酶的分离纯化方法介绍
酶学第五章 酶的分离纯化与制剂
主讲教师：赵丹丹
第五章 酶的分离纯化与制剂
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一、预处理和破细胞
4. 细胞破碎（cell disruption）
(2) ‘‘丙酮干粉’’（acetone powder）处理法 适用于微生物材料 一般程序是先将材料粉碎、分散，然后在0℃以下的低温条件下、加 入5～10倍预先冷至约-20℃的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，最后 低温干燥，研磨过筛 丙酮处理优点： ① 能有效地破坏细胞壁（膜）；② 有利于除去大量脂类物质，以免 它在以后的步骤产生干扰；③ 能使某些膜结合酶易于溶解；④ 丙酮 干粉含水量低，便于保存。 缺点：丙酮可能引起某些酶变性失效。
主讲教师：赵丹丹
第五章 酶的分离纯化与制剂
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第二节 酶的抽提
抽提的要求是要将尽可能多的酶、 尽量少的杂质从原料引入溶液。
主要内容：预处理和破细胞
抽提
浓缩
一、预处理和破细胞
着手酶的提取前，通常应先对酶的原料进行适当的预处理 (Pretreatmention)。例如： (1) 动物材料要先剔除结缔组织、脂肪组织和血污等 ； (2) 油质种子最好先用乙醚等脱脂； (3) 种子研磨前应去壳，以免丹宁等物质着色污染； (4) 对于微生物材料则应将菌体和发酵介质加以分离。 2. 在这些预处理后，尽可能以非常新鲜的状态直接应用; 否则，应将 完整材料立即冰冻保存。
最终目的（ 获得高度纯净的酶制剂 ）
整个工作包括三个基本环节： (1) 抽提（extraction）：是要将酶从原料中抽提出来作成酶溶液；
(2) 纯化（purification）：是将酶和杂质分离开来，或者选择地将酶从 包含杂质的溶液中分离出来，或者选择地将杂质从酶溶液中移除出去；
(3) 制剂（preparation）：是要将纯化的酶作成一定形式的制剂。
酶的分离提纯实验原理
酶的分离提纯实验原理酶的分离提纯是指从复杂的混合物中获得纯净的酶样品的过程。
此过程旨在去除其他杂质，并提高酶的比活性和纯度。
酶的分离提纯实验原理可以分为以下几个方面：1. 根据酶的生理特性进行分离：酶的分离可依据酶对pH值、温度、离子浓度、底物特异性等因素的敏感性进行。
常用分离方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、电泳等。
2. 分离的物理性质利用：酶可根据其分子大小、电荷、溶解度等物理性质进行分离。
例如，凝胶过滤层析通过选用合适的孔径筛选凝胶，使大分子酶无法进入凝胶孔隙，进而实现分离。
3. 分离的化学性质利用：酶可通过与其他物质的特异性相互作用来实现分离。
亲和层析是一种常用的方法，利用酶与某些配体（如某种金属离子、亲合剂等）的特异性结合来分离酶。
在实验中，通常采用以下步骤进行酶的分离提纯：1. 细胞破碎：从生物体中获得酶源，如细胞、组织、分泌物等。
通常使用超声波破碎、搅拌破碎、离心等方法破碎细胞，并保持样品低温以防止酶的失活。
2. 酶提取：将破碎的细胞溶液用适当的缓冲液进行提取，并添加必要的辅助物质（如阻聚剂、金属离子等）以保持酶的稳定和活性。
3. 初步分离：通常先进行粗提，包括沉淀、超滤、离心、酒精沉淀等方法，目的是将酶与其他细胞组分分离开来。
4. 层析：根据酶的物理性质或化学性质选择适当的层析方法。
离子交换层析是常用的方法之一，根据酶与离子交换基质之间的相互作用进行分离。
5. 亲和层析：利用酶与特定配体之间的结合进行分离。
例如，选择性地将酶与亲和基质（如亲和剂或金属离子）结合，然后利用特定条件（如改变pH值或添加竞争性配体）来解离酶。
6. 离心和浓缩：通过离心和浓缩等操作，将目标酶进一步分离和提纯。
7. 再结晶：通过结晶或沉淀等方法进行酶的最终纯化。
8. 活性测定和纯度检验：测定酶的比活性，评估酶的纯度和活性。
总之，酶的分离提纯实验原理基于酶对物理、化学条件的敏感性，通过适当的分离方法和步骤，去除杂质，提高酶的纯度和比活性。
4.12第四章酶的分离纯化
超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分 子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对 分子质量的测定等。
溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增 大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分 子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的 水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙 醇、甲醇等 。
2、离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、 不同密度的物质分离的技术过程。
4.4 酶的分离方法
1、沉淀分离 2、离心分离 3、过滤与膜分离 4、层析分离 5、电泳分离 6、萃取分离
1、沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解 度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
沉淀分离方法 盐析沉淀法
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
复合沉淀法 选择性变性沉淀 法
胆固醇浆液分析 牛奶灭菌后H2O2的 清除
1、细胞破碎
许多酶存在于细胞内。 为了提取这些胞内酶， 首先需要对细胞进行破 碎处理。
1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎
参见动画
高 压 细 胞 破 碎 机
超 声 波 细 胞 粉 碎 机
酶的分离纯化讲解
第二节分离纯化步骤及方法
一、步骤
发酵产品
1、酶的提取
固液分离，破碎，抽 提，浓缩
2、初分离
3、 纯化
精制品
4结晶
保藏
酶分离纯化总体步骤
1、酶液的提取
（1）发酵液的固液分离 （2）细胞破碎
（1）发酵液的固液分离
❖ 常用的分离方法有离心和过滤。 ➢ 离心分离速度快，效率高，操作时卫生条件
转筒真空过滤器
II
1 2
4 III
6 7
5
3
a.转动盘
b.固定盘
I
1－转筒；2－滤饼；3－割刀；4－分配头；5－吸走滤液的真空凹槽； 6－吸走洗水的真空凹槽；7－通入压缩空气的凹槽I－过滤区； II－洗涤脱水区；III－卸渣区
（2）细胞破碎
❖ 按微生物细胞酶的分布分为三类 ❖ 细胞破碎是指通过物理、化学或生物的方法，
❖ 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的 方法，通常可先用家用食品加工机将组织打 碎，然后再用10000r/min～20000r/min 的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织 的细胞打碎。
物理破碎
通过各种物理因素 的作用，使组织、 细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
冻结-融化法 压榨法 渗透压法 超声波破碎法
纯度要求 极高纯度（>99%）
高纯度（95%-99%）
一般纯度（<95%）
用途 医疗用途
理化性质研究
生产抗原
2、明确目标蛋白与主要杂质的性质
❖ 检测目标酶蛋白稳定条件，至少检测pH 值和离子强度两个条件。
❖ 了解目标酶和杂质的性质：分子大小、 等电点、溶解度等。
酶的分离纯化及活性测定
第五节酶的分离、纯化及活性测定1一、酶的分离、纯化•:一类由细胞内产生然后分泌到细胞外进行作用胞外酶生然后分到行作的酶，这类酶大多都是水解酶类。
•胞内酶:另一类酶在细胞内合成后在细胞内起催化作用的，这类酶数量较多。
的多2一般原则：般原则：防止强酸、强碱, 要求加入的化学试剂不使酶变性；在低温下操作，全部操作在低温0～4℃；在分离提纯过程中避免剧烈搅拌 在分离提纯过程中，避免剧烈搅拌；在提纯溶剂中加一些保护剂如少量EDTA 在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇；在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈的烈”的手段。
3酶的分离提纯三个基本环节：第一抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；第二纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；第三制剂，即将酶制成各种剂型。
在酶的分离纯化过程中．每步都须做三件事：第一第，测定酶活力(IU/ml)；第二，测定蛋白质含量(mg/ml)；第三，测量体积(ml)。
4基本操作程序微生物、动物、选材植物加入提取液抽提胞内酶先破碎抽提先净化处理再沉淀法分离离子交析分离纯化换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等5（一）酶的抽提（）酶的抽提1、破碎细胞对于细胞外酶可用水缓冲液浸泡过对于细胞外酶可用水、缓冲液浸泡过滤后，可得粗抽提液。
对于细胞内酶要破碎细胞、动物细胞较易破碎，通常用匀浆器捣碎机，制成较易破碎，通常用匀浆器、捣碎机，制成匀浆离心后可得酶抽提液。
细菌细胞壁较厚，需用超声波、溶胞壁较声溶菌酶等抽提。
酶等提62、酶的抽提酶的抽提一般的酶可用稀酸或稀碱的水溶液抽提出来。
抽提条件：提出来抽提条件⑴抽提溶的pH选择应该在酶的pH稳定，并离范围之内，并且最好远离等电点。
低温下抽提⑵低温下抽提（0～40C）7（二）酶的纯化（）酶的纯化抽提液中除含有所需有酶外，还含有其它大抽提液中除含有所需有酶外还含有其它大分子物质。
常用分离纯化的方法：①溶解度②电荷性质③大小或质量④亲和部位。
分离纯化一种酶的方法
分离纯化一种酶的方法分离纯化一种酶是生物工程领域的一个重要研究课题，有多种方法可以用来实现这一目标。
下面将介绍几种常用的分离纯化酶的方法。
1.固定相吸附色谱法固定相吸附色谱法是最常用的酶纯化方法之一。
在这种方法中，通过对酶进行吸附，然后使用缓冲溶液洗脱的方式分离纯化酶。
为了实现这一目标，可以选择一种适合酶吸附的固定相，例如亲和树脂、离子交换树脂或凝胶等。
通过在不同的条件下洗脱，可以逐步去除非目标蛋白质，最终得到纯化的酶。
2.亲和层析法亲和层析法是常用的可以选择性地与酶相互作用的方法。
在亲和层析法中，可以通过与酶相互作用的特定亲和剂将酶从复杂混合物中分离出来。
例如，可以根据酶与金属离子的亲和性，使用金属离子柱进行层析。
亲和层析法通常需要先对亲和剂进行固定，然后通过加载样品和适当的洗脱剂来纯化酶。
3.凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于酶的大小差异来分离纯化的方法。
这是一种较为简单的方法，适用于分离不同分子量的酶。
在凝胶过滤法中，通过将混合物通过一系列的凝胶分离层来分离不同大小的分子。
酶分子会在凝胶中被阻止，而较小的分子可以通过凝胶透析孔隙。
通过控制凝胶的孔隙大小，可以选择性地纯化酶。
4.电泳法电泳法是一种常用的酶分离纯化方法，尤其适用于具有不同电荷的酶。
在电泳法中，通过在电场中施加电压，根据不同酶的迁移速度将酶分离出来。
根据酶的等电点和电荷性质，可以选择凝胶电泳或者等电聚焦电泳来分离纯化酶。
电泳法的一个重要应用是SDS-PAGE，它从凝胶中获得酶的纯化和分析。
5.超滤法超滤法是一种可以根据酶的分子量选择性地分离纯化酶的方法。
在超滤法中，通过将混合物通过一系列合适孔径的滤膜，可以将酶与其他较小分子分离开来。
较大分子（包括酶）会被限制在滤膜上方，而较小分子则可以通过滤膜，从而实现分离纯化酶的目的。
综上所述，分离纯化酶的方法有很多种。
选择适用的方法取决于酶的性质、目标和需求。
常用的方法包括固定相吸附色谱法、亲和层析法、凝胶过滤法、电泳法和超滤法。
酶分离纯化的步骤主要原理
酶分离纯化的步骤主要原理
酶的纯化和分离是通过一系列步骤实现的，其主要原理包括以下几点：
1. 细胞破碎：首先需要将含有酶的细胞破碎，以释放酶分子。
这可以通过物理方法（如超声波或搅拌）或化学方法（如溶解细胞膜）实现。
2. 酶的特异性沉淀：根据酶的特性和条件，选择适当的方法使酶与其他杂质分子分离。
常用的方法包括沉淀、沉降和离心。
例如，可以通过加入特定的沉淀剂或改变pH值来使酶沉淀，从而将其与其他溶液中的物质分离。
3. 过滤和超滤：利用不同孔径的滤膜，可以通过过滤和超滤方法去除较大分子，如蛋白质碎片和细胞残渣。
4. 离子交换层析：离子交换层析是利用酶与离子交换树脂之间的相互作用进行分离的方法。
树脂上的离子可吸附酶，而其他杂质则被洗脱。
5. 亲和层析：亲和层析是通过酶与特定配体之间的亲和力实现分离的方法。
配体可以是酶的底物、抗体或其他具有与酶特异性结合的小分子。
酶与配体结合后，可以用洗脱剂将酶从亲和层析柱上洗脱。
6. 凝胶过滤层析：凝胶过滤层析是根据酶的分子大小和形状实现分离的方法。
通过选择合适孔径的凝胶、调节操作条件，可以将酶与其他分子分开。
7. 高效液相层析：高效液相层析（HPLC）是一种高效的液相分离技术。
通过调节流动相和固定相的性质，利用酶与固定相之间的相互作用进行分离。
8. 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法，通过电泳平台上的电场作用下，根据酶的电荷、形状和大小进行分离。
以上步骤和原理可以根据酶的特性和所需纯度的要求进行组合和调整，以实现酶的有效纯化和分离。
酶的分离纯化
第三章酶的分离纯化第三章酶的分离纯化第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤第二节细胞破碎第三节酶的抽提第四节酶的纯化第五节酶的纯度与产量第六节酶的剂型与保存第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤1926年Summer制备了第一个结晶酶，自此以后，酶分离纯化工作进展很快，现已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净，并根据酶的作用特点，理化性质、发展了各种类型的分离纯化方法、试剂和设备。
一、基本原则二、酶分离纯化的基本步骤为了能成功地进行酶的分离纯化，需注意以下两个基本原则：1. 防止酶变性失效防止酶变性失效是酶分离纯化工作很重要的问题，这一点在纯化后期尤为突出。
一般地，凡是用以预防蛋白质变性的方法与措施，都可考虑用于酶分离纯化工作中。
常见的措施有：（1）低温：除少数例外，所有操作应在低温下进行，有有机溶剂存在时，更应注意。
二、酶分离纯化的步骤酶分离纯化时，一般要经过如下步骤：1. 细胞破碎：除在体液中提取酶或胞外酶，一般都要进行细胞破碎，促使胞内酶溶出，以利于抽提。
2. 抽提3. 纯化下面分节对这三个基本环节加以介绍第二节细胞破碎细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。
一、机械破碎法二、物理破碎法三、化学破碎法四、酶学破碎法：通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。
1. 机械捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎，转速可高达10000r/min。
常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。
此法在实验宝和生产规模均可采用。
通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。
物理破碎法包括如下几种方法；1. 温度差破碎法：通过温度的突然变化使细胞破碎。
即将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。
酶的分离
大多数蛋白类酶都溶 于水，而且在低浓度 的盐存在的条件下， 酶的溶解度随盐浓度 的升高而增加，这称 为盐溶现象。
在盐浓度达到某一 界限后，酶的溶解 度随盐浓度升高而 降低，这称为盐析 现象。
举例说明
盐溶液提取
例如，固体发酵生产的麸曲中的淀粉酶、蛋白酶等胞 外酶，用 0.14mol/L 的氯化钠溶液或 0.02~0.05mol/L 的磷酸缓冲液提取；枯草杆菌碱性磷 酸酶用 0.1mol/L 氯化镁溶液提取等。有少数酶，如 霉菌脂肪酶，用清水提取的效果较好。 核酸类酶（R-酶）的提取，一般是在细胞破碎后，用 0.14mol/L 的氯化钠溶液提取，得到核糖核蛋白提取 液，再进一步与蛋白质等杂质分离，而得到酶 RNA。
沉淀分离方法 分离原理
盐析沉淀 法 等电点沉 淀法 有机溶剂 沉淀法 复合沉淀 法
利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解 度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度 的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀， 从而使酶与杂质分离 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以 及不同的两性电解质有不同的等电点这一特 性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀 析出，从而使酶与杂质分离 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不 同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶 或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合 物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离
三 、离心条件
在离心过程中，应该根据需要，选择好离心 力（或离心速度）和离心时间，并且控制好温 度和 pH 值等条件。
1.
离心力
相对离心力
2、离心时间 3、温度和 pH 值
（三 ） 过滤与膜分离
过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形 状的物质分离的技术。 过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、 纤维、多孔陶瓷和各种高分子膜等，其中以 各种高分子膜为过滤介质的过滤技术称为膜 分离技术。微滤、超滤、反渗透、透析及电 渗析等都属于膜过滤技术。
酶主要的分离纯化方法
酶主要的分离纯化方法。
1、根据酶分子大小和形状的分离方法。
(1)离心分离。
许多酶往往富集于某一特定的细胞器内，先通过离心得到某一特定的亚细胞成分，然后再对某一特定的酶进行纯化。
包括一般离心、差速离心、密度梯度离心。
(2)凝胶过滤。
酶蛋白分子大小不同，大于凝胶孔径的被凝胶排阻，因而在凝胶颗粒间隙中移动，速度较快；小于凝胶孔径的可自由出人凝胶颗粒的小孔内，路径加长，移动缓慢。
这样通过一定长度的凝胶层析柱后，大小不同的酶蛋白分子就被分开了。
(3)透析与超滤。
通过透析可以除去酶液中的盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。
超滤指在一定压力下，将溶液强制通过一定孔径的滤膜以达到分离纯化的目的。
2、根据酶分子电荷性质的分离方法。
(1)离子交换层析。
根据不同的蛋白质与离子交换剂的亲合力不同而达到分离目的的方法称为离子交换层析。
(2)层析聚焦。
层析聚焦层析聚焦类似于等电聚焦，但其连续的pH梯度是在固相离于交换载体上形成的。
(3)电泳。
在外电场作用下，由于蛋白质离于所带净电荷的大小和性质不同，因而其泳动方向和速率也不同，从而达到分离的目的。
酶的分离与纯化
● 鹽溶 Salting-in:
加鹽使蛋白質溶入水溶液中
● 鹽析 Salting-out:
加鹽使蛋白質由水溶液中沉澱出來
設計純化步驟時，需考慮下列各項要求
• • • •
a. 高活性 b. 高回收率 c. 高純度 d. 方便與快速
組合純化步驟
• a. 組合標準 • (1) 已知的酵素，可依照已發表的步驟進行， 有問題再作改進。 通常都是以 硫酸銨分劃 - 膠 体過濾 - 離子交換 為骨幹，再加上其它方法， 組成全部流程。 • (2) 對完全未知的酵素，可循此骨幹先試行純 化，看其結果如何再加改進。 • (3) 不要忘記利用該酵素的特殊性質來純化， 如在其 pI 沉澱性、特別的疏水性、有專一的抑 制劑或熱穩定性等。
• 膠体過濾法在操作時，有些內在的問題，會影 響結果的好壞： • (1) 擴散及亂流： 由於是在液相中進行，樣本 在膠柱中的 擴散現象 相當顯著；又因液体在 膠球間流動時，受 重力 及 對流 的影響，會造 成 亂流。 擴散及亂流都會使膠体過濾的解析 力降低甚多。 • (2) 管柱設計不良： 經常是致命的傷害，例如 無效空間 (dead volume) 過大、緩衝液進入膠体 時流動不均、溶離液出口端的管路太長或太粗 等。
近朱者赤、近墨者黑，物以類聚，不 論人類或是分子皆同
色谱的类型
. 常用的層析方法
膠體過濾法
• 膠体過濾 属 partition 層析法，流動相為溶離緩 衝液，固定相為膠体孔隙內的緩衝液。 溶質 (樣本蛋白質) 根據其 分子量 的大小，決定分 佈在這兩相的比例。 分子量大的不易進入膠球， 隨流動相溶離；分子量小的，則易竄入膠球內 的固定相，而被延滯流出膠柱 。 分子的 形狀、 大小 均為影響因素，即與其 分子半徑 (Stokes radius) 有關，與分子量不完全成正比關係；但 一般均視蛋白質為球形，故其形狀較無影響 力。
酶工程3 第三章：酶的分离纯化
3.3.1 细胞破碎的方法
机械破碎法 物理破碎法 化学破碎法 酶促破碎法 P72-73
3.3.2酶提取的方法
根据酶的溶解性质，选择适当的溶剂。
盐溶液提取法 酸溶液提取法 碱溶液提取法 有机溶剂提取法 p76
3.3.3影响酶提取的主要因素
1 提取目标:提高提取率减少酶活损失。 1)温度：温度过高易导至酶失活，应控制在0－
1 分离过程中新设备、新技术的应用会取得 事半功倍的效果。如离心机、过滤机的选择。 采用膜分离技术等。
2. 浓缩与干燥过程尽量使用低温过程减少酶失 活，同时可添加一些保护剂以减少酶失活。
3.4 沉淀分离
沉淀分离方法： 盐析沉淀 等电点沉淀 有机溶剂沉淀 复合沉淀 选择性变性剂沉淀
收集沉淀
10℃，对于稳定性高的酶提高温度有利于提 取。
2）pH:pH应远离等电点以提高溶解度，但pH 不宜过高或过低，防止酶失活。
3) 提取液用量：用量增加，提取率增加但分离 成本提高。一般为原液的3-5倍
4) 添加保护剂：加入适量的酶作用底物、辅酶 或抗氧化剂可以提高酶稳定性，减少酶活损 失。
提取时的注意事项
N－末端分析 只适用于一条肽链
免疫技术 高度的专一性，但抗血清制备较为麻烦
3.3分离与纯化
分离（提取）：在一定条件下，用适当的
溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中。
纯化：通常先根据溶解度性质用沉淀的方法
（如盐析、有机溶剂沉淀等），制得粗酶， 再根据酶分子的大小、电荷性质、亲和专一 性，将酶纯化。
过滤
非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质
3.5 离心分离
借助于离心机旋转所产生的离心力，使 不同大小密度的物质分离的技术。
酶的分离与纯化技术的研究进展
酶的分离与纯化技术的研究进展酶是生命体内一类具有生物催化作用的大分子有机物，可以作为催化反应的媒介，在化学合成、生产和仿生学等领域发挥作用。
随着酶的应用越来越广泛，酶的分离和纯化技术也越来越成为人们关注的焦点。
本文将对酶的分离和纯化技术的研究进展进行介绍。
第一部分：酶的分离技术酶的分离技术是指将混合物中的酶分离出来的技术方法。
这些方法主要包括分子筛分离、离子交换、凝胶过滤、亲和层析和直接电泳法等。
1.分子筛分离分子筛分离是一种常见的酶分离技术，它利用不同分子大小和形状的分子在孔径大小的分子筛中分离。
该方法适用于分离分子量较大、结构紧密的酶，在分离过程中不需要进行任何化学反应。
2.离子交换离子交换是将酶从混合物中分离出来的一种常见方法。
该方法利用了酶和分离质子或离子的亲合性，通过离子交换柱，使酶不被拦截然后与其他离子结合。
3.凝胶过滤凝胶过滤是利用了凝胶过滤管中孔隙的差异分离酶分子大小不同的技术方法。
凝胶过滤是分离纯化酶的最常用方法之一，专家们在其上广泛地进行研究和实践。
4.亲和层析亲和层析是最常用的酶分离方法之一，通过分离目标蛋白质与杂质分子的亲和性不同来达到分离纯化的目的。
亲和层析技术还可以用于分离两种亲和力不同的酶，以避免使用血清中含有的抗体来纯化酶，避免污染。
5.直接电泳法直接电泳法是一种新型的酶分离方法，它的主要原理是利用酶分子的电性差异，在电场作用下，通过电泳可使酶分子在凝胶中移动、分离和纯化，它逐渐得到了广泛的应用。
第二部分：酶的纯化技术酶的纯化技术是指将酶从分离出来的混合物中除去杂质，使其达到一定纯度的技术方法。
通常采用的方法包括差凝、溶剂法、沉淀法、分配系数法、电泳法和微生物处理等。
1.差凝差凝是酶分离纯化中最常用的方法之一，它是通过将混合物中的有机组分与水分离，使有机组分与酶溶液分开平衡，从而达到分离杂质的目的。
2.溶剂法溶剂法是将酶与其他分子分离的方法，其中酶通过加入某些有机溶剂使酶部分变性，然后过滤，最后再反向冲洗，酶就在溶剂中被分离出来。
酶的提纯方法原理
酶的提纯方法原理
酶的提纯方法的原理主要是利用酶与其他组分的物理和化学性质的差异，采用物理分离及化学结合等方法将酶分离纯化。
常用的酶的提纯方法包括：
1. 溶液稀释与沉淀法：利用酶与其他组分的溶液浓度差异，通过稀释和沉淀使酶分离纯化。
2. 过滤法：利用酶的分子大小与其他组分的差异，通过滤膜或高分子凝胶过滤使酶分离纯化。
3. 膜技术：利用酶与其他组分在膜表面的相互作用差异，通过渗透膜、离子交换膜、亲和膜等将酶分离纯化。
4. 电泳法：利用酶在电场中的电荷差异，通过凝胶电泳或等电聚焦电泳等将酶分离纯化。
5. 透析法：利用酶与其他组分的分子大小和亲和性差异，通过渗透透析的方式将酶分离纯化。
6. 柱层析法：利用酶与柱层析介质的亲和性、分子大小或电荷的差异，通过柱层析将酶分离纯化。
7. 结晶法：利用酶与其他组分的溶解度差异，通过降低溶液中酶的饱和度使酶结晶从而分离纯化。
这些方法的选择与应用取决于酶的特性和特定的纯化要求。
酶的分离方法
酶的分离方法酶是一类能够催化化学反应的生物大分子，对于生物体内的代谢过程起着至关重要的作用。
酶的分离方法是研究酶结构和功能的重要手段之一。
本文将介绍几种常见的酶的分离方法。
一、离心分离法离心分离法是一种常见的酶的分离方法，利用离心力将混合物中的酶分离出来。
这种方法适用于酶的分子量较大且沉降系数较大的情况。
首先，将含有酶的混合物进行离心，利用离心力使酶沉降到离心管底部形成沉淀。
然后，将上清液倒掉，得到酶的沉淀。
最后，可以用适当的缓冲溶液将酶的沉淀溶解，得到纯化的酶。
二、毛细管电泳法毛细管电泳法是一种利用毛细管及电场力分离酶的方法。
这种方法适用于酶的分子量较小的情况。
首先，将含有酶的混合物注入毛细管中，然后施加电场力使酶在毛细管中移动。
由于不同酶在电场力作用下的迁移速率不同，酶会在毛细管中分离出来。
最后，可以根据酶的迁移距离和迁移时间来判断酶的种类和纯度。
三、凝胶过滤法凝胶过滤法是一种利用凝胶孔隙分离酶的方法。
这种方法适用于酶的分子量较大的情况。
首先，将含有酶的混合物加入凝胶柱中，利用凝胶孔隙大小的差异将酶分离出来。
由于不同酶的分子量不同，酶会在凝胶柱中以不同的速率通过，从而实现分离。
最后，可以根据酶的分离位置和柱上的色带来判断酶的种类和纯度。
四、亲和层析法亲和层析法是一种利用亲和力分离酶的方法。
这种方法适用于酶与其底物或抑制剂之间具有特异性结合的情况。
首先，将含有酶的混合物通过装有亲和层析柱的系统，利用酶与亲和基质之间的特异性结合将酶分离出来。
然后，利用适当的洗脱剂将酶从亲和基质上洗脱下来。
最后，可以通过测定洗脱液中酶的活性来判断酶的纯度。
以上所述的离心分离法、毛细管电泳法、凝胶过滤法和亲和层析法是常见的酶的分离方法。
每种方法都有其适用的条件和优缺点，研究人员可以根据具体的实验目的和要求选择合适的方法。
酶的分离方法不仅有助于研究酶的结构和功能，还可以为药物研发、生物工程等领域提供重要的实验手段和理论基础。
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酶的分离纯化方法介绍酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。
关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。
这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。
这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。
生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。
酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。
酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。
下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍：一、预处理及固液分离技术1.细胞破碎（cell disruption）高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。
将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。
菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。
细胞破碎率与细胞的种类有关。
要达到90%以上的细胞破碎率，起码要将菌悬液通过均质器两次。
最好是提高操作压力，减少操作次数。
但有人报道，当操作压力达到175Mpa时，破碎率可达100%。
当压力超过70Mpa时，细胞破碎率上升较为缓慢。
高压均质器的阀门是影响细胞破碎率的重要因素。
丝状菌会堵塞均质器的阀门，尤其高浓度菌体时更是如此。
在丰富培养基上比在合成培养基上生长的大肠菌更难破碎。
容菌酶处理法：蛋清中含有丰富的溶菌酶，价格便宜，常用来裂解细胞。
具体做法是：溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg，置于0.5%的氯化钠溶液中，使细胞浓度为5%（干重），在35℃用0.68kg（干重）的蛋清处理20min，得到的细胞碎片用相同体积的乙醇处理，用离心机将细胞碎片和胞内蛋白质除去，再将乙醇浓度提高到75%（体积分数），可以得到纯度为5%的过氧化氢酶1500g。
2.离心离心分离过程可分为离心过滤、离心沉淀、离心分离3种类型，所使用的设备有过滤式离心机、沉降式离心机和离心机。
过滤式离心机的转鼓壁上开有小孔，壁上有过滤介质，一般可用于处理悬浮固体颗粒较大、固体含量较高的场合。
沉降式离心机用于分离固体浓度较低的固液分离，如发酵液中的菌体，用盐析法或有机溶剂处理过的蛋白质等。
分离机用于分离两种互不相溶的、密度有微小差别的乳浊液或含微量固体微粒的乳浊液。
在生物领域采用的离心机系统，除了应具备离心机的一般要求外，还应满足生物生产的技术要求，这包括灭菌、冷却、密封，以保证产品不受污染并不污染环境。
现代哦离心机装置包括以下三个步骤，并进行程序控制：离心、离心系统的灭菌及就地清洗。
如阿法-拉伐公司离心机产品的装置，具有双重轴向密封，密封由装在转筒主轴上下的碳化硅动环和固定环组成，密封由水连续冷却和润滑，可防止产品被污染，也可防止生产过程中排出的废物对环境的污染。
该离心机又如一个密闭的压力容器，可在121℃温度下进行蒸汽灭菌，该离心设备设有环绕离心机转筒的冷却夹套，对悬浮液和浓缩的固体都能进行充分的冷却，并能有效地控制温度，这对于生物制品是非常重要的。
如BTPX205型离心机可用于细胞收集、培养液的净化和细胞碎片的分离，可用于疫苗、酶制剂等的提取。
该机的其他辅助系统及控制系统也较为完善，如设有压力指示器、力量计、温度传感器和液面传感器。
3.膜分离技术在蛋白质纯化过程中主要用到的膜分离技术多为超滤。
在静压作用下降溶液通过孔径非常小的滤膜，使溶液中分子量较小的溶质透过薄膜，而大分子被截留于膜表面。
大多数超滤膜是由一层非常薄的功能膜与较厚的支撑膜结合在一起而组成的。
功能膜决定了膜的孔径，而支撑膜提供机械强度以抵抗静压力。
超滤浓缩的优点是：操作条件温和，无相变化，对生物活性物质没有破坏。
超滤系统主要由料液贮罐、泵、超滤器、透过液收集罐组成，料液经泵打入超滤器，水及低分子量物质排出超滤器外，被浓缩的料液在料液贮罐、泵、及超滤器中循环。
当料液浓缩至一定的倍数后即可作为进一步处理的浓缩料液。
超滤应用于蛋白质类物质的浓缩和脱盐过程中时应注意以下问题：第一，在超滤循环过程中，由于泵和叶轮与料液的摩擦放热作用，料液的温度会逐渐升高，会造成蛋白质分子的损失。
因此，料液贮罐应加冷却系统，并安装自动测温及控制系统。
第二，某些酶的辅助因子散失为问题：一些酶含有辅助因子，其分子量小，超滤时易从透过液中排除掉，因而在超滤前或超滤后要添加一定浓度的的辅助因子。
还可将超滤与亲和层析相结合以提高分离纯度。
其工作原理是：当溶液中欲被分离的蛋白质不受阻碍地通过超滤膜的孔隙时，如果在膜的一侧结合着亲和配基，该蛋白质就会与配基结合因而结聚在膜的这一侧。
不与配基结合的其他物质就将穿过孔而被带走。
再用适宜的洗脱剂将该蛋白质洗脱下来，洗脱液用于进一步的分离纯化。
4.泡沫分离原理：将气体通入含多种组分的溶液中，由于这些组分的表面活性由差异，因此在溶液的表面，某些组分将形成泡沫，泡沫的稳定性取决于操作条件及溶液的生物学特性。
泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的组分种类及其含量与溶液中的不相同。
这样，溶液中的组分舅得以分离。
蛋白质较易吸附与气液界面，这有利于其结构的稳定。
泡沫分离过程是：蛋白质从主体溶液中扩散到气液界面，该过程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子发生重排，一般认为在空气-水界面会形成两种类型的膜，一种是稀膜，另一种是浓膜，可能会发生由多个分子聚集在一起的现象。
在气液界面形成的蛋白质膜可以是单层的也可以是多层的。
膜的类型取决于主体溶液及气液界面上蛋白质的特性、结构和浓度。
泡沫分离的目的，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白质的浓度/最初溶液中蛋白质浓度），另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白质的提取率/最初的蛋白质质量），或使多组分混合物中某一组分的分配系数最大。
二、抽提沉淀1. 盐析常用的盐析剂是硫酸铵，其溶解度大、价格便宜。
硫酸铵沉淀蛋白质的能力很强，其饱和溶液能使大多数的蛋白质沉淀下来。
对酶没有破坏作用。
pH的控制：应从酶的溶解度与稳定性两个方面考虑，在酶等电点时其溶解度最小易沉淀，但有些酶再等电点时稳定性较差，因此要选择最佳pH值.一般要求在酶最稳定的pH值的前提下再考虑最适宜酶沉淀的pH值。
在操作中一旦确定最佳pH值后，在添加硫酸铵之前甲酸或碱调节好酶液的pH值，要尽量避免溶液pH值的波动以免破坏酶的稳定性。
在添加硫酸铵时要注意搅拌，并注意硫酸铵的加入速度，一般是由少到多，缓慢加入，硫酸铵尽可能磨成细粉。
温度的控制：有些酶在较高温度下稳定性能较好，可在常温下进行盐析操作，而对于大多数酶，尽可能在低温下操作。
酶液的净置：加完硫酸铵后，酶液要静置一段时间，使酶蛋白完全沉淀下来，酶静置后，就不要再加以搅拌。
2．有机溶剂沉淀有机溶剂选择：可用于酶蛋白沉淀的有机溶剂包括醇类物质等，如甲醇、乙醇、异丙醇。
乙醇的亲水性能较好，可防止蛋白质的变性，酶蛋白在其中的溶解度也较低。
有机溶剂沉淀操作：有机溶剂一般都使蛋白质变性，当温度较高时变性蛋白质分子就会变成永久失活。
因此用有机溶剂处理时最好在0℃以下进行。
用有机溶剂沉淀得到的酶蛋白不要放置过久，要尽快加水溶解。
3.聚合物絮凝剂沉淀聚合物絮凝剂，如葡聚糖和聚乙二醇，与酶分子争夺水分子，具有脱水作用使酶沉淀。
聚乙二醇作为一种沉淀剂的优点是在水溶液中，其浓度可达到50%，浓度为6%-12%的蛋白质大都可以沉淀下来。
这种试剂不需要低温操作，而且对蛋白质的稳定还有一定的保护作用。
聚乙二醇不会被吸附，故在离子交换吸附前不必去除。
4．用金属离子和络合物沉淀酶和其他蛋白质都会形成金属盐，其溶解度较低。
用金属离子沉淀的缺点是酶与金属离子相互作用后，可逆变化较差，尤其是用巯基衍生物，它结合的]金属离子会催化酶变性而失活。
5．用特殊试剂沉淀法用链霉素可选择性去除核酸，从而使胞内酶沉淀出来。
链霉素盐（浓度为0.5-1.0mg/mg 蛋白质）对于选择性沉淀核酸的效果比锰离子还要好，酶不易失活。
6．亲和沉淀将亲和反应的高度选择性、低处理量特性与沉淀操作的大处理量、地选择性有机结合形成了亲和沉淀技术。
将配基与可溶性载体偶联后形成载体-配基复合物，该复合物与生物分子结合后在一定条件下可以沉淀出来。
配基-载体复合物可以选择性地与蛋白质结合，溶液中的pH值、离子强度及蛋白质浓度等条件对亲和结合的影响力并不大，只有竞争性的配基会降低产物与原配基的亲和结合力，甚至使亲和结合发生逆转。
引导产生沉淀的方法有：离子交联；加入带相反电荷的聚合物；加入带相反电荷的疏水基团；改变pH值，诱导产生疏水沉淀；温度诱导产生沉淀。
亲和结合：将亲和配基加入到含有目的物蛋白质的溶液中，调节好有关沉淀的条件，使之有利于亲和结合。