 C y t o pa t h i c e f f e c t d e t e c t e d i n L M H c e l l a n d P C R d e t e c t i o n o f Y N s t r a in A.h e x o n 基因进化树;B .p e n t o n b a s e 基因进化树;C .f i b e r 1基因进化树;D.f i b e r 2基因进化树㊂方框内为本研究中Y N 株A.G e n e t i c e v o l u t i o n a r y t r e e o f h e x o n g e n e ;B .G e n e t i c e v o l u t i o n a r y t r e e o f p e n t o n b a s e g e n e ;C .G e n e t i c e v o l u t i o n a r y tr e e o f f i b e r 1g e n e ;D.G e n e t i c e v o l u t i o n a r y t r e e o f f i b e r 2g e n e .T h e Y N s t r a i n w a s s h o w e d b y a bo x 图2 D A d V -3Y N 株基因进化树F i g .2 G e n e t i c e v o l u t i o n a r yt r e e o f D A d V -3Y N s t r a i n 2.3 攻毒后番鸭临床症状7日龄番鸭攻毒后出现精神沉郁,蹲卧好静等情况,未见死亡病例㊂对照组番鸭精神状态良好,生长发育正常㊂每隔2d 对番鸭进行称重(图3),结果显示,攻毒组番鸭体重在第7与第9天显著低于对照组(P <0.0001),攻毒后第11天攻毒组仍显著低于对照组(P <0.05)㊂直至攻毒后第13天,两组番鸭体重差异不显著㊂结果表明,7日龄番鸭攻毒后体重增长受到一定抑制㊂2.4 攻毒后番鸭脏器病变2.4.1 脏器解剖学病变雏鸭通过腿部肌肉注射感染病毒后,在感染后第3㊁7和第14天进行剖检,发现攻毒组番鸭出现轻微心包积液(图4A ),心表观未见明显变化㊂在第3㊁7天肝组织略显肿大并45025期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析*.P <0.05;**.P <0.01;***.P <0.001;****.P <0.0001,下同*.P <0.05;**.P <0.01;***.P <0.001;****.P <0.0001.T h e s a m e a s b e l o w图3 攻毒后番鸭体重(n =5)F i g .3 B o d y w e i g h t o f M u s c o v y du c k s a f t e r i n f e c t i o n (n =5)存在出血点,第14天肝充血肿胀,边缘略显钝圆,存在明显出血点(图4B )㊂此外,攻毒组番鸭肾组织存在不同程度的肿胀,颜色加深(图4C )㊂脾淤血肿胀,边缘钝圆,颜色暗红(图4D )㊂2.4.2 脏器组织病理学变化固定脏器相应部位后制作切片,显微镜观察未发现心肌细胞出现明显变化㊂攻毒组番鸭肝细胞变性,染色不均,肝细胞排列混乱,肝索结构消失㊂脾淤血,大量红细胞分布于脾细胞间㊂攻毒后番鸭肾组织内肾小球萎缩,与小囊间间隙增大且肾小囊内血细胞增多,肾小管上皮细胞变性㊁肿大突入管腔内导致管腔狭窄,小管结构不清(图5)㊂A.番鸭出现心包积液;B .番鸭肝组织病变;C .攻毒后番鸭肾组织病变;D.番鸭脾组织病变㊂心包内积液由黑色箭头指出,肝组织出血点由白色箭头指出㊂d pi 表示攻毒后天数A.P e r i c a r d i a l e f f u s i o n a f t e r i n f e c t i o n ;B .P a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f l i v e r s ;C .P a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f k i d n e y s ;D.P a t h o l o gi -c a l c h a n g e s o f s p l e e n s .P e r i c a r d i a l e f f u s i o n w a s s h o w e d b y b l a c k a r r o w s a n d b l e e d i n g p o i n t i n l i v e r s w a s s h o w e d b y w h i t e a r -r o w s .d p i m e a n s d a ys p o s t i n f e c t i o n 图4 攻毒后番鸭脏器病变F i g .4 O r g a n s p a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f M u s c o v y du c k s a f t e r i n f e c t i o n 2.4.3 脏器系数变化通过计算脏器系数,发现攻毒组与对照组番鸭心脏系数无明显差异,攻毒组番鸭的肝脏与肾脏系数在攻毒后均大于对照组,在攻毒后第7天存在显著差异(图6A ,P <0.01),提示攻毒后肝㊁肾存在一定肿胀㊂2.4.4 血清生化指标变化检测血清A L T ,A S T 以及B U N 三种酶的含量㊂结果显示,血清内B U N 含量在攻毒后第3㊁7㊁14天都显著高于对照组(P <0.001)㊂A L T 在攻毒后第3㊁7与14天差异极显著(P <0.01,P <0.001)㊂攻毒组血清A S T5502畜牧兽医学报54卷图5 不同脏器病理切片(400ˑ)F i g .5 P a t h o l o g i c a l s e c t i o n o f d i f f e r e n t o r ga n s (400ˑ)A.心脏系数;B .肝脏系数;C .肾脏系数;D.血清B U N 含量;E .血清A L T 含量;F .血清A S T 含量A.C a r d i a c c o e f f i c i e n t ;B .L i v e r c o e f f i c i e n t ;C .K i d n e y co e f f i c i e n t ;D.L e v e l o f B U N ;E .L e v e l o f A L T ;F .L e v e l o f A S T 图6 脏器系数与血清生化指标(n =3)F i g .6 O r ga n c o e f f i c i e n t a n d s e r u mb i oc h e m i c a l i nde x (n =3)含量在攻毒后第3天(P <0.01),第7天(P <0.001)和第14天(P <0.01)与对照组相比差异极显著(图6B )㊂结果提示攻毒后番鸭肝与肾均存在一定损伤㊂2.5 攻毒后番鸭排毒量与脏器载毒量使用荧光定量P C R 对所采集泄殖腔拭子以及不同组织脏器进行检测,结果显示,攻毒后番鸭排毒量持续在102~103c o pi e s ㊃m L -1,攻毒后第1天排毒量最高,直至试验结束仍可向环境中持续排毒(图7A )㊂攻毒后番鸭肝与心载毒量较高,在攻毒后第7和14天分别达105和104c o p i e s ㊃g -1,攻毒后第7与14天,肝载毒量逐渐升高,与其他脏器差异显著(P <0.01,P <0.001,P <0.0001)㊂攻毒后脾脏载毒量较其他脏器略低,约103~104c o p i e s ㊃g -1㊂试验过程中对照组番鸭的泄殖腔拭子与脏器载毒量检测均呈阴性㊂2.6 法氏囊与脾凋亡相关基因转录水平由结果可知(图8㊁9),攻毒后番鸭法氏囊与脾65027502 5期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析A.攻毒后试验组番鸭泄殖腔排毒情况;B.攻毒后3d脏器载毒量;C:攻毒后7d脏器载毒量;D.攻毒后14d脏器载毒量㊂数据分析采用双因素方差分析(n=3)㊂相同字母表示两组数据无显著差异,不同字母表示两组数据存在显著差异,肝与其他脏器差异性用*表示A.E x p e l l i n g o f t o x i n i n c l o a c a o f e x p e r i m e n t d u c k s a f t e r i n f e c t i o n;B.O r g a n v i r u s l o a d i n3d a y s p o s t-c h a l l e n g e;C.O r g a n v i r u s l o a d i n7d a y s p o s t-c h a l l e n g e;D.O r g a n v i r u s l o a d i n14d a y s p o s t-c h a l l e n g e.D a t a w e r e a n a l y z e d u s i n g t w o-w a y A N O-V A(n=3).T h e s a m e l e t t e r i n d i c a t e s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o g r o u p s a n d t h e d i f f e r e n t l e t t e r s i n d i c a t e s i g-n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e t w o g r o u p s o f d a t a,t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e l i v e r a n d o t h e r o r g a n s i s i n d i c a t e d b y*图7攻毒后试验组番鸭泄殖腔排毒量与脏器组织病毒载量F i g.7V i r a l l o a d o f c l o a c a l s w a b a n d v i s c e r a i n e x p e r i m e n t d u c k s a f t e r i n f e c t i o n图8法氏囊凋亡相关基因转录水平(n=3)F i g.8T r a n s c r i p t i o n l e v e l o f a p o p t o s i s-r e l a t e d g e n e s i n b u r s a(n=3)畜牧兽医学报54卷图9 脾凋亡相关基因转录水平(n =3)F i g .9 T r a n s c r i p t i o n l e v e l o f a p o p t o s i s -r e l a t e d g e n e s i n s pl e e n (n =3)促凋亡基因转录水平出现不同程度升高㊂攻毒组番鸭在攻毒后第7天法氏囊内4种促凋亡基因B a x ㊁B a k -1㊁c a s p a s e -3和c a s pa s e -9转录水平显著高于对照组(P <0.0001),攻毒后第14天B a x (P <0.01)㊁B c l -2(P <0.001)㊁c a s pa s e -3(P <0.0001)和c a s pa s e -9(P <0.0001)也显著高于对照组㊂抑凋亡基因B c l -2则在攻毒后第7天(P <0.0001)和第14天(P <0.01)显著下降,B c l -2/B a x 比值也在攻毒后显著下降(P <0.001,P <0.0001)㊂结果表明攻毒后番鸭法氏囊内细胞凋亡水平上升㊂攻毒后第7天番鸭脾内凋亡相关基因转录水平均显著高于对照组(P <0.0001),抑凋亡基因转录水平显著下降(P <0.01,P <0.0001);攻毒后第14天B a x (P <0.01)㊁B a k -1(P <0.001)和c a s p a s e -3㊁c a s pa s e -9(P <0.0001)也显著升高㊂B c l -2/B a x 比值也在攻毒后第7与14天显著下降,以上数据提示攻毒后番鸭脾内细胞凋亡水平上升㊂3 讨论2014年从广东番鸭体内分离到第一株D A d V -3后[15],国内报告D A d V -3临床感染的情况越来越多㊂2018年,S h i 等[14]自福建㊁浙江㊁安徽和广东分离得到4株鸭腺病毒㊂2016 2019年间,S h i 等[6]分离得到7株D A d V -3,全基因组测序发现O R F 67存在缺失,可能是新的突变株㊂2018 2020年间,广东㊁福建与广西三省番鸭养殖场发生多起D A d V -3感染病例,Y i n 等[16]从病料中分离获得12株D A d V -3㊂本实验室从来自云南的病料中分离得到1株D A d V -3Y N 株,序列比对后发现该毒株与目前在国内流行的C H -G D -12-2014株以及G D MM 10株等相应片段相似度为99.93%~100%㊂不同于现有突变株存在的O R F 67截断突变,Y N 株f i b e r 2蛋白长短未改变,也未见对盲肠存在明显致病效果[6]㊂目前对禽腺病毒的研究发现,毒株的致病能力强弱主要由h e x o n ,f i b e r 2蛋白决定[17-18],有研究表明,f i -b e r 2作为保护性抗原可针对病原感染提供免疫保护[19-20],也有学者认为,f i b e r 1在病毒侵染宿主过程中起到主要作用[21]㊂因此,研究4段主要结构蛋白的基因序列对预测分离株的毒力有一定的指导意义㊂之前的研究报道中,鸭腺病毒可以抑制受感染番鸭的生长发育[1,4],同属的禽腺病毒也存在相同的抑制作用[22]㊂本研究中感染番鸭精神状态不佳,体重增长受到显著抑制,与之前研究相一致㊂对攻毒后番鸭脏器进行检测发现各脏器均存在病毒扩增,在肝组织中拷贝量最高㊂番鸭感染D A d V -3后可向环境中持续排毒,这可能对同群番鸭造成感染风险㊂这也与之前对禽腺病毒的研究相符合:禽腺病毒可以通过口-粪传播途径造成水平传播[23]㊂85025期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析剖检结果显示,番鸭感染Y N株后肝㊁肾等脏器均出现一定病变,与之前C H-G D-12-2014株感染后病变相似[4]㊂相应脏器固定后切片染色,可观察到相对应的组织学病变,同之前S h i等[6]与Y i n等[16]所观察的D A d V-3导致的组织病理学变化相似㊂A L T㊁A S T和B U N分别在肝与肾细胞受到损伤时逸出到血液中[24],因此,本研究攻毒组番鸭血清A L T㊁A S T和B U N含量升高也从侧面证明了番鸭的肝与肾受损㊂B a x与B a k-1作为同一促凋亡家族蛋白,两者之间可形成二聚体激活c a s p a s e[11,25];c a s p a s e-9为凋亡初始阶段发生作用蛋白,c a s p a s e-3则为凋亡的执行者 ,一旦被激活则使细胞发生不可逆的凋亡[26]㊂本研究中,攻毒组番鸭在感染后法氏囊与脾内B a x等促凋亡基因的表达量均显著上升,B c l-2/ B a x则在攻毒后显著降低,提示法氏囊与脾功能可能受到损害㊂法氏囊是禽类主要免疫器官,在体液免疫中起到重要作用,与宿主抵抗病毒时抗体水平息息相关[27]㊂一些疾病如传染性法氏囊损伤法氏囊后,宿主的免疫功能受到影响[28]㊂研究发现,当传染性法氏囊与禽腺病毒共同感染鸡时,可以导致宿主免疫反应降低以及死亡率增加[29]㊂脾是全身免疫的重要器官,与禽类的先天性免疫息息相关[30],在病毒侵入机体时积极响应[31]㊂已有研究发现,当一些病原感染机体后通过使脾坏死从而削弱宿主的免疫能力[32]㊂本研究中番鸭中枢免疫与外周免疫器官均受到一定影响,势必会增加其他病原的共感染风险㊂流行病学调查发现禽类养殖场内常存在腺病毒与其他病原混合感染的情况[33-35],亦有报道称D A d V-3与其他病原混合感染后可能会导致D A d V-3临床症状加剧[14,16]㊂本研究检测发现,D A d V-3Y N株存在与D E V㊁M D P V混合感染的情况,番鸭免疫机能受到影响,可能导致养殖场内番鸭在混合感染的情况下D A d V-3的临床症状加剧或者其他病原在番鸭体内致病能力增强,这也从侧面解释了实验室感染D A d V-3Y N株后致病能力弱于当地番鸭的临床感染㊂4结论本研究自云南番鸭养殖场分离得到1株鸭腺病毒,通过对分离株的主要基因序列进行分析证实该病毒为D A d V-3㊂致病性试验证实该病毒以较为温和的方式在番鸭群体中流行,感染番鸭后影响其生长性能,损害多个脏器,且导致番鸭持续向环境中排毒,还可以影响番鸭的免疫功能㊂因此,本研究对D A d V-3的分离鉴定和早期防控都具有重要意义㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] B O U Q U E T J F,MO R E A U Y,M C F E R R A N J B,e ta l.I s o l 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对致病性猪链球菌病的实验室检测分析

四检疫检验
病ｙｃｓ检对致病致性性猪链球菌病是球菌金黄色葡的菌（ｔｐｈｌｃｃｕｕｅｓＡ蛋白猪链分与病萄球实Ｓａ验ｏｏ室ａｒｕ）测
布范围极广的猪的传染病之
一
，
（Ａ相结合，Ｓ）Ｐ再与待检的临床分离菌株作玻板凝集刘界各国李凤试验，危害严重，元臣均有龙王大钊 ¨出现特异的颗粒状楠物。世阳性反应刘杨兰毅凝集
目，前对致病性猪链球菌病的发生规律、病原特性以及防治措施还不十分清楚，单纯靠药物又不能有效地控制该
病的发生和蔓延。因此，我们从病原学着手研究，以便为控
４多重ＰＣＲ技术
有人根据型特异性的荚膜多糖基因设计引物，
先接种于硫乙醇酸盐肉汤增菌培养后，在转种于血液琼脂平板上接种，７Ｃ３￣培养２～８，，形４４个ｄＨ，－ｔ
成大头针帽大小，无色、粘稠、露珠状菌落，菌落周围
有完全透明的溶血环现象。血清学方法包括协ｆ
５药物试验
用接种环取致病菌菌落，稀释后接种于鲜血脂培养基上，放置药敏纸片，３ ℃温箱中培养１小置７２
为８．８７％。
猪链球菌病流行无明显的季节性，一年四季均可发生，其是重症猪链球菌２型尤
感染爆发时，致病性强，传播迅速，猪病死亡率高。该病同时可通过破损皮肤如伤口或
擦伤传染给人或通过呼吸道感染人，重感染时可引起人严

某市动物性食品中食源性致病菌的分离鉴定和致病性分析

某市动物性食品中食源性致病菌的分离鉴定和致病性分析作者：朱诗语许云飞来源：《食品安全导刊·下》2024年第07期摘要：为了解某市动物性食品中食源性致病菌分布情况及致病性，在2022年8月至2023年3月对猪肉、牛肉、鸡肉、鸭肉4类动物性食品进行食源性致病菌分离鉴定分析工作，并以小白鼠为对象实施致病性分析。

结果显示，牛肉致病菌检出率最高（6.25%），其次是鸭肉与猪肉（5.00%），最后为鸡肉（3.75%）；检测的猪肉、鸡肉、鸭肉、牛肉中均存在沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌；分离出的食源性致病菌致病性较强，其中沙门氏菌致病率为80.00%，金黄色葡萄球菌致病率为83.33%，单增李斯特菌致病率为75.00%。

某市动物性食品中存在食源性致病菌感染情况，且致病性较强，相关部门需要重点加大监测力度，保证动物性食品安全。

关键词：动物性食品；食源性致病菌；分离鉴定；致病性分析Abstract： In order to understand the distribution and pathogenicity of foodborne pathogens in animal food in a certain city， from August 2022 to March 2023， four types of animal food in a certain city， namely pork， beef， chicken， and duck， were isolated， identified， and analyzed for foodborne pathogens， and pathogenicity tests were conducted on mice. The results showed that the detection rate of beef was the highest （6.25%）， followed by duck and pork （5.00%）， and finally chicken （3.75%）; Salmonella， Staphylococcus aureus， and Listeria monocytogenes are present in the detected pork， chicken， duck， and beef foods. The isolated foodborne pathogens have strong pathogenicity， with Salmonella having a pathogenicity rate of 80.00%，Staphylococcus aureus having a pathogenicity rate of 83.33%， and Listeria monocytogenes having a pathogenicity rate of 75.00%. It has been found that there are foodborne pathogenic bacteria infected in animal food in a certain city， and the pathogenicity is strong. Relevant departments need to focus on increasing monitoring efforts to ensure the safety of animal food.Keywords： animal food; foodborne pathogens; isolation and identification; pathogenicity analysis社會经济发展水平不断提升的情况下，人们对食品安全关注度逐渐加大。

猪链球菌生化鉴定

猪链球菌生化鉴定
猪链球菌是一种革兰阳性球菌，通常存在于动物的呼吸道和皮肤上。

在人类中，猪链球菌是一种潜在的致病菌，可以引起多种感染，包括咽炎、脓肿等。

因此，对猪链球菌的生化鉴定具有重要意义。

猪链球菌的生化鉴定是通过对其代谢产物和生物化学特性进行分析来
确定其身份。

这项工作通常需要通过一系列实验来完成，包括对猪链球菌在特定生长条件下的代谢产物进行测试，以及对其特定酶的活性进行检测。

通过这些实验，我们可以确定猪链球菌的特异性生化特性，从而对其进行鉴定。

猪链球菌在生化鉴定中的一个重要特性是其对不同碳源的利用能力。

通过对其在不同碳源培养基上的生长情况进行观察，可以初步判断其代谢途径。

此外，猪链球菌还可以通过产气酶试验、溶血酶试验、尿素酶试验等特定酶的活性检测来进行生化鉴定。

猪链球菌的生化鉴定还包括对其氧气需求、生成物的检测等多个方面
的实验。

通过这些实验，我们可以逐步了解猪链球菌的生物化学特性，从而实现对其准确鉴定。

让我们总结一下本文的重点，我们可以发现，猪链球菌的生化鉴定是
一项复杂而重要的工作。

通过对其代谢产物和生物化学特性进行详细分析，我们可以准确鉴定猪链球菌，并为其后续的研究和临床应用提供基础。

希望
未来能有更多的研究者投入到这一领域，共同探索猪链球菌的生化特性，为其应用研究提供更多的依据。

生化鉴定原理

生化鉴定原理生化鉴定是一种利用生物化学方法对物质进行鉴定和分析的技术。

它主要应用于犯罪现场的物证检验、食品安全监测、药物残留检测等领域。

生化鉴定原理是指在生化鉴定过程中所运用的一系列基本原理和方法。

本文将介绍生化鉴定的基本原理和方法，以帮助读者更好地理解生化鉴定技术。

首先，生化鉴定的基本原理是利用生物体内的生化反应特性来进行鉴定。

生物体内的许多生化反应都是特异的，可以对不同物质产生特定的反应。

通过对这些反应的观察和分析，可以确定物质的成分和性质。

例如，酶的特异性反应可以用于鉴定不同的物质，血液中的酶类物质可以用于检测各种疾病。

另外，生化鉴定还可以利用物质的分子结构和化学性质进行鉴定，例如利用质谱技术对物质进行分析鉴定。

其次，生化鉴定的方法主要包括生物化学分析、免疫学分析和分子生物学分析等。

生物化学分析是利用生物体内的生化反应特性进行鉴定，包括酶活性检测、代谢产物检测等。

免疫学分析是利用生物体内的免疫反应特性进行鉴定，包括抗体检测、免疫印迹等。

分子生物学分析是利用物质的分子结构和化学性质进行鉴定，包括PCR技术、基因测序等。

最后，生化鉴定技术在犯罪侦查、食品安全监测、药物残留检测等领域有着广泛的应用。

在犯罪侦查中，生化鉴定可以用于对犯罪现场的血迹、毒物、尸体等物证进行检验和分析，为案件侦破提供科学依据。

在食品安全监测中，生化鉴定可以用于对食品中的添加剂、农药残留、重金属等有害物质进行检测，保障食品安全。

在药物残留检测中，生化鉴定可以用于对动物组织、食品中的药物残留进行检测，确保食品安全和用药安全。

总之，生化鉴定是一种重要的分析技术，它利用生物化学方法对物质进行鉴定和分析，具有广泛的应用前景。

通过对生化鉴定的基本原理和方法的了解，可以更好地理解生化鉴定技术的工作原理和应用范围，为相关领域的研究和应用提供理论支持。

猪大肠杆菌病病原鉴定及药敏试验

猪大肠杆菌病病原鉴定及药敏试验猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的肠道传染病，主要表现为仔猪黄白痢和水肿病。

随着养猪业规模化发展，该病呈上升趋势，致使仔猪成活率和断乳窝重降低，严重影响了养猪业的发展。

由于致病性大肠杆菌存在广泛的耐药性，而且血清型多，抗原复杂，给防治带来了极大的困难。

针对某猪场提供的腹泻严重的仔猪黄白痢病料，我们进行了细菌分离鉴定和药敏试验，以期为仔猪大肠杆菌病的有效防治提供一些技术参考资料。

1、具体方法（1）病原菌的分离培养：无菌采集具有黄痢、白痢症状的仔猪粪便，接种于麦康凯培养基上，37℃温箱中培养24 小时。

挑取红色中等大小光滑菌落，接种于普通肉汤增菌，置37℃温箱培养16～18小时，然后将培养物分别划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板进行细菌培养，24 小时后挑取平板上可疑菌落抹片染色镜检，后将疑似菌落少许再接种于普通肉汤，供以后试验用。

（2）生化试验：糖发酵、M．R、硫化氢、V-P、吲哚试验等。

③药敏试验：利用庆大霉素、丁胺卡那霉素、头孢噻肟、链霉素、环丙沙星、恩若沙星、红霉素等8种药物按常规纸片法进行。

2、观察结果（1）病原菌的形态：观察到6个疑似菌株在麦康凯琼脂培养16 小时后均为红色菌落，在伊红美蓝琼脂上培养16小时后均为紫黑色带金属光泽的中等大小圆形菌落，革兰氏染色镜检均为革兰氏阴性中等大小杆菌。

（2）生化鉴定：分离的6株细菌都能发酵葡萄糖、麦芽糖和乳糖，并产酸产气；部分菌株不分解蔗糖，不产生硫化氢，吲哚和甲基红试验(M．R)均为阳性，V-P试验为阴性，由此可判定分离菌株为大肠杆菌。

（3）药敏试验：所有分离菌均对丁胺卡那霉素、头孢噻肟、恩若沙星敏感，而对其他药物产生了不同程度的耐药性。

3、结论分析从猪场分离的6株细菌，经培养特性、形态及生化试验试验鉴定，表明均为致病性大肠杆菌。

药敏试验结果表明6株大肠杆菌对丁胺卡那霉素、头孢噻肟、恩若沙星敏感，而对其他药物产生了不同程度的耐药性。

生化鉴别法定义

生化鉴别法定义生化鉴别法定义生化鉴别法是一种通过对生物体内的化学成分进行检测和分析，以确定其身份或品质的方法。

它是一种广泛应用于医学、食品、环境等领域的分析技术，具有高灵敏度、高特异性和高效率的特点。

一、生化鉴别法的基本原理生化鉴别法基于生物体内的化学成分与其特定功能之间的关系，通过检测某些特定的化学成分来确定其身份或品质。

这些化学成分可以是蛋白质、核酸、糖类等有机物，也可以是无机离子和小分子有机物等。

在进行生化鉴别时，需要选取适当的检测方法和仪器设备，如光谱仪、色谱仪、电泳仪等。

二、常见的生化鉴别方法1.免疫学方法：包括ELISA（酶联免疫吸附试验）、西方印迹（Western Blotting）等，主要用于蛋白质和抗原等大分子有机物的检测。

2.色谱法：包括气相色谱（GC）、液相色谱（LC）等，主要用于分离和检测小分子有机物和无机离子等。

3.电泳法：包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、薄层电泳等，主要用于分离和检测蛋白质、核酸等大分子有机物。

4.光谱法：包括紫外-可见光谱、红外光谱、拉曼光谱等，主要用于检测有机物的结构和成分。

三、生化鉴别法的应用领域1.医学领域：生化鉴别法在医学诊断中具有广泛的应用，如血液生化检测、尿液分析、肿瘤标志物检测等。

2.食品领域：生化鉴别法可以用于食品中添加剂、污染物和毒素的检测，以及食品真实性的鉴定。

3.环境领域：生化鉴别法可以用于环境中污染物的检测和监测，如水质监测、大气污染监测等。

四、生化鉴别法的优缺点1.优点：生化鉴别法具有高灵敏度、高特异性、高效率的特点，可以对微量物质进行检测和分析，具有广泛的应用领域。

2.缺点：生化鉴别法需要专业的仪器设备和技术人员，成本较高；同时，由于样品处理和分析过程中可能产生误差，因此需要进行严格的质量控制。

五、结论综上所述，生化鉴别法是一种通过对生物体内的化学成分进行检测和分析，以确定其身份或品质的方法。

它具有广泛的应用领域和优越的性能特点，在医学、食品、环境等领域中发挥着重要作用。

1株绵羊溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及致病性研究

1株绵羊溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及致病性研究溶血性曼氏?U菌（Mannheimia haemolytica，Mh）别称溶血性巴氏杆菌，该菌属于机会致病菌，可长期寄生于牛、绵羊、山羊等反刍动物及其他动物上呼吸道[1-2]。

当受到外界环境骤变、长途运输等刺激出现应激反应，动物机体抵抗力下降，病菌可趁机侵入从而致病，病毒和支原体感染如绵羊肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、副流感病毒等，可使得机体对溶血性曼氏杆菌更易感[3-4]。

它能够引起牛、羊肺炎，新生羔羊的急性败血症，给养牛业和养羊业带来较大的经济损失[5]。

2015年底，安徽宣城某养羊场发生疫情，死亡率达10%以上，发病羊主要表现为咳嗽、喘气、流鼻涕等呼吸道症状，剖检病变主要为肺脏出血、充血、水肿、实变。

从发病羊肺脏中分离出1株菌株，通过生化鉴定和PCR鉴定，确定该分离株为溶血性曼氏杆菌。

1材料与方法1.1主要试剂绵羊鲜血琼脂培养基、微量生化反应管、抗菌药物药敏纸片均购自浙江杭州微生物试剂公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker等均购自北京全氏金生物技术有限公司。

其他试剂均为国产分析纯。

1.2试验动物6～8周龄BALB/c小鼠，购自扬州大学比较医学中心。

1.3病原的分离无菌采集绵羊肺脏组织块接种于鲜血琼脂平板上，培养24 h后，挑取单个菌落进行纯化。

挑取纯化的菌落涂片进行革兰氏染色镜检。

1.4生化试验将纯化的菌落按照常规方法接种于葡萄糖、麦芽糖、甘露醇等生化鉴定管中，置于37 ℃恒温培养箱中培养，观察其生化特性。

1.5PCR鉴定参照Alexander等基于lkt基因设计的溶血性曼氏杆菌特异性引物（LktF：5′-GCAGGAGGTGATTATTAAAGTGG-3′；LktR：CAGCAGTTATTGTCATACCTGAAC）[4]进行PCR扩增，预期扩增片段大小为206 bp。

以纯培养细菌的染色体DNA为模板，PCR反应体系为25 μL：Taq DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板2 μL，引物P1、P2各1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL，无菌水18 μL。

生物致病因子的鉴定和分析

生物致病因子的鉴定和分析生物致病因子（Biological Pathogenic Factors）是指能够导致生物体发生致病性反应的一类因素，包括病原菌、病毒、真菌、寄生虫、细胞毒素、过敏原等。

鉴定和分析这些因子是医学防治疾病的重要环节，也是实验室诊断的基础。

一、鉴定生物致病因子的方法1. 细菌鉴定细菌鉴定是指通过分离纯化、生化测定、药敏试验、免疫学检验等手段，鉴定出所感染的细菌种类。

目前常用的方法有传统的细菌培养、气体色谱技术、质谱分析等方法。

细菌培养是细菌鉴定的基础，常用的包括Blood、MacConkey、Sabouraud、m-FC等培养基，通过菌落数、形态、颜色等特征指导细菌的分类和鉴定。

气体色谱技术是基于细菌的挥发性代谢产物特征，通过检测细菌产生的挥发物来鉴定细菌种类。

质谱分析是基于质量分析的原理，通过测量细菌样品的质量来鉴定细菌的物种。

2. 病毒鉴定病毒鉴定是指通过病毒的生物学特性、形态学结构、核酸序列等手段，鉴定出所感染的病毒种类。

常用的方法有传统的电镜观察、细胞培养、免疫荧光检测、PCR扩增等方法。

电镜观察是病毒鉴定的基础，通过电子显微镜观察病毒颗粒形态、大小、结构等特征，进行初步的病毒鉴定。

细胞培养是指在细胞培养基中培养病毒，通过病毒感染细胞、繁殖、形成细胞病变等特征，鉴定出所感染的病毒种类。

免疫荧光检测是基于抗原-抗体作用原理，通过抗体和荧光标记，检测标记的荧光信号来鉴定病毒。

PCR扩增是指通过核酸扩增技术，扩增出病毒的基因片段，从而鉴定病毒物种。

3. 真菌鉴定真菌鉴定是指通过真菌的形态、解剖、培养特性、生物活性等鉴定手段，鉴定出所感染的真菌种类。

常用的方法有传统的菌落形态观察、显微镜观察、培养鉴定、PCR扩增鉴定等方法。

菌落形态是真菌鉴定的基础，通过菌落外形、颜色、质地等特征，指导真菌的分类和鉴定。

显微镜观察是指通过显微镜观察真菌的形态、位置、颜色等特征，进行真菌鉴定。

培养鉴定是指通过真菌在不同培养基中的特征，如生长速度、芽孢的形态、颜色、培养温度等方面，鉴定真菌种类。

临床致病性真菌鉴定流程

临床致病性真菌鉴定流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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生化鉴定原理

生化鉴定原理生化鉴定是一种通过检测生物体内化学成分来确定其身份或特征的方法。

生化鉴定原理是基于生物体内生化成分的特异性和稳定性，通过对特定生化物质的检测和分析，来进行鉴定和判断。

生化鉴定原理主要包括生化物质的选择、检测方法和数据分析三个方面。

首先，生化鉴定需要选择具有特异性和稳定性的生化物质作为鉴定指标。

这些生化物质可以是生物体内的代谢产物、酶活性物质、蛋白质或其他特定的生化成分。

通过对这些生化物质的检测和分析，可以确定生物体的特征和身份。

在选择生化物质时，需要考虑其在不同生物体中的差异性和特异性，以及其在不同环境条件下的稳定性和可检测性。

其次，生化鉴定需要使用特定的检测方法来对选择的生化物质进行分析。

常用的生化鉴定方法包括色谱法、质谱法、光谱法、电泳法等。

这些方法可以对生化物质的结构、组成和含量进行准确的检测和分析，从而确定生物体的特征和身份。

在使用检测方法时，需要考虑其对生化物质的选择性、灵敏性和准确性，以及对样品的处理和分析过程中可能产生的干扰和误差。

最后，生化鉴定需要对检测得到的数据进行分析和解释。

通过对生化物质的检测结果进行定量或定性分析，可以得出对生物体特征和身份的判断和结论。

在数据分析过程中，需要考虑数据的可靠性和准确性，以及对不同生化物质的检测结果进行综合分析和比对，从而得出科学和可靠的鉴定结论。

总的来说，生化鉴定原理是一种通过选择特定生化物质、使用特定检测方法和进行数据分析来确定生物体特征和身份的方法。

通过对生化鉴定原理的理解和应用，可以在生物学、医学、环境科学等领域进行生物体的鉴定和检测，为科学研究和实际应用提供重要的技术支持。

生化诊断原理

生化诊断原理
生化诊断原理是通过测量和分析生物体内的化学成分和代谢产物，从而确定疾病的诊断和治疗方案。

生化诊断基于生物体内各种生物化学反应的特性和规律，利用特定的试剂和仪器测量和分析血液、尿液、体液等样本中的化学物质和代谢产物的浓度和活性。

生化诊断原理主要包括以下几个方面的内容：
1.生物标志物的选择和测量：生物标志物是指血液、尿液等样
本中特定化学成分的浓度或活性，可以反映出某种疾病的存在、发展和治疗效果。

通过选择合适的生物标志物，并利用各种试剂和仪器进行测量，可以获得诊断疾病所需的信息。

2.生化反应的原理和机制：生物体内的化学反应是生化诊断的
基础。

了解不同疾病和代谢状态下的生化反应特点和机制，可以帮助解释不同生物标志物的变化规律，进而指导疾病的诊断和治疗。

3.试剂和仪器的选择和应用：生化诊断离不开各种试剂和仪器
的使用。

选择合适的试剂和仪器可以提高测量的准确性和灵敏度，提高诊断的可靠性和准确性。

4.数据分析和结果解释：通过对测量结果进行数据分析和统计
处理，可以得出与疾病相关的信息。

结合患者的病史和临床表现，对测量结果进行综合分析和结果解释，可以给出疾病的诊断和治疗建议。

常见致病菌的检测

常见致病菌的检测摘要：近年来食品药品安全的问题屡见不鲜，做好致病菌的检测，是防范于未然的措施，因而显得尤为的重要，也越来越受到人们的重视。

这就要求我们对一些常见的致病菌检测技术的要有一定的了解。

关键词：致病菌，肠球菌，霉菌和酵母菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌。

一.肠球菌（1）、形态与染色【1】肠球菌为革兰阳性（G+）球菌,广泛分布于自然环境及人和动物消化道内。

20世纪80年代以来，肠球菌严重感染的发生率和病死率明显升高，并且由于肠球菌的固有耐药和获得性耐药，使许多常用抗菌药物在治疗肠球菌感染时失败。

因此，从分子水平对肠球菌致病因子、肠球菌引起的感染机制与治疗的研究显得尤为重要。

肠球菌为圆形或椭圆形、呈链状排列的革兰阳性球菌，无芽胞，无鞭毛，为需氧或兼性厌氧菌。

本菌对营养要求较高，在含有血清的培养基上生长良好。

（3）致病性【1】一般而言，肠球菌的毒力不高。

与金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌相比，肠球菌对大多数动物的半数致死量（LD50）值相当高，而且肠球菌很少引起蜂窝织炎和呼吸道感染。

肠球菌只有在宿主组织寄殖，耐机体非特异及免疫防御机制，并引起病理改变，才能导致感染。

粘附测定显示肠球菌可通过细菌表面表达的为粘附素，吸附至肠道、尿路上皮细胞及心脏细胞。

这些粘附素的表达亦受细菌生长环境的影响。

另外，肠球菌可产生一种聚合物质（系一种蛋白表面物质，可聚集供体与受体菌，以利质粒转移），在体外增强其对肾小管上皮细胞的粘附。

细菌生长环境亦影响肠球菌与多形核白细胞反应。

血清中生长的肠球菌与多形核白细胞反应较弱，而肉汤中生长的细菌反应较强。

体外多形核白细胞对肠球菌的有效杀灭作用需血清补体蛋白参与，而抗肠球菌抗体可增强该作用。

（4）、肠球菌属主要检测步骤如下：【2】方法一：肠球菌平板计数法检验程序25g (mL) + 225 mL 缓冲蛋白胨水↓10 倍梯度稀释↓选择2 个~3 个适宜连续稀释度，各取1 mL 分别加入灭菌培养皿↙↘KF琼脂36℃士1℃ 48h 士2h肠球菌琼脂35℃士2℃ 24h士2h↘↙确证实验↓肠球菌阳性↓菌落计数及计算↓报告结果方法二：肠球菌最近似值（MPN ）测定法检验程序25g（mL ) + 225 mL 缓冲蛋白胨水↓10 倍梯度稀释↓选择3 个适宜连续稀释度，各取1 ml 分别加入肉汤中↙↘叠氮化钠葡萄糖肉汤管肠球菌肉汤管37℃士1℃ ,24h~48h 35C 士2 ℃ 24h 士2h↓↓↓↓无混浊混浊变黑不变黑↓↓↓↓肠球菌阴性确证实验确证实验肠球菌阴性↓↓肠球菌阳性肠球菌阳性↘↙MPN 值法报告肠球菌数／g(mI)二．霉菌和酵母菌（1）、形态【1】酵母菌是单细胞真核微生物。