双倒数作图法测米氏常数
蔗糖酶米氏常数的测定
精选ppt
5
【操作步骤】 1．葡萄糖标准曲线的制定
精选ppt
6
2．底物浓度和初速度υ测定
① 取试管8支编号，按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分别加入试管，
于37℃水浴中保温10min。一定量酶液同一水浴中保温约10min。
② 于各管中依次按同样间隔(0.5min)加入已保温过的酶液1.0mL，
计时，立即摇匀，在37℃中准确温浴5min。
③ 按同样次序和时间间隔，加入1mL 0.5mol/L NaOH，摇匀，终止
为横坐标，以1/v为纵坐标作图，绘出一条直线，外推至
横轴相交，横轴截距即为-1精/选Kppmt 。
1
v
VMAX
1/2VMAX
Vmax•[S] V=
Km + [S]
Km
底物浓度与反应速度关系曲线
精选ppt
[S]
2
精选ppt
3
还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应：
精选ppt
4
【仪器与试剂】
反应。
④ 吸取反应物1.0mL，加入盛有3.0mL 3，5-二硝基水杨酸试剂和
1.0mL水的试管中混匀，放入沸水浴中加热5min，冷却后稀释至
25mL，摇匀，在540nm比色测定A值。
⑤ 以A值对应的葡萄糖量为相对反应速度，以1/[S]为横坐标，1/v
为纵坐标作图，由图求出Km精值选p。pt
7
反应物
生物化学实验问答题
8.双倒数法测定米氏常数的实验中，决定实验成败的因数有哪些？
答：1）实验应在初速度时间范围内进行；2)配置不同浓度的底物溶液浓度时应该用同一母液进行稀释，以保证底物浓度的准确性；3）各种试剂的加入时间，加入量应非常精确；4）要严格控制酶促反应时间做到准确无误；5）要将酶液稀释到恰当的浓度；6）作图要准确。
1.为什么提取酶液应该在0-4°C下进行？测定酶活力时为什么要在40-45°C条件下水解淀粉？
答：应为在0-4°C环境下酶能保持其活性。因为酶的最适温度区间是40-45°C，此时酶的活性最高，测得的酶活力是真正的酶活力。
2.小麦萌发过程中淀粉酶活性升高的原因和意义是什么？
答：温度与空气湿度使酶活力上升。意义：种子萌发产生酶使淀粉水解产生葡萄糖提供能量。
9.测定酶活力应该在酶促反应进程曲线的哪段时间范围内进行？为什么？
答：在初速度范围内进行。因为此时酶表现出最大活力，最能反映出酶的最大活力。
10.空白管中为什么最后才加酶液？你还可以设计出另一种空白管吗？
答：避免酶催化底物反应生成产物。可以先加酶液，再加Na2CO3（aq）,Folin-酚稀释溶液，最后再加磷酸苯二纳溶液。
答：说明其反应速率不断减慢。原因：1）随时间增加，酶活力降低。2）底物的量不断减少，减慢反应速率。3）产物浓度增加导致其反应增大。
6.加入Na2CO3的作用什么？
答：1）酶活力失去活性终止反应。2)为后面显色反应营造碱性环境。
7.为什么要用双倒数作图法而不是直接用米氏曲线来求米氏常数？
答：1）用米氏曲线作图所得Vmax为近似值，所得的Km为近似值不够准确。用双倒数做法作图可以准确计算出Vmax和Km的值；2取消其它试剂对实验结果的影响。
米氏常数测定(精)
COOCH2 NHCH2OH
HCHO
COOCH2 NH(CH2OH)2
试剂器材
试剂
1. 10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）： 四种不同［S］的酪蛋白标准溶液。 2. 中性甲醛溶液：75mL分析纯甲 醛加15mL 0.25%酚酞乙醇溶液， 以0.1M NaOH滴至微红，密闭于 玻璃瓶中。（自己配制） 3. 0.25%酚酞乙醇溶液： 4. 标准0.1M NaOH溶液。 5.胰蛋白酶溶液（已配好）
液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。
利用上述结果，以1/v对1/[s]作图，即求出V与 Km值。
注意事项
（1 ）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种， 如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速 逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研 究酶的活力以酶促反应的初速度为准。
此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底 物浓度 之间的定量关系。
双倒数作图法测定Km值： 1 Km 1 1 v V [S] V
胰蛋白酶的性质 胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精 氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解， 产生自由氨基端。
氨基的测定
甲醛滴定法
COOCH2 NH2
HCHO
实验十六
底物浓度对酶促反应速度的影响 ——米氏常数的测定
目的要求
（1）了解底物浓度对酶促反应的影响。
（2）掌握测定米氏常数Km的原理和方法
实验原理
Km定义： Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时 所对应的底物浓度。
Km的意义
Km是酶的特性常数之一，不同的酶Km值不同，同
一种酶与不同底物反应Km值也不同。
Lineweaver-Burk 双倒数作图
米氏方程（Michaelis-Menten Equation）或米曼氏动力学（Michaelis-Menten kinetics）是由Leonor Michaelis和Maud Menten 在1913年提出，是酶学中极为重要的可以描述多种非变异构酶动力学现象、表示一个酶促反应的起始速度V（有些资料中也称为V o）与底物浓度[S]关系的速度方的方程，米氏方程形式如下：
其中，Vmax表示酶被底物饱和时的反应速度，Km值称为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。
在酶促反应中，底物情况在低浓度下，反应相对于底物是一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度[S]逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。
下图为米氏方程的模拟
作图：
酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测定有多种方法。
比如固定反应中的酶浓度，然后测试几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得Km和Vmax值。
但直接从起始速度对底物浓度的图中确定Km 或Vmax值是很困难的，因为曲线接近Vmax时是个渐进过程。
因此，通常情况下，我们都是通过米氏方程的双倒数形式来测定，即Lineweaver-Burk plot，也可称为双倒数方程(double-reciprocal plot)：
将1/V 对1/[S]作图，即可得到一条直线，该直线在Y轴的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为1/Km的绝对值。
示意图如下：。
基础生物化学实验-米氏常数Km
0.4
-1/Km
0.2
1/Vmax
0.0 -4 -2 0 2 4
-1
6பைடு நூலகம்
8
10
1/[S](1/m m ol.L )
实验器材
1、37℃恒温水浴 2、量筒 3、三角瓶 4、碱式滴定管（注意：排尽管内气泡） 5、试管
试剂
1．5% 酪蛋白溶液（pH8.5） 2．4%胰蛋白酶溶液 3．甲醛溶液 (自己稀释) 4．酚酞 5．0.1N NaOH（自己稀释）
注意事项
1、甲醛要稀释 2、酶促反应的时间要精确控制 3、滴定过程中要不断晃动锥形瓶 4、滴定终点的判断：30s内不褪色可视为稳 定。
操作
1、用配好的5%的酪蛋白原液配制7个浓度的酪蛋白 2、4%胰蛋白酶及酪蛋白37℃保温10min 3、取7个三角瓶，每个三角瓶加入甲醛5ml及酚酞10滴 4、酪蛋白试管1反应：加1ml胰蛋白酶混匀，反应5分 钟，将反应液转入三角瓶中，用0.1N的NaOH滴定， 直到获得稳定的粉红色为止。 试管2-7反应同上，计算NaOH量 5、以NaOH消耗的毫升数代表在每种底物浓度下的 V，以1/V对1/［S］作图，求出胰蛋白酶的米氏常数 Km和最大速度Vmax
生物化学实验
Biochemical Experiment 胰蛋白酶米氏常数 （Km）的测定 ——甲醛滴定法
目的要求
z掌握用滴定法测胰蛋白酶的米氏常数 z掌握双倒数作图法计算Km和Vmax
原理
z 本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用双倒数 作图法测定Km值。 z 胰蛋白酶是胰液中的一个酶，它催化蛋白质中碱 性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成 的肽键水解。水解时生成自由氨基。 z 常温下，甲醛能迅速与氨基酸上的氨基结合，形 成羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，使溶液 的酸度增加，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，滴 定终点在酚酞的变色域内(pH9.0左右)。因此，可 用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。
酶工程实验报告五(纤维素酶米氏常数—Km的测定)
v = Km + [S ]v ：反应初速度（微摩尔浓度变化/min)V ：最大反应速度（微摩尔浓度变化/min)[S]：底物浓度（mol/L)Km：米氏常数（mol/L)此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。
3.4 双倒数作图法测定Km值：1 Km 1 1v V [S] V1/v对1/[S]作图可得一条曲线，其斜率为Km/Vmax，截距为1/Vmax 。
若将直线延长与横轴相交，则该交点在数值上等于-1/Vmax。
本实验采用最适pH、最适温度下，测定不同浓度时酶活性。
再根据林贝法作图求出Km值。
3.5 纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3，5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其3mLDNS反应终止→沸水浴5min →定容至25ml→测定OD540吸光值G 作双倒数图求Km4.3 实验注意事项本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。
底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。
严格控制准确的酶促反应时间。
反应温度准确，酶液准确稀释。
不同pH所用酶液用对应pH缓冲液稀释试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；移液管使用时量取精准，保证结果可靠准确。
精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；由图-1/Km=-7,可得出：Km=0.143 mg/ml(g/L)/(2×104)=0.715×10-5mol/L。
6、分析与讨论：米氏常数（Km）是酶的一个特征性物理量，其大小与酶的性质有关。
Km 值随测定的底物种类、反应的温度、pH 及离子强度而改变。
因此，对某一酶促反应而言，在一定条件下都有特定的Km 值，可用来鉴别酶，例如对于不同来源或相同来源但在不同发育阶段，不同生理状况下催化相同反应的酶是否属于同一种酶[1]。
2012_完成(米氏常数)
---- Km值的测定
【实验目的】
了解底物浓度与酶反应速度间的关系
了解酶的Km值测定原理和方法
学习求蔗糖酶米氏常数的方法
酶反应速度与底物浓度的关系曲线
米氏方程:
Vmax S v K m S
当V=Vmax/2时，则Km=[s]
米氏常数的测定—
双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）
各管混匀，沸水浴5min，取出后立即用冷水冷却至室温，以蒸
馏水定容至25ml，摇匀。测540nm处A值。以葡萄糖含量（mg） 为横坐标，A值为纵坐标作出标准曲线。
2．不同底物浓度时反应速度υ的测定
反应物
管 蔗糖 号 (ml) 醋酸缓 冲液 (ml) 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5
1.25
将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再 用作图法求出Km。 1 Km 1 1 — = —— . — + —— v Vmax [S] Vmax
还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应：
【仪器与试剂】
•仪器：
分光光度计、恒温水浴、试管、吸管、秒表、 坐标纸
•试剂：
标准葡萄糖溶液（1 mg/ml）、
0.01 mol／L 蔗糖溶液、 0.2 mol／L NaAc缓冲溶液(pH4.6)、 1mol／L NaOH溶液， 3，5一二硝基水杨酸试剂。
【操作步骤】
1．葡萄糖标准曲线的制定
管号 葡萄糖标准液/ml 蒸馏水/ml 3,5—二硝基水杨酸/ml 0 0 2.0 3.0 1 0.2 1.8 3.0 2 0.4 1.6 3.0 3 0.6 1.4 3.0 4 0.8 1.2 3.0 5 1.0 1.0 3.0
实验九：酸性磷酸酯酶米氏常数、最大反应速度测定
07:04:46
结果与计算
4
HHU Hunan PRC | 吴黎明
1、通过A680求出对应的酚标准液体积（V,mL），则产物的 浓度[P]=0.5×V（mmol/L）； 2、各底浓度下的反应速率v=0.5×V÷10（mmol/L/min）； 3、以1/v为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，得到双倒数方程 ，根据方程求出Km和vmax。
A680
以A680为纵坐标，酚标准应用液体积（mL）为横坐标作标准曲线
07:04:46
实验步骤
3
HHU Hunan PRC | 吴黎明
3、测定Km、Vmax 取试管7支，0～6编号，空白管为0号。各管按下表加入不 同体积5mmol/L磷酸苯二钠溶液，并分别补充0.2M pH5.6乙 酸盐缓冲液至0.5mL。35℃预热2min后，逐管记时加入酸性
1～5号管分别加入0.1-1.0mL酚标准应用液，并用蒸馏水将 各管体积补充至1.0mL，0号管中加入1.0mL蒸馏水。 各管各加1mol/L碳酸钠溶液5.0mL和Folin-酚稀溶液0.5mL ，摇匀后，35℃保温显色10分钟。
以0号管作空白，在可见光分光光度计680nm波长处读取各
管的吸光度A680。
实验原理
2
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在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应
的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度（ v）随底物浓度的增加而迅速增加； 随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当 底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax ）。
6 2.5 0.4
0.5 2.0
注意事项
5
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米氏常数的测定
⽶⽒常数的测定底物浓度对酶促反应速度的影响——⽶⽒常数的测定⼀．⽬的要求1.1了解底物浓度对酶促反应的影响。
1.2掌握测定⽶⽒常数K m 的原理和⽅法。
⼆．实验原理酶促反应速度与底物浓度的关系可⽤⽶⽒⽅程来表⽰：式中：v ——反应初速度（微摩尔浓度变化/min ）；V ——最⼤反应速度（微摩尔浓度变化/min ）； [s]——底物浓度（mol/L ）； K m ——⽶⽒常数（mol/L ）。
这个⽅程表明当已知K m 及V 时，酶促反应速度与底物浓度之间的定量关系。
K m 值等于酶促反应速度达到最⼤反应速度⼀半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之⼀。
不同的酶，K m 值不同，同⼀种酶与不同底物反应K m 值也不同，K m 值可以近似地反应酶与底物的亲和⼒⼤⼩：K m 值越⼤，表明亲和⼒⼩；K m 值⼩，表明亲和⼒⼤。
则测K m 值是酶学研究的⼀个重要⽅法。
⼤多数纯酶的K m 值在0.01～100mmol/L 。
Linewaeaver-Burk 作图法（双倒数作图法）是⽤实验⽅法测K m 值的最常⽤的简便⽅法：实验时可选择不同的[s]，测定对应的v ，以对作图，得到⼀个斜率为V Km的直线，其截距][1s 则为mK 1，由此可求出K m 的值（截距的负倒数）。
本实验以胰蛋⽩酶消化酪蛋⽩为例，采⽤Linewaeaver-Burk 双倒数作图法测定双倒数作图法。
胰蛋⽩酶催化蛋⽩质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键⽔解。
⽔解时有⾃由氨基⽣成，可⽤甲醛滴定法判断⾃由氨基增加的数量⽽跟踪反应，求得初速度。
][][s K s V v m +=V s V K v m 1][1.1+=v 1][1s三．试剂和器材3.1 试剂A.10～30g/L的酪蛋⽩溶液（pH8.5）：分别取10、20、25、30g酪蛋⽩溶于约900mL⽔中，加20mL 1mol/L NaOH 连续振荡，微热直⾄溶解，以1mol/L HCl 或1mol/L NaOH调pH⾄8.5，定容1L，即⽣成四种不同[s]的酪蛋⽩标准溶液。
米氏常数的测定
二、原理
酶促反应v-[S]曲线
v
[S]
推导出米氏方程为：
Vm [ S ] v K m [S ]
其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度； Km 为米氏常数
米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能 够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反 映出酶与各种底物的亲和力的强弱。
0
0 0.8
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
0.30
0.6 0.2
各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL 各管加入2.0 mL
以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标， 绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。
(二）测定 15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。
从对硝基苯酚标准曲线上查出od405nm相当于产物对硝基苯酚的含量?mol数计算出各种底物浓度下的初速度vo单位以?mol?l1?min1表示取倒数1v填入表内
实验九 碱性磷酸酶米氏常 数的测定
一、目的要求
1.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度 （Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶 在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。
四、操作方法
（一）对硝基苯酚标准曲线的制作 管 号 0 1 0.1 0.7 2 0.2 0.6
（不做） 取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作：
3 0.3 0.5 4 0.4 0.4 5 0.5 0.3 6
pNP含量 (mol)
0.5mol/mL pNP (mL) H2O (mL) Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) 0.1 mol/L NaOH (mL) OD 405 nm
蔗糖酶米氏常数的测定
反应。
④ 吸取反应物1.0mL，加入盛有3.0mL 3，5-二硝基水杨酸试剂和
1.0mL水的试管中混匀，放入沸水浴中加热5min，冷却后稀释至
25mL，摇匀，在540nm比色测定A值。
⑤ 以A值对应的葡萄糖量为相对反应速度，以1/[S]为横坐标，1/v
为纵坐标作图，由图求出Km精值选p。pt
7
反应物
米氏常数的求法很多，最常用的是Lineweaver—Burk的 作图法(双倒数作图法)。 米氏方程式可改写为下列倒数形式：
选择不同的[s]，测定相应的v，求出两者的倒数，以1/[s]
为横坐标，以1/v为纵坐标作图，绘出一条直线，外推至
横轴相交，横轴截距即为-1精/选Kppmt 。
1
v
VMAX
1/2VMAX
精选ppt
5
【操作步骤】 1．葡萄糖标准曲线的制定
管号
0
1
2
3
4
5
葡萄糖标准液(mL)
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水(mL)
2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0
3,5-二硝基水杨酸试剂 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 (mL)
将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用 冷水冷却至室温，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀。测540nm处 A值。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A值为纵坐标作出标准 曲线。
4 1.5 3.5 1.0 1.0
5 2.0 3.0 1.0 1.0
6 2.5 2.5 1.0 1.0
7 3.75 1.25 1.0 1.0
8 5.0 0
1.0 1.0
1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0 1.0
淀粉酶米氏常数测定(1)
瓶号 试剂 4%可溶性淀粉（ml） H2O(ml) 缓冲液(ml)
1 0.5 3.5 0.75 0.25
2 1 3 0.75 0.25
3 1.5 2.5 0.75 0.25
4 2 2 0.75 0.25
5 2.5 1.5 0.75 0.25
6 3 1 0.75 0.25
蒸馏水(ml)
充分摇匀，60℃放置10min 加入3.0ml的0.2moL/L HCl，摇匀 取出1.0ml浓度梯度吸光度
不同底物浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、 3.0%）的可溶性淀粉4ml，加入缓冲液0.75ml和蒸馏水 0.25ml，充分摇匀，60℃放置10min，立即加入3.0ml的 0.2moL/L HCl终止反应，然后立即取出1.00ml溶液置于 5.00ml稀碘液摇匀，显色，并以稀碘液作对照，于 660nm处测定吸光度（按操作表1操作）
瓶号 试剂 4%可溶性淀粉（ml） H2O(ml) 缓冲液(ml)
1 0.5 3.5 0.75
2 1 3 0.75
3 1.5 2.5 0.75
4 2 2 0.75
5 2.5 1.5 0.75
6 3 1 0.75
60℃放置，预热5min
酶液(ml)
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
充分摇匀，60℃放置10min 取出，加入3.0ml的0.2moL/L HCl 取出1.0ml溶液置于5.00ml稀碘液，显色 A660 可溶性淀粉量浓度% [s] 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
（5）0.02mLpH6.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液 称取磷酸氢 二钠(Na2HPO4.12H2O)45．23g和柠檬酸(C6H8O7·2O)8.07g， H 用蒸馏水溶解，用酸度计或pH试纸校正pH，定容至1000 mI。 （6）0.2moL/L HCl 取36%盐酸（饱和浓盐酸）0.86ml加入已加有少量蒸馏水 的50ml容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀即可。
淀粉酶米氏常数测定
三 仪器和试剂
试剂
（1）酶液：精确称取酶制剂0.1g(以大约2000 U／g计)，先用少量40℃ 蒸馏水溶解、浸提。将上层液小心倾入500ml容量瓶内，沉淀再加水 捣研。如此重复，最后全部移入容量瓶中，定容后摇匀，用四层纱布 过滤，滤液供测试定用
（2）原碘液 称取碘11 g，碘化钾(KI)22 g，先用少量蒸馏水使碘-碘化 钾完全溶解，定容至500 mL，贮于棕色瓶内。
试剂
瓶号
1
2
3
4
5
6
4%可溶性淀粉（ml） 0.5
1
1.5
2
2.5
3
H2O(ml) 缓冲液(ml)
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75
60℃放置，预热5min
酶液(ml)
0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
充分摇匀，60℃放置10min
1 Km 1 1 v Vm [S] Vm
酶促反应v-[S]曲线
以1/v对1/[S]作图，可得一条直 线，所得直线的截距是1/Vm， 斜率为Km/ Vm。通过 Lineweaver-Burk作图法作图后 可方便的求出Km值。
三 仪器和试剂
试管 移液抢 秒表 吸耳球 恒温水浴锅 7200型分光光度计。
一、 实验目的
了解并掌握米氏常数的意义和测定方法
二、 实验原理
推导出米氏方程为： v Vm[S ] Km [S]
米氏常数Km是酶的一个基本特征常 数，它包含着酶与底物结合和解离的 性质。特别是同一种酶能够作用于几 种不同底物时，米氏常数Km往往可以 反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。
米氏常数的测定
从对硝基苯酚标准曲线上查出od405nm相当于产物对硝基苯酚的含量mol数计算出各种底物浓度下的初速度vo单位以mol?l1?min1表示取倒数1v填入表内
实验九 碱性磷酸酶米氏常 数的测定
一、目的要求
1.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度 （Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸 在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。
四、操作方法
（一）对硝基苯酚标准曲线的制作 管 号 0 1 0.1 0.7 2 0.2 0.6
（不做） 取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作：
3 0.3 0.5 4 0.4 0.4 5 0.5 0.3 6
pNP含量 (mol)
0.5mol/mL pNP (mL) H2O (mL) Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) 0.1 mol/L NaOH (mL) OD 405 nm
二、原理
酶促反应v-[S]曲线
v
[S]
推导出米氏方程为：
Vm [ S ] v K m [S ]
其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度； Km 为米氏常数
米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能 够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反 映出酶与各种底物的亲和力的强弱。
（三） 数据处理
各管在722分光光度计测定波长405nm的OD 值 (OD405nm) 。 从 对 硝 基 苯 酚 标 准 曲 线 上 查 出 OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数), 计 算 出 各 种 底 物 浓 度 下 的 初 速 度 vo （ 单 位 以 molL-1min-1 表示），取倒数1/v填入表内。以 1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常 数Km和最大反应速度Vm。
米氏方程
米氏方程与双倒数作图法Lineweaver-Burk plot
米氏方程（Michaelis-Menten Equation）或米曼氏动力学（Michaelis-Menten kinetics）是由Leonor Michaelis和Maud Menten在1913年提出，是酶学中极为重要的可以描述多种非变异构酶动力学现象、表示一个酶促反应的起始速度V （有些资料中也称为Vo）与底物浓度[S]关系的速度方的方程，米氏方程形式如下：
其中，Vmax表示酶被底物饱和时的反应速度，Km值称为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。
在酶促反应中，底物情况在低浓度下，反应相对于底物是一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度[S]逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。
下图为米氏方程的模拟作图：
酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测定有多种方法。
比如固定反应中的酶浓度，然后测试几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得Km和Vmax值。
但直接从起始速度对底物浓度的图中确定Km或Vmax值是很困难的，因为曲线接近Vmax时是个渐进过程。
因此，通常情况下，我们都是通过米氏方程的双倒数形式来测定，即Lineweaver-Burk plot，也可称为双倒数方程(double-reciprocal plot)：
将1/V 对1/[S]作图，即可得到一条直线，该直线在Y轴的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为1/Km的绝对值。
示意图如下：。
米氏常数的测定
（三） 数据处理
各管在722分光光度计测定波长405nm的OD 值 (OD405nm) 。 从 对 硝 基 苯 酚 标 准 曲 线 上 查 出 OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数), 计 算 出 各 种 底 物 浓 度 下 的 初 速 度 vo （ 单 位 以 molL-1min-1 表示），取倒数1/v填入表内。以 1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常 数Km和最大反应速度Vm。
0
0 0.8
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
0.30
0.6 0.2
各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL 各管加入2.0 mL
以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标， 绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。
(二）测定 15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。
五、 注意事项
1.
2.
3. 4. 5. 6.
7.
取液量一定要准确。 反应时间一定要精确。 加酶前后一定要将试剂混匀。 空白对照一定要先加NaOH，后加酶。 测定OD405时要以各自的空白调零点。 移液管或取液器的使用 比色杯的使用
六、思考题 (1) 试说明米氏常数Km的物理意义和生物学 意义。 (2)为什么说米氏常数Km 是酶的一个特征常 数而Vm则不是？
米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能 够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反 映出酶与各种底物的亲和力的强弱。
测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的 Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米 氏方程转化为倒数形式，即：
[资料]酶的km
![[资料]酶的km](https://img.taocdn.com/s3/m/bb84ab6f1611cc7931b765ce05087632311274f9.png)
米氏常数的意义 ★★★当酶促反应处于ν＝1/2 V max 时，可从米一曼氏方程式得到K m ＝［S ］。
由此可知，K m 值是酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度。
它的单位与底物浓度一样，是摩尔／升（mol/L ）。
米氏常数是酶学研究中一个极重要的数据，其意义如下： 1. 反映酶的种类K m 值对某一特定酶来说是个常数。
【见一些酶的K m 值】可以利用酶的K m 值比较来源于同一器官不同组织，或同一组织不同发育期的具有同样作用的酶，来判断这些酶是完全相同的酶，或是催化同一反应的一类酶。
2. 反映酶与底物的亲和力从酶被底物饱和的现象出发，按照中间产物假说的设想，酶促反应如下：K m 值等于当K -1≥K +2，即ES 解离成E 和S 的速度超过分解成E 和P 的速度时，K +2可以忽略下计，此时K m 值近似于ES 的解离常数K s （底物常数），在这种情况下，K m 值可用来表示酶与底物的亲和力。
K m 值越大，酶与底物亲和力越小；K m 值越小，酶与底物亲和力越大。
K m 值越大，酶与底物亲和力越小；K m 值越小，酶与底物亲和力越大。
一个酶如有几种底物就有几个K m 值。
其中K m 值最小, V max /K m 值最大者是对酶亲和力最大的底物，一般称为天然底物或最适底物。
K m 值随不同底物而异的现象，可以帮助判断酶的专一性，有助于研究酶的活性部位。
【推导过程】3. 计算底物浓度和相对速度可由所要求的反应速度（应到达V max 的百分比），求出应当加入底物的合理浓度；反之，也可以根据已知底物浓度，求出该条件下的反应速度。
【举例说明】 4. 反应激活剂或抑制剂的存在酶不仅与底物结合，也可与其他配体结合（如激活剂、抑制剂）而影响K m 值。
因此，如果发现某种酶在体外测定的K m 值与体内差别较大，可以预料体内可能存在着天然激活剂降低了K m 值或抑制剂提高了K m 值。
同时也可用不同物质对K m 值的影响，识别生理上有重要意义的调节物。