时间分辨荧光分析法 - 副本
时间分辨荧光技术
时间分辨荧光技术时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
（一）TRFIA分析原理在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。
大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。
时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。
荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。
但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。
因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。
解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。
但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。
不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法医学教|育网搜集整理。
平时常用的稀土金属主要是Eu（铕）和Tb（铽），Eu荧光寿命1ms，在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。
（二）时间分辨信号原理普通物质荧光光谱分为激发光谱和发射光谱，在选择荧光物质作为标记物时，必须考虑激发光谱和发射光谱之间的波长差，即Stakes位移的大小。
时间分辨荧光免疫分析技术
1984年， Hemmila确定了DELFIA(Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay)这种时间分辨免疫分析技术方案,从而使DELFIA成 为Wallac的专利技术
国外仪器（Wallac公司<PerkinElmer>） 国内其他公司生产的仪器(上海新波、广州丰华等) 达瑞抗体公司自主研发的仪器及软件（DR-M6601）
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Wallac AutoDELFIA 1235
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半自动 VICTOR2 1420
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时间分辨荧光免疫分析技术
达瑞抗体
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标记免疫学分析技术发展历程
免疫荧光分析(Coons, 1941) 放射免疫分析(Berson和Yalow, 1960) 酶免ELISA (Engvall, 1971) 金标免疫分析(Faulk和Taylor, 1971) 化学发光免疫分析(Arakawa， 1977) 时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979) 电化学发光免疫分析(Leland, 1990) 液相芯片(美国Luminex公司, 1997)
小分子抗原竞争抑制示意图
固相包被二抗 + 一抗
孵育
+
+
孵育 Eu
待测抗原
铕标抗原
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时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)操作
时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)是在荧光分析的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。
它利用具有长效荧光的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）作标记物，充分利用激发光与发射光之间的降移与发射光较长的半寿期，在激发光后延时测量发射光的强度。
从而所测的荧光不受激发光和被检物中的非特异荧光干扰，提高了检测的特异性与灵敏度。
在激发光后延时400微秒，测量400微秒，间歇200微秒后进入下一个测量周期，每一个周期为1000微秒。
对每一个样品实施1秒钟的测量，意味着完成了1000个周期的测量，测量精确度极高。
（一）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪开/关程序1 开机1.1 依次打开样品处理器电源，微孔板处理器电源，打印机电源。
1.2 打开计算机显示器。
1.3 启动计算机。
1.4 运行系统软件：Auto DELFIA与Multicalc系统软件在Windows启动后自动运行。
Auto DELFIA workstation软件用于控制Auto DELFIA的运行，MultiCalc的主要功能是与主机通讯，对测试结果进行评估和对质控及其他数据处理（可通过双击屏幕上图标不运行）。
在MultiCalc Auto DELFIA环境下，只有键盘有效，鼠标无效。
2 开机后准备1.1 清洗液准备1.1.1 微孔板处理器洗液（250ml浓缩液＋600ml去离子水混合），每做一块板至少1升用量，洗液在密闭条件可保存2周时间。
1.1.2 准备样品处理器洗液（50ml浓缩液＋5000ml去离子水混合），每做一块板至少需要800ml洗液，洗液在密闭条件下可保存1周时间。
1.2 样品处理器准备1.2.1 在Wash bottle（清洗液瓶）、Rinse bottle (冲洗液瓶)分别注入足够用量的清洗液和去离子水，倒空废液瓶。
拧紧各瓶盖，确保废液瓶管路向下。
1.2.2 如样品需要稀释，放入稀释杯和稀释液。
时间分辨荧光免疫层析技术简介
• 测向流层析 • 垂直流层析（渗滤法）
免疫层析技术原理
侧向流层析
• 固定相：固定有检测线和控制线的纤维层析材料（NC膜） • 流动相：测试液 • 移动：毛细作用 • 结合：游离态待测物在固相捕获线处发生特异性免疫反应
图1 典型侧向流免疫层析试纸条构造（来源：Merck Estapor）
时间分辨荧光免疫层析技术简介
主要内容
1
免疫层析技术原理
2
免工疫作问标题记机材解决料方介案绍
3
时间分辨荧光分析法
4
应用实例
免疫层析技术原理
免疫层析技术是建立在层析技术和抗原-抗体特异性免疫反应基础上的一 项新兴免疫检测技术。
发展阶段：
• 初期：定性检测 • 新阶段：半定量、定量检测（信号放大、信号转换）
• 荧光寿命(Fluorescence lifetime)：荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度所用的 时间。
• 荧光猝灭(Fluorescence quenching)：荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、高温、 某些硝基化合物、重氮化合物、重金属、卤素阴离子等）的作用下，激发态分子的电子不能 回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射，从而导致荧光减弱甚至消退的现象。引 起荧光猝灭的物质称为猝灭剂，常用于消除不需要的荧光。
表1 几种常见的荧光物质
荧光物质
最大吸收光谱
异硫氰酸荧光素 (FITC)
490～495nm
四乙基罗丹明 (RB200) 四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC) 藻红蛋白（PE） 7-氨基-4-甲基香豆素
570～575nm 550nm 490-560nm 354nm
Alexa Fluor、CF Dye等新一代荧光染料系列 多种区段供选
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五、时间分辨荧光分析法在真菌 毒素检测方 膝关节周围滑膜囊的分布 面的应用 1.真菌霉素概述
真菌毒素是由产毒真菌( 主要为曲霉属、 青霉属及镰孢属) 在适宜的环境条件下产生 的具有很强毒性的二级代谢产物，它主要对 食品、农作物及饲料等污染很严重。
1.2 稀有元素双功能螯合剂 膝关节周围滑膜囊的布
稀土元素作为金属离子,很难直接与抗原抗 体结合,因此在标记时需要有一种双功能基 团的螯合物,它们分子内或带氨基和羧基或 带有异硫氰酸基和羧酸基,一端与稀土离子 连接,一端与抗原或抗体的自由氨基(组氨酸、 酪氨酸) 连接。
1.3 增强溶液
免疫反应后所形成的复合物,在弱碱性缓冲 液中经紫外光激发所产生的荧光信号甚弱, 这主要是因为水是稀土离子经紫外光激发所
二、时间分辨荧光分析法基本原 膝关节周围滑膜囊的分布 理与优点
1.原理
TRFIA 是用镧系金属离子作为示踪物标 记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或 生物活性细胞,与其螯合剂、增强液(有一部分 不需要) 在待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、 生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶 细胞与效应细胞的杀伤反应等) 发生反应后, 用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强
膝关节周围滑膜囊的分布 四、时间分辨荧光分析法的应用
1.在免疫学的应用 1.1 测定细胞因子:细胞因子不仅仅参与免疫应 答反应,而且在肿瘤、炎症发生和发展过程 中起重要作用。因此,准确测定细胞因子含 量,对于了解它们病理生理作用是十分重要
的。
1.2 测定补体:补体成分在多种自身免疫性疾病
膝关节周围滑膜囊的分布 2.在微生物方面的应用
膝关节周围滑膜囊的分布 三、时间分辨荧光分析技术简介
TRFIA的基础试剂包括示踪剂、稀有元素双 功能螯合剂、 分析缓冲液、增强溶液。 基本技术包括包被技术、标记技术、反应 模式。
时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析(time-reso1vedfIuoroimmunoassay,TRFIA)是80年代初问世的一种超灵敏度的标记免疫检测技术。
其主要特点是以锢系元素铺(Eu3υ等标记抗体或抗原为示踪剂，利用增强液的荧光放大作用和时间分辨荧光法排除样品或试剂中非特异性荧光物质的干扰，最大限度地提高了检测方法的灵敏度和特异性，还具有量程宽,操作简便,标记物容易制备，稳定性好，保存期长等诸多优点。
一、基本原理与放免分析相似，总体上分为竞争法和非竞争法两类，前者多用于小分子半抗原，后者用于大分子化合物。
铺系元素第(Eu).彭(Sn1)、轼(Tb)和钛(Nd)通过双功能螯合剂，在水溶液中很容易与抗原或抗体分子以共价双键结合。
经抗原、抗体间特异性的免疫结合反应，测定免疫复合物的荧光强度，就可推算待测物质的浓度。
辆系离子的荧光信号极弱，需要在酸性条件下，解离出铺系离子，然后与荧光增强液中的B-二酮体生成新的螯合物，经紫外光激发可产生强而持久的荧光信号，其增强效力可达100万倍，故又称解离增强铺系荧光免疫分析(dissociation-enhanced-1anthanidefIuoroimmunoassay,DE1FIA)o锢系元素的发光时间延长，如Eu*和Snr的荧光衰变时间分别达到 4.3×IOns和4.1×10,ns,而样品和试剂中的自然本底荧光的衰变时间仅为4-10ns,通过延迟测量时间，使信号不受本底荧光影响。
此外，锢系元素螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，StOkeS位移大，有利于排除非特异性散射光的干扰，进一步提高荧光信号的特异性。
二、试剂组成(一)EuS标记物：可分为标记抗体、标记抗原，要求有较高的纯度、比活性和免疫活性。
密封后4。
C或-20。
C保存，但应避免反复冻融。
若发现蛋白质聚合，非特异性结合升高，则应停止使用。
(二)固相抗体或抗原：固相载体多用聚苯乙烯微孔条，要求透明度高，吸附性能好，材质均匀，孔间差异小，不同品牌甚至不同批号的微孔条间都会有明显的性能差异，应引起注意。
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L 板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
时间分辩荧光分析法1铕荧光检测法标记靶细胞中国试剂网
细胞介导细胞毒作用检测法4：时间分辩荧光分析法1）铕荧光检测法标记靶细胞1．EuCl3的制备：称取58.08mg Eu2O3，用少量1N HCl搅拌至溶解，再用1N NaOH 调节pH至4.0。
加双蒸水配成33～100mmol/L的保存液，4℃保存备用。
2．用预冷的标记液将靶细胞浓度调整到5×106/ml，加50μl 10mg/ml硫酸葡聚糖，置冰浴中20分钟，其间摇晃数次。
3．加入30μl 100mmol/L CaCl2溶液终止反应5分钟。
4．用含2mmol/L CaCl2的RPMI-1640培养液洗涤细胞5次。
用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将靶细胞配成5×104/ml。
检测方法1．在96孔圆底细胞培养板中加入靶细胞悬液，每孔加100μl。
2．向各孔加100μl效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例根据要求而定，通常为5：1～20：1。
自然释放孔不加效应细胞只加100μl培养液，最大释放孔中加100μl 0.5％Triton X-100。
每个实验置三个复孔。
3．置37℃5％CO2的二氧化碳培养箱中培养3小时。
4．从每孔吸出20μl上清液，对应加入另一块96孔酶标板中，向第二块板每孔加200μl增强液。
室温中混合5分钟。
在时间分辩荧光分析仪上测定各孔的荧光强度。
同时做EuCl3的标准曲线：用0.05mol/L pH7.0柠檬酸缓冲液配制10倍梯度5．特异性杀伤活性计算：杀伤活性（％）＝[（实验组荧光强度－自然释放组荧光强度）/（最大释放组荧光强度－自然释放组荧光强度）]×100％2）用时间分辩荧光检测法同时检测NK细胞对三种靶细胞的细胞毒性标记靶细胞1．取107靶细胞，用洗涤液（含93mmol/L NaCl, 5mmol/L KCl和2mmol/L MgCl2的50mmol/L pH7.4 Hepes，双蒸水配制）洗涤一次。
小心吸去上清液，用1ml 标记液（洗涤液中加0.5mg/ml磷酸葡聚糖和0.06mmol/L Eu3+或2mmol/L Sm3+或0.2mol/L Tb3+，以及比镧系离子浓度高5倍的DTPA）悬浮细胞。
时间分辨荧光分析技术的应用研究
时间分辨荧光分析技术的应用研究时间分辨荧光分析技术是一种基于表面增强荧光技术，结合时间分辨检测和分析的新型荧光分析方法。
其应用涉及化学、生物学、环境监测等多个领域，具有快速、灵敏、高通量等优点。
本文将从时间分辨荧光分析技术的原理和应用角度，探究其在不同领域的应用及前景。
一、技术原理时间分辨荧光分析技术通过对荧光信号的时间分辨和分析，可以得到更全面、准确的研究结果。
其基本原理为：通过引入表面增强荧光剂和金属纳米颗粒等材料，使样品在激发光作用下，发出强烈的荧光信号。
荧光信号在不同的材料表面上，会受到扩散、共振能量转移等影响，产生不同的荧光寿命和谱型。
利用时间分辨荧光分析仪，可以通过研究荧光信号的寿命和谱型，快速有效地分析样品中目标物质的数量、分子结构、反应速率等参数。
二、应用领域2.1 生物学在细胞研究领域，时间分辨荧光分析技术是一种重要的荧光探针和成像工具。
例如，可以通过合成表面增强荧光生物传感器，对等离子体膜上的酶活性、蛋白质结构、细胞内钙离子转运等生物过程进行实时监测和成像。
此外，时间分辨荧光分析技术还可以用于研究荧光标记的生物分子在细胞内部的传递、吸附、反应等过程，为研究基因组学、蛋白质组学等提供了有力的工具。
2.2 化学领域在化学反应动力学研究领域，时间分辨荧光分析技术主要应用于研究化学反应过程中的荧光衰减动力学和反应速率等参数。
例如，利用荧光探针技术，可以对物质分子之间的共振能量转移、酸碱中性化反应、阳离子络合反应等化学反应进行实时监测和定量分析。
此外，时间分辨荧光分析技术还可以用于生化传感器、化学传感器等相关领域的研究。
2.3 环境监测和安全领域在环境监测领域，时间分辨荧光分析技术常用于检测水质中的重金属、污染物等有害成分。
例如，利用荧光标记技术，可以对水中的难降解有机物、重金属等污染物进行定量检测和分析，并快速地监测水质的污染程度。
在安全领域中，时间分辨荧光分析技术还可以用于爆炸物质检测、生化武器检测等方面，具有很强的应用前景。
时间分辨荧光分析技术
1.1 时间分辨荧光分析技术时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的，自1978年提出以来[1]，已广泛的应用于免疫分析、核酸测定、荧光显微镜成像、细胞识别、单细胞原位测定、生物芯片等生化领域，并发展出了相应的时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA 杂交测定法、时间分辨荧光显微镜成像测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法等分支。
本节主要对稀土荧光配合物的发光机理、荧光性质，时间分辨荧光测定的原理，时间分辨荧光免疫分析技术，时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展等加以介绍。
1.1.1 稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质稀土元素指的是元素周期表中IIIB 族的镧系元素以及钪和钇，共17种元素。
其中镧系元素的外层电子结构为4f 0-145d 0-106s 1-2，由于5s 和5p 电子对4f 电子的屏蔽作用，导致这些金属及其离子的性质十分相似。
图1.1给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能级图[2]。
1020152530355E N E R G Y ,103c m -16H 5/2G 5/26H 15/27F 0F 2D 05D17F 6F 545D313/249/2Sm 3+Eu 3+Tb 3+Dy 3+H 9/2图1.1 部分三价稀土离子的电子能级图Fig. 1.1 Electronic energy levels of certain lanthanide(III) ions大部分稀土离子本身是不具有荧光性质的，只有Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光。
当Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增强，这种发光是基于配合物由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的[3-8]。
以铕(III)配合物为例，其荧光发光机理如图1.2所示[9]，包括三线态发光机理和单线态发光机理。
时间分辨荧光免疫技术
食品安全检测
兽药残留检测
该技术可用于检测动物性食品中的兽药残留，如抗生素、激素等，保障消费者健 康和食品安全。
非法添加物检测
可用于检测食品中的非法添加物，如瘦肉精、苏丹红等，保障消费者健康和食品 安全。
环境监测
水质监测
时间分辨荧光免疫技术可用于检测水体中的有害物质，如重金属、有机污染物等，为环境保护提供技 术支持。
技术应用领域
临床医学领域
传染病检测
时间分辨荧光免疫技术可用于 检测乙肝、丙肝、艾滋病等传 染病病毒的抗原和抗体，有助
于早期发现和预防传染病。
肿瘤标志物检测
该技术可用于检测肿瘤标志物，如 癌胚抗原、甲胎蛋白等，有助于肿 瘤的早期发现和预后评估。
免疫系统疾病检测
时间分辨荧光免疫技术还可用于检 测自身免疫性疾病、风湿病、红斑 狼疮等免疫系统疾病的相关抗体。
02
在过去的几十年中，TRFIA技术不断取得突破，如采用纳米材料增强荧光信号 、开发多通道TRFIA等方法，使其在灵敏度、特异性、分析速度等方面得到了 显著提升。
03
目前，TRFIA技术已经广泛应用于临床检验、生物分析、环境监测等领域，成 为一种重要的分析工具。未来，随着技术的不断进步和应用领域的拓展， TRFIA技术有望在更多领域发挥重要作用。
总结词
实时、在线、预警。
详细描述
时间分辨荧光免疫技术还可应用于环境污染物监测， 如水体、土壤和空气中的有害物质监测。该技术能够 实时、在线检测环境中的污染物，及时发出预警，为 环境保护和治理提供科学依据。通过该技术的应用， 能够有效地保护环境和人类健康。
THANKS
感谢观看
Hale Waihona Puke 未来发展趋势与前景随着科学技术的不断进步和生物医学领域的需求不断增长，时间分辨荧光免疫技术将继续得到发展和完善。未来 ，该技术将进一步向着高灵敏度、高特异性、高准确性和低成本的方向发展，以适应更多样化的应用场景和更广 泛的临床需求。此外，随着人工智能和大数据等技术的快速发展，时间分辨荧光免疫技术有望与这些技术相结合 ，实现自动化、智能化和远程化的检测和分析，进一步提高检测效率和精度。
时间分辨荧光免疫分析技术基本原理及应用
自动化程度高
该技术可以实现自动化检测， 提高检测效率，减少人为误 差。
技术挑战
标记物稳定性
荧光标记物的稳定性对检测结果 的准确性影响较大，需要保证标
记物在长时间内保持稳定。
仪器成本
时间分辨荧光免疫分析技术需要使 用特定的荧光检测仪器，仪器成本 较高，限制了该技术的普及应用。
操作复杂度
相对于其他免疫分析技术，时间分 辨荧光免疫分析技术的操作较为复 杂，需要专业人员进行操作和维护。
临床诊断
临床诊断
时间分辨荧光免疫分析技术可用于临床诊断，特别是对肿瘤、传染病、内分泌等疾病进 行检测和诊断。通过检测患者体内的特异性抗体或抗原，实现对疾病的早期发现和准确
诊断。
临床诊断的应用
时间分辨荧光免疫分析技术具有高灵敏度、高特异性和低背景干扰等优点，在临床实践 中得到广泛应用。它可用于检测肿瘤标志物、病毒抗体、激素水平等，为医生提供准确
02
时间分辨荧光免疫分析技术基本原理
荧光物质
荧光物质
荧光物质是时间分辨荧光免疫分析中的关键成分，通常是一些具有较长荧光寿 命的稀土金属离子或螯合物。这些荧光物质在特定波长的光激发下，能够发射 出波长较长、持续时间较长的荧光信号。
荧光物质选择
选择适当的荧光物质是时间分辨荧光免疫分析技术的关键，需要考虑到荧光的 稳定性、特异性、灵敏度以及与抗原或抗体的结合能力等因素。
可靠的诊断依据。
环境监测
环境监测
时间分辨荧光免疫分析技术也可应用于 环境监测，如水质检测、空气质量监测 等。通过标记环境中的有害物质或污染 物，利用荧光信号的发射和检测，实现 对环境质量的实时监控和评估。
VS
环境监测的应用
时间分辨荧光免疫分析技术可用于检测水 中的重金属离子、有毒有机物、细菌和病 毒等，以及空气中的有害气体和颗粒物。 这有助于及时发现环境污染问题，保障公 众健康和生态安全。
时间分辨荧光免疫分析
常见荧光物质荧光寿命
荧光物质 Eu3+ 非特异性荧光背景 人血清白蛋白 人球蛋白、血红蛋白 细胞色素C FITC 丹磺酰氯 苯胺萘磺酸 荧光寿命 714 μs 1-10 ns 4.1 ns 3.0 ns 3.5 ns 4.5 ns 14 ns 16 ns
稀土螯合物
104 -106 ns
2. Stokes位移大
• APC：别藻蓝蛋白，最大发射665nm，受 体 • 能量转移效率最高的供体/受体对
时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图
三、时间分辨免疫分析方法
• 夹心法
• 竞争法
• 间接法
• 捕获法
• 生物素-亲和素放大法
1. 夹心法
双抗体夹心法
双抗原夹心法
2. 竞争法
3. 间接法
间接法测定HCV抗体
5-2时间分辨荧光免疫分析
发展历程
• 1979年，可标记抗体的Eu3+-β-二酮体-EDTA
• 1983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测
定HCG和磷酸酯酶A
• “镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配 套研究”获2003年度国家科技进步二等奖
一、时间分辨荧光免疫分析特点
1.荧光衰减时间长
镧系元素荧光衰变时间
镧系元素发射峰窄
优点
• 灵敏度高（10-18mol/孔）
• 原子标记 • 多标记技术
二、时间分辨荧光免疫分析体系
• 非均相时间分辨荧光免疫分析
• 均相时间分辨荧光免疫分析
（一）非均相时间分辨荧光免疫分析
• 时间分辨固相免疫分析
• 解离增强荧光免疫分析 • 酶放大免疫分析
1.时间分辨固相免疫分析
• 向靶细胞中加入效应细胞（NK细胞），孵 育，离心，测上清荧光 • 计算比释放率（%）
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二、时间分辨荧光分析法基本原 理与优点
1.原理
TRFIA 是用镧系金属离子作为示踪物 标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针 或生物活性细胞,与其螯合剂、增强液(有一部 分不需要) 在待反应体系(如:抗原抗体免疫反 应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、 靶细胞与效应细胞的杀伤反应等) 发生反应后, 用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强
2.物质分子吸收光子能量而被激发，然后 从激发态的最低振动能级返回到基态时所 发射出的光称为荧光(fluorescence)。
• 5.时间分辨荧光分析法（Time resolved fluoroisnmuno assay,TRFIA）
• 是近十年发展起来的非同位素免疫分析技 术，是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏 度高达10-19g/ml，较放射免疫分析（RIA） 高出3个数量级。它用镧系元素标记抗原或 抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点， 用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长
四、时间分辨荧光分析法的应用
1.在免疫学的应用 1.1 测定细胞因子:细胞因子不仅仅参与免疫
应答反应,而且在肿瘤、炎症发生和发展过 程中起重要作用。因此,准确测定细胞因子 含量,对于了解它们病理生理作用是十分重 要的。 1.2 测定补体:补体成分在多种自身免疫性疾
2.在微生物方面的应用 由于TRFIA的方法灵敏度高,在1979年它
1.2 稀有元素双功能螯合剂
稀土元素作为金属离子,很难直接与抗原 抗体结合,因此在标记时需要有一种双功能 基团的螯合物,它们分子内或带氨基和羧基 或带有异硫氰酸基和羧酸基,一端与稀土离 子连接,一端与抗原或抗体的自由氨基(组氨 酸、酪氨酸) 连接。
1.3 增强Biblioteka 液免疫反应后所形成的复合物,在弱碱性缓 冲液中经紫外光激发所产生的荧光信号甚弱, 这主要是因为水是稀土离子经紫外光激发所
五、时间分辨荧光分析法在真菌 毒素检测方
1.真菌霉素概述 面的应用
真菌毒素是由产毒真菌( 主要为曲霉属、 青霉属及镰孢属) 在适宜的环境条件下产生 的具有很强毒性的二级代谢产物，它主要对 食品、农作物及饲料等污染很严重。
当前，最主要的真菌毒素主要有: 黄曲霉 毒素、赭曲霉毒素、伏马菌素、T-2 毒素、 展青霉素、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌 烯醇等。
2.基本技术：
2.1 包被技术
TRFIA包被技术,是保持其灵敏度重要因素, 因此在包被抗体之前,往往要对抗体进行纯 化,以提高抗体的包被量和均一性。国内外 最早的使用的包被的缓冲体系为pH9.6的碳 酸盐缓冲液,90年代后改为柠檬酸缓冲液,pH 为4.5 ,效果明显优于碳酸盐缓冲系统。
2.2 标记技术
时间分辨荧光免疫原理图
2.优点
• TRFIA 技术具有酶标记分析技术和同位素 标记技术的优点: 具有灵敏度高、特异性强、 稳定性好，且测定范围宽，试剂寿命长， 操作简便和非放射性等特点：
• 镧系离子与螯合剂形成螯合物后，Stokes 位移能够达到 200 nm 以上，很容易分辨激 发光和发射光，从而激发光干扰就可以排 除。
hCG;血清中的甲状腺激素;国外还用它检测 动物的激素;
TRFIA分析血清、EDTA抗凝血浆和柠檬 酸钠抗凝血浆激素含量差别,发现只有在分 析促甲状腺激素(TSH)、胰岛素 (Ins)、TT3、 雌二醇 (E2)、Testo (睾酮) 和Prog(孕酮) 时 柠檬酸钠抗凝血浆与血清有差别。
现在TRFIA已经取代RIA、EIA等方法,检
2.真菌毒素的测定方法
• 目前，真菌毒素的测定方法有 TLC 法、 HPLC 法等，这些方法都不同程度地存在着 样品前处理过程复杂、毒性大、所需时间长 等缺点。由于其他荧光物质、色素、结构类 似物对检测产生干扰，必须通过液-液萃取 进行净化处理，操作烦琐，有机试剂用量大， 提取效率低，环境污染严重。
抗原或抗体标记时,铕离子首先要作为标 记物标记到抗原或抗体上。标记时不同蛋白 质的反应性依赖于蛋白表面的游离氨基酸数 目和蛋白质特异等电点。一般来说,游离氨
2.3 反应模式 常用的有双位点夹心法和固相 抗体竞争法。
2.3.1 双位点夹心分析法使用针对被测物上不 同抗原决定簇的两个单克隆抗体,一个用Eu3 +标记,另一个包被固相载体,经过免疫反应形 成免疫复合物后,再将Eu3 +从复合物上完全 解离下来,在Eu3 +的增强液中与另一种螯合 剂结合,在协同剂的作用下,形成一个Eu3 +包 裹于其内部的微胶囊(胶态分子团) 。它在激 发光作用下能发射出很强的荧光信号,其强 弱与待测抗原(或抗体) 含量相关。该法用于 测定蛋白质类大分子化合物。
• 镧系元素与通常的荧光物质相比较，镧系
三、时间分辨荧光分析技术简介
• TRFIA的基础试剂包括示踪剂、稀有元素 双功能螯合剂、
分析缓冲液、增强溶液。
• 基本技术包括包被技术、标记技术、反应 模式。
1.基础试剂：
1.1示踪剂的选择 所使用的稀土元素主要位于元素周期表中
的 ⅢB族,包括钪(scandium,SC)、钇 (yttrium , Y)和镧系元素。到目前为止,只有 铕(europium , Eu)、铽(terbium ,Tb)、钐 (samarium ,Sm)、钕 (neodymium ,Nd)、 镝 (dysprosium ,Dy)等5种被用作TRFIA示
的理论形成后, 研究重点放在试剂开发和利用上；
1982年研制出用于测定风疹病毒抗体 TRFIA的试剂； 1986年开创快速诊断流感的TRFIA方法； 2002年有关于同时检测弓形体IgM和IgA抗 体TRFIA方法. 3.分子生物学的应用
标记的链霉亲合素2生物素探针,则会使核
4.在激素方面的应用 用TRFIA检测人血清胰岛素含量;检测了
时间分辨荧光分析法及其应用
目录
• 一、时间分辨荧光分析法的基本概念 • 二、时间分辨荧光分析法基本原理与优点 • 三、时间分辨荧光分析技术简介 • 四、时间分辨荧光分析法的应用 • 五、时间分辨荧光免疫分析技术在真菌毒素检测
方面的应用 • 六、展望
一、基本概念：
1.有些物质受到光的照射时，除吸收某种 波长的光之外还会发射出波长相同或比吸 收波长更长和的光，这种现象称为光致发 光。最常见的光致发光现象是荧光和磷光。