第十三讲 蛋白质分子设计
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与人McAb相比，小鼠McAb容易制备， 抗原性强，但易导致人体过敏反应。 将鼠McAb抗原结合部位转移到人抗体 上， 达到与人McAb同样的效果。
抗体剪裁
1、 抗体的人源化
• 新的挑战：
改造鼠源McAb基因，综合人—鼠嵌合McAb的优点； 获得特异性高、异源性小的，具有临床应用价值的抗体。
– 将各种二级结构片段通过共价键连接到一个刚性的模板分子上，形成一 定的三级结构。 – 模板组装合成法——绕过了蛋白质三级结构设计的难关， – 再 通过改变二级结构中的AA残基来研究蛋白质中AA间的长程作用力 – 揭示蛋白质折叠规律，也是探索蛋白质全新设计规律的有效手段。
• 自动设计方法——提高了设计的速度和效率，
难以表达完成的抗体
哺乳类细胞：真核细胞表达体系，
可完成正确的蛋白质修饰和装配，更接近天然抗体，具有正常的生物活性；
缺点是成本高，操作相对烦琐。
二、蛋白质关键残基嫁接
• 蛋白质之间相互作用，往往只有几个非常关键的aa残基对结合起到主要 作用，并不是全部蛋白分子参与。思考——如何证明这一命题？
– 已发展多种方法。结合一定的规则和算法，由计算机完成设计。如：
– 运用蛋白质反向折叠方法结合遗传算法建立自动设计方法—Jones – 运用三维剖面技术结合遗传算法发展的自动设计方法——来鲁华等
3、结构检测（设计蛋白质）
– 只有实践检验，才能判断 设计是否与预想结构（结果）符合。
• 检测项目和方法：（一般从三方面） –设计的蛋白质是否为多聚体
药物—靶细胞
化学交联双特异性抗体：制备单价抗体，双功能交联剂交联。
细胞工程双特异性抗体：通过细胞融合的方法制备双特异性抗体。可将分泌
单抗的杂交瘤与经免疫的脾细胞融合，或使两种分泌不同特异性单抗的杂交
瘤彼此融合。
基因工程双特异性抗体：体外组装表达分泌型的双特异性抗体。
4、基因工程抗体基因的表达
– 蛋白质分子全新设计的一种基本方法，理解蛋白结构形成的基本规律。
– 尽量使设计序列的复杂性最小，一般仅用很少几种氨基酸，从简单到复杂 – 设计的多肽序列具有一定的对称性或周期性。。 – 用来理解蛋白质的折叠规律，如：HP模型法（蛋白质折叠研究模型）。
• 模板组装合成法 （Mutter，1988）：其思路是
• 蛋白质关键残基嫁接——实例（方法建立——来鲁华教授）
第四节 蛋白质分子全新设计
一、蛋白质分子全新设计的程序
全新设计？：基于天然蛋白质结构，以及对蛋白质结构与功能关系的认识为
基础。根据期望的结构和功能来设计全新序列的分子。
全新设计流程（7）
确定设计目标 生成初始序列
第十三讲 蛋白质分子设计 （二）
概述 部分氨基酸突变 天然蛋白质剪裁 蛋白质分子全新设计
第三节 天然蛋白质的剪裁
• 天然蛋白质的剪裁—“中改”，是指在蛋白质中替换1个肽段 或者1个结构域的分子操作技术。 – 蛋白质的立体结构可以看作由结构元件组装而成的，因此 – 将不同蛋白质之间结构元件成段地替换
– 期望能够转移相应的功能。
• “中改”操作，在新型抗体的开发中已有广泛应用。 • 谈2个问题：一是抗体剪裁，二是蛋白质关键残基嫁接
一、抗体剪裁
• 抗体的基本结构：四链结构
– 四肽链：由2条重链（H链），2条轻链（L链）组成； – 结构域：IgG ——H链4个，L链2个； – 抗体识别位点组成：由轻、重二链1个结构域的高可变区共同构成。 – 抗原决定子互补区：抗体分子可变区的一些环状肽段组成的。
双特异性抗体( BsAb)？也称双功能抗体或杂交抗体，为非天然抗体。
2个抗原结合部位，具有不同的特异性 化学结构上是双价的，结合抗原的功能上是单价的；
不同于天然抗体（在化学结构及功能上均是双价的）
BsAb具有双特异性，能交联2种抗原，可介导标记物与靶抗原结合（造影）。
双特异性抗体制备方法
• 为何要人源化？
相对于“人”杂交瘤细胞系统，“鼠”杂交瘤细胞生长快，产生抗体量 大。 鼠McAb用于人体，免疫原性和相对缺乏恒定区依赖的功能效应，使它的 Ab的作用（补充）： 应用受到了一定的限制。
识别作用：特异性与抗原分子结合 生物效应：调理作用、免疫粘联、激活补体
• 改造的必要性：
对鼠源McAb进行蛋白质工程改造，合成人源化单抗。
• 基于这种情况，我国科学家来鲁华教授课题组发展了一种“蛋白质关键残基嫁接”的方 法。
• 成功地将EPO的关键残基“嫁接”到一个结构完全不同的PH蛋白结构 域上，ERPH1蛋白具有了和EPOR结合的功能。
• 促红细胞生成素 (EPO)—受体(EPOR)相互作用，促进红细胞的分化和成熟。
来鲁华教授
北京大学化学学院长江特聘教授
• 从最简单的二级结构开始，摸索蛋白质结构稳定的规律。 • 设计目标：在超二级结构和三级结构设计中，一般选择天然 蛋白质结构中一些比较稳定的模块。 • 如：四螺旋束和锌指结构等。
– 功能设计方面：
• 主要进行天然蛋白质功能的模拟， • 如：金属结合蛋白和离子通道等。
2、设计方法（3种）
• 序列最简化法：
概述：
蛋白质的表达系统有很多，其中主要包括大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物类细胞、
昆虫细胞及植物细胞等表达系统。
抗体分子表达：常用大肠杆菌和哺乳类细胞。
大肠杆菌：原核细胞表达系统。
成熟的基因克隆、蛋白表达体系，具有繁殖迅速、易于操作控制等优点。 缺乏蛋白质加工系统，内源性蛋白酶易降解外源蛋白，内毒素导致人体热源反应 仅可用于表达抗体片段，如单链抗体等。
•
•
发展了用于 蛋白质-蛋白质相互作用定量研究的 平均势方法。
有关蛋白质表面环区结构预测及蛋白质设计、基于结构的药物设计等程序目前在国际 上拥有900多家注册用户。 详细情况加附页——略
个人简历是自己的经历！如何写好，关键做好！
本节小结
• 天然蛋白质的剪裁，又称蛋白结构的“中改”，是指在蛋白质中肽段或
• 下面介绍各级结构设计的原则
– 从四个方面讲述
1、二级结构的设计（ α 、 β 、T） （1）螺旋的设计
• 排阻色谱法——判断分子以几聚体形式
–二级结构含量是否与目标符合
• CD法——检测各二级结构的大致含量
–是否具有预定的三级结构。
• 主要依靠NMR技术和荧光分析（下面介绍）； • 也可使用X射线晶体衍射技术分析。
二、蛋白质结构的全新设计
• 核心问题：如何确定一个既非常稳定而又具有独特的空间结构的序列。
者结构域替换和拼接。
• 蛋白质的立体结构是由结构元件组装而成的，通过不同蛋白质之间结构 元件替换和拼接。期望能够转移相应的功能和特性。
• 本节主要通过抗体分子的拼接和改进进行了论述。
– 抗体的人源化（恒定区，CDR区） – 抗体的小分子化：双链（Fab和Fv）、单链（ Fab和Fv ）、双价抗体片段 – 双特异性抗体
③
单链抗体（ScFv）：将轻链和重链的可变区连接起来的抗体。1条肽链
单价抗体的特点：
优点：分子量小，免疫原性弱、渗透力强，并可用于药物导向、中和毒素等功能。 缺点：无抗体C区，不能介导抗体的其他生物学效应。
④ 双价抗体片段：利用单价抗体片段构建双价单特异性抗体和双价多特异性抗体。
3、双特异性抗体（完整抗体）
学历 进修 贡献
来鲁华教授
承担过国家自然科学青年基金，国家杰出青年基金，攀登计划（国家基础研究重大 计划）项目，八六三项目等。国家自然科学三等奖1次，求是基金会青年科学家奖 励，中国科协青年科技奖等。发表论文近百篇，其中SCI收录论文80余篇。
研究方向与兴趣
• • 1987年开始从事化学与生物学的交叉研究， 特别是生物信息学研究，在蛋白质结构预测及分子设计方面做过大量工作。近年的主 要工作方向为蛋白质-蛋白质相互作用研究，
长江学者奖励计划：国家教育部与香港爱国实业家李嘉诚基金会
来鲁华，博士，教授
头衔
北京大学化学学院长江学者特聘教授， 北京大学理论生物学中心常务副主任， 分子动态与稳态国家重点实验室主任， 国家杰出青年基金获得者。
1984年，本科毕业于北京大学化学系。 1989年，在北京大学化学系获博士学位。 1998-1999年，美国加州大学伯克莱分校伯克莱学者。
必须进行互补决定区序列与框架结构的移植设计。
移植设计的原则
① 将CDR序列和紧邻两侧的骨架序列一起移植；
②
③
对骨架区中影响抗原结合部位的aa残基改为鼠源McAb的残基；
人McAb可变区序列的选择：抗体可变区序列数据库分析，选择与鼠 单克隆抗体同源性高的人源序列；
④
⑤
保留可变区N末端aa序列，尤其是轻链可变区N末端序列。
将人改型可变区基因与人lg恒定区基因连接，构成完整的人改型基因 进行表达。
2、抗体的小分子化改造
小分子抗体？能与抗原结合的抗体小分子V区片段——称~，具识别活性
主要包括4类
①
Fab抗体：酶水解法：用木瓜水解酶消化抗体可获得2个Fab片段。2条肽链
基因工程方法：在Fab基因表达Fab片段的功能。H链和L链基因分别构建，在2个载体上，
结构预测
构建模型 对序列进行初步的优化
基因表达全新蛋白质
结构和功能检测
进一步设计
主要介绍三个环节→
设计目标的选择 设计方法 结构检测
蛋白质设计一般都要经过反复多次 设计一合成一检测一再设计的过程。
1、设计目标的选择
• 蛋白质全新设计分类：（两个方面）。
– 功能设计和结构设计。 – 重点和难点：结构设计。Why？ • 设计思路： – 结构设计方面：
VH
CH1
HC LC
VL
CL CH2 CH3CH3
Mouse
Human
Chimeric
（2）人改型抗体（互补决定区移植）
问题提出：
人源化嵌合抗体的可变区仍具有抗原性。能诱发人产生抗小鼠抗体，导
致过敏反应，需对人源化抗体的可变区再进行改造。
抗体可变区组成：
互补决定区（CDR）和骨架区 组成。 CDR：识别抗原表位的区域，直接
– 克服的基本障碍：线性聚合链的构象熵。熵增（ΔS）？
– 序列（正确）折叠的相互作用（力），必须超过（大于）构象熵。？
– 设计时，使具有相互作用力的AA数目与强度达到最大。
• 设计原则和经验：
– Cys残基形成二硫键的配对无法预测，一般都尽量少用甚至不用，特别是
在自动设计方法中。 – 序列完成预定折叠后，再引入二硫键来稳定蛋白质的三级结构。 – 色氨酸吲哚环具有生色性，与其所处环境有关，常以Trp做探针？ – Trp 在天然态蛋白质分子内部，其荧光光谱发生蓝移。（？） – 在全新设计中常引入Trp作为荧光探针以检验设计蛋白质的三级结构。
抗原表位
抗体识别位点
一、抗体剪裁
• 人—鼠嵌合抗体的制备（思路）
– 利用分子剪裁技术对抗体分子进行剪裁的成功实例
——实验英国剑桥大学的Winter等。
– 将小鼠单抗的V区，换到人抗体分子的相应部位上，
– 使小鼠单抗所具备的抗原结合专一性转移到人的抗体分子上。
• 单克隆抗体（单抗，McAb）？ • 抗体剪裁的医学价值
共转染细胞，或者构建在一个载体上转染细胞进行表达。
②ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Fv抗体：Fv是由轻链和重链可变区组成的单价小分子，是与抗原结合的最小功
能片段。 2条肽链
分别构建含H和L可变区基因的载体，共转染细胞，使之各自表达后组装成功能性Fv分子；或 在一个载体中H可变区和L可变区基因之间设置终止密码子，分别表达2个小分子片段。
（1）鼠单克隆抗体恒定区的人源化 – 将小鼠McAb恒定区用人抗体恒定区代替而拼接成嵌合抗体，既 具有抗原结合特异性，又极大地降低了鼠单克隆抗体的异源性。
改造策略和程序： ① 克隆鼠McAb可变区基因——从鼠杂交瘤 • 提取mRNA→可变区基因cDNA文库→ 表达载体→抗原特异性筛选 →可变区基因； ② 选择合适的人恒定区基因； • 恒定区基因比较保守，易于克隆获得 ③ 重组载体的构建与表达 • 抗体分子的糖基化和可变区的折叠、链内二硫键形成， • 以及重链和轻链相互作用形成正确的立体构象。 • 常用哺乳类细胞表达系统
决定了抗体的特异性；骨架区 ——维持CDR构象
骨架区序列及其立体结构较为保守，是嵌合抗体诱导人抗小鼠抗体的主 要原因； 将鼠McAb CDR移植到人McAb的可变区的骨架上，使人McAb获得鼠 McAb结合特异性，进一步减少异源性。
互补决定区移植的设计
简单地将CDR序列移植到人源抗体中，甚至完全丧失亲和力。
抗体剪裁
1、 抗体的人源化
• 新的挑战：
改造鼠源McAb基因，综合人—鼠嵌合McAb的优点； 获得特异性高、异源性小的，具有临床应用价值的抗体。
– 将各种二级结构片段通过共价键连接到一个刚性的模板分子上，形成一 定的三级结构。 – 模板组装合成法——绕过了蛋白质三级结构设计的难关， – 再 通过改变二级结构中的AA残基来研究蛋白质中AA间的长程作用力 – 揭示蛋白质折叠规律，也是探索蛋白质全新设计规律的有效手段。
• 自动设计方法——提高了设计的速度和效率，
难以表达完成的抗体
哺乳类细胞：真核细胞表达体系，
可完成正确的蛋白质修饰和装配，更接近天然抗体，具有正常的生物活性；
缺点是成本高，操作相对烦琐。
二、蛋白质关键残基嫁接
• 蛋白质之间相互作用，往往只有几个非常关键的aa残基对结合起到主要 作用，并不是全部蛋白分子参与。思考——如何证明这一命题？
– 已发展多种方法。结合一定的规则和算法，由计算机完成设计。如：
– 运用蛋白质反向折叠方法结合遗传算法建立自动设计方法—Jones – 运用三维剖面技术结合遗传算法发展的自动设计方法——来鲁华等
3、结构检测（设计蛋白质）
– 只有实践检验，才能判断 设计是否与预想结构（结果）符合。
• 检测项目和方法：（一般从三方面） –设计的蛋白质是否为多聚体
药物—靶细胞
化学交联双特异性抗体：制备单价抗体，双功能交联剂交联。
细胞工程双特异性抗体：通过细胞融合的方法制备双特异性抗体。可将分泌
单抗的杂交瘤与经免疫的脾细胞融合，或使两种分泌不同特异性单抗的杂交
瘤彼此融合。
基因工程双特异性抗体：体外组装表达分泌型的双特异性抗体。
4、基因工程抗体基因的表达
– 蛋白质分子全新设计的一种基本方法，理解蛋白结构形成的基本规律。
– 尽量使设计序列的复杂性最小，一般仅用很少几种氨基酸，从简单到复杂 – 设计的多肽序列具有一定的对称性或周期性。。 – 用来理解蛋白质的折叠规律，如：HP模型法（蛋白质折叠研究模型）。
• 模板组装合成法 （Mutter，1988）：其思路是
• 蛋白质关键残基嫁接——实例（方法建立——来鲁华教授）
第四节 蛋白质分子全新设计
一、蛋白质分子全新设计的程序
全新设计？：基于天然蛋白质结构，以及对蛋白质结构与功能关系的认识为
基础。根据期望的结构和功能来设计全新序列的分子。
全新设计流程（7）
确定设计目标 生成初始序列
第十三讲 蛋白质分子设计 （二）
概述 部分氨基酸突变 天然蛋白质剪裁 蛋白质分子全新设计
第三节 天然蛋白质的剪裁
• 天然蛋白质的剪裁—“中改”，是指在蛋白质中替换1个肽段 或者1个结构域的分子操作技术。 – 蛋白质的立体结构可以看作由结构元件组装而成的，因此 – 将不同蛋白质之间结构元件成段地替换
– 期望能够转移相应的功能。
• “中改”操作，在新型抗体的开发中已有广泛应用。 • 谈2个问题：一是抗体剪裁，二是蛋白质关键残基嫁接
一、抗体剪裁
• 抗体的基本结构：四链结构
– 四肽链：由2条重链（H链），2条轻链（L链）组成； – 结构域：IgG ——H链4个，L链2个； – 抗体识别位点组成：由轻、重二链1个结构域的高可变区共同构成。 – 抗原决定子互补区：抗体分子可变区的一些环状肽段组成的。
双特异性抗体( BsAb)？也称双功能抗体或杂交抗体，为非天然抗体。
2个抗原结合部位，具有不同的特异性 化学结构上是双价的，结合抗原的功能上是单价的；
不同于天然抗体（在化学结构及功能上均是双价的）
BsAb具有双特异性，能交联2种抗原，可介导标记物与靶抗原结合（造影）。
双特异性抗体制备方法
• 为何要人源化？
相对于“人”杂交瘤细胞系统，“鼠”杂交瘤细胞生长快，产生抗体量 大。 鼠McAb用于人体，免疫原性和相对缺乏恒定区依赖的功能效应，使它的 Ab的作用（补充）： 应用受到了一定的限制。
识别作用：特异性与抗原分子结合 生物效应：调理作用、免疫粘联、激活补体
• 改造的必要性：
对鼠源McAb进行蛋白质工程改造，合成人源化单抗。
• 基于这种情况，我国科学家来鲁华教授课题组发展了一种“蛋白质关键残基嫁接”的方 法。
• 成功地将EPO的关键残基“嫁接”到一个结构完全不同的PH蛋白结构 域上，ERPH1蛋白具有了和EPOR结合的功能。
• 促红细胞生成素 (EPO)—受体(EPOR)相互作用，促进红细胞的分化和成熟。
来鲁华教授
北京大学化学学院长江特聘教授
• 从最简单的二级结构开始，摸索蛋白质结构稳定的规律。 • 设计目标：在超二级结构和三级结构设计中，一般选择天然 蛋白质结构中一些比较稳定的模块。 • 如：四螺旋束和锌指结构等。
– 功能设计方面：
• 主要进行天然蛋白质功能的模拟， • 如：金属结合蛋白和离子通道等。
2、设计方法（3种）
• 序列最简化法：
概述：
蛋白质的表达系统有很多，其中主要包括大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物类细胞、
昆虫细胞及植物细胞等表达系统。
抗体分子表达：常用大肠杆菌和哺乳类细胞。
大肠杆菌：原核细胞表达系统。
成熟的基因克隆、蛋白表达体系，具有繁殖迅速、易于操作控制等优点。 缺乏蛋白质加工系统，内源性蛋白酶易降解外源蛋白，内毒素导致人体热源反应 仅可用于表达抗体片段，如单链抗体等。
•
•
发展了用于 蛋白质-蛋白质相互作用定量研究的 平均势方法。
有关蛋白质表面环区结构预测及蛋白质设计、基于结构的药物设计等程序目前在国际 上拥有900多家注册用户。 详细情况加附页——略
个人简历是自己的经历！如何写好，关键做好！
本节小结
• 天然蛋白质的剪裁，又称蛋白结构的“中改”，是指在蛋白质中肽段或
• 下面介绍各级结构设计的原则
– 从四个方面讲述
1、二级结构的设计（ α 、 β 、T） （1）螺旋的设计
• 排阻色谱法——判断分子以几聚体形式
–二级结构含量是否与目标符合
• CD法——检测各二级结构的大致含量
–是否具有预定的三级结构。
• 主要依靠NMR技术和荧光分析（下面介绍）； • 也可使用X射线晶体衍射技术分析。
二、蛋白质结构的全新设计
• 核心问题：如何确定一个既非常稳定而又具有独特的空间结构的序列。
者结构域替换和拼接。
• 蛋白质的立体结构是由结构元件组装而成的，通过不同蛋白质之间结构 元件替换和拼接。期望能够转移相应的功能和特性。
• 本节主要通过抗体分子的拼接和改进进行了论述。
– 抗体的人源化（恒定区，CDR区） – 抗体的小分子化：双链（Fab和Fv）、单链（ Fab和Fv ）、双价抗体片段 – 双特异性抗体
③
单链抗体（ScFv）：将轻链和重链的可变区连接起来的抗体。1条肽链
单价抗体的特点：
优点：分子量小，免疫原性弱、渗透力强，并可用于药物导向、中和毒素等功能。 缺点：无抗体C区，不能介导抗体的其他生物学效应。
④ 双价抗体片段：利用单价抗体片段构建双价单特异性抗体和双价多特异性抗体。
3、双特异性抗体（完整抗体）
学历 进修 贡献
来鲁华教授
承担过国家自然科学青年基金，国家杰出青年基金，攀登计划（国家基础研究重大 计划）项目，八六三项目等。国家自然科学三等奖1次，求是基金会青年科学家奖 励，中国科协青年科技奖等。发表论文近百篇，其中SCI收录论文80余篇。
研究方向与兴趣
• • 1987年开始从事化学与生物学的交叉研究， 特别是生物信息学研究，在蛋白质结构预测及分子设计方面做过大量工作。近年的主 要工作方向为蛋白质-蛋白质相互作用研究，
长江学者奖励计划：国家教育部与香港爱国实业家李嘉诚基金会
来鲁华，博士，教授
头衔
北京大学化学学院长江学者特聘教授， 北京大学理论生物学中心常务副主任， 分子动态与稳态国家重点实验室主任， 国家杰出青年基金获得者。
1984年，本科毕业于北京大学化学系。 1989年，在北京大学化学系获博士学位。 1998-1999年，美国加州大学伯克莱分校伯克莱学者。
必须进行互补决定区序列与框架结构的移植设计。
移植设计的原则
① 将CDR序列和紧邻两侧的骨架序列一起移植；
②
③
对骨架区中影响抗原结合部位的aa残基改为鼠源McAb的残基；
人McAb可变区序列的选择：抗体可变区序列数据库分析，选择与鼠 单克隆抗体同源性高的人源序列；
④
⑤
保留可变区N末端aa序列，尤其是轻链可变区N末端序列。
将人改型可变区基因与人lg恒定区基因连接，构成完整的人改型基因 进行表达。
2、抗体的小分子化改造
小分子抗体？能与抗原结合的抗体小分子V区片段——称~，具识别活性
主要包括4类
①
Fab抗体：酶水解法：用木瓜水解酶消化抗体可获得2个Fab片段。2条肽链
基因工程方法：在Fab基因表达Fab片段的功能。H链和L链基因分别构建，在2个载体上，
结构预测
构建模型 对序列进行初步的优化
基因表达全新蛋白质
结构和功能检测
进一步设计
主要介绍三个环节→
设计目标的选择 设计方法 结构检测
蛋白质设计一般都要经过反复多次 设计一合成一检测一再设计的过程。
1、设计目标的选择
• 蛋白质全新设计分类：（两个方面）。
– 功能设计和结构设计。 – 重点和难点：结构设计。Why？ • 设计思路： – 结构设计方面：
VH
CH1
HC LC
VL
CL CH2 CH3CH3
Mouse
Human
Chimeric
（2）人改型抗体（互补决定区移植）
问题提出：
人源化嵌合抗体的可变区仍具有抗原性。能诱发人产生抗小鼠抗体，导
致过敏反应，需对人源化抗体的可变区再进行改造。
抗体可变区组成：
互补决定区（CDR）和骨架区 组成。 CDR：识别抗原表位的区域，直接
– 克服的基本障碍：线性聚合链的构象熵。熵增（ΔS）？
– 序列（正确）折叠的相互作用（力），必须超过（大于）构象熵。？
– 设计时，使具有相互作用力的AA数目与强度达到最大。
• 设计原则和经验：
– Cys残基形成二硫键的配对无法预测，一般都尽量少用甚至不用，特别是
在自动设计方法中。 – 序列完成预定折叠后，再引入二硫键来稳定蛋白质的三级结构。 – 色氨酸吲哚环具有生色性，与其所处环境有关，常以Trp做探针？ – Trp 在天然态蛋白质分子内部，其荧光光谱发生蓝移。（？） – 在全新设计中常引入Trp作为荧光探针以检验设计蛋白质的三级结构。
抗原表位
抗体识别位点
一、抗体剪裁
• 人—鼠嵌合抗体的制备（思路）
– 利用分子剪裁技术对抗体分子进行剪裁的成功实例
——实验英国剑桥大学的Winter等。
– 将小鼠单抗的V区，换到人抗体分子的相应部位上，
– 使小鼠单抗所具备的抗原结合专一性转移到人的抗体分子上。
• 单克隆抗体（单抗，McAb）？ • 抗体剪裁的医学价值
共转染细胞，或者构建在一个载体上转染细胞进行表达。
②ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Fv抗体：Fv是由轻链和重链可变区组成的单价小分子，是与抗原结合的最小功
能片段。 2条肽链
分别构建含H和L可变区基因的载体，共转染细胞，使之各自表达后组装成功能性Fv分子；或 在一个载体中H可变区和L可变区基因之间设置终止密码子，分别表达2个小分子片段。
（1）鼠单克隆抗体恒定区的人源化 – 将小鼠McAb恒定区用人抗体恒定区代替而拼接成嵌合抗体，既 具有抗原结合特异性，又极大地降低了鼠单克隆抗体的异源性。
改造策略和程序： ① 克隆鼠McAb可变区基因——从鼠杂交瘤 • 提取mRNA→可变区基因cDNA文库→ 表达载体→抗原特异性筛选 →可变区基因； ② 选择合适的人恒定区基因； • 恒定区基因比较保守，易于克隆获得 ③ 重组载体的构建与表达 • 抗体分子的糖基化和可变区的折叠、链内二硫键形成， • 以及重链和轻链相互作用形成正确的立体构象。 • 常用哺乳类细胞表达系统
决定了抗体的特异性；骨架区 ——维持CDR构象
骨架区序列及其立体结构较为保守，是嵌合抗体诱导人抗小鼠抗体的主 要原因； 将鼠McAb CDR移植到人McAb的可变区的骨架上，使人McAb获得鼠 McAb结合特异性，进一步减少异源性。
互补决定区移植的设计
简单地将CDR序列移植到人源抗体中，甚至完全丧失亲和力。