高效液相色谱法定性定量分析课件

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3．利用紫外检测器全波长扫描功能定性
紫外检测器是液相色谱中使用最广泛的一种检测器。 全波长扫描紫外检测器可以根据被检测化合物的紫外光谱 图提供一些有价值的定性信息。
传统的方法是在色谱图上某组分的色谱出现极大值即 最高浓度时，通过停泵等手段，使组分在检测池中滞留， 然后对检测池中的组分进行全波长扫描，得到该组分的紫 外—可见光谱图；再取可能的标准样品按同样方法处理。 对比两者光谱图即能鉴别出该组分与标准样品是否相同。 对于某些有特殊紫外谱图的化合物，也可以通过对照标准 谱图的方法来识别化合物。
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定量分析
1.归一化法 归一化法要求所有组分都能分离并有响应。
由于液相色谱所用检测器为选择性检测器，对 很多组分没有响应，因此液相色谱法较少使则 归一化法。
2.外标法 外标法是以待测组分纯品配制标准试样和
待测试样同时作色谱分析来进行比较而定量的， 可分为标准曲线法和直接比较法。
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HPLC的固定相和流动相
固定相：即所说的基质或者单体，可以是 陶瓷的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。 无机物基质主要是硅胶和氧化铝，在溶剂中不 容易膨胀，有机聚合物基质主要是交联苯乙烯 -二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有机聚合物刚 性小、易被压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基 质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最 终使柱效降低。
高效液相色谱法（HPLC） 及定性定量分析
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提纲
• 一﹑HPLC系统简介 • 二﹑HPLC中的固定相和流动相 • 三﹑应用范围 • 四﹑定量定性分析
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一、HPLC系统
HPLC系统
输进
色
检
数据
液样
谱
测
记录 及处
泵器
柱
器
理
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HPLC示意图
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输液泵
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定性分析wenku.baidu.com
常用的液相色谱定性方法有： 1. 1. 利用已知标准样品定性
利用标淮样品对未知化合物定性是最常用 的液相色谱定性方法。由于每一种化合物在 特定的色谱条件下（流动相组成、色谱柱、 桂温等相同），其保留值具有特征性，因此 可以利用保留值进行定性。
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2．利用检测器的选择性定性
输液泵：
输液泵是HPLC系统中的重要部件之一， 泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和
分析结果的可靠性。
泵应具有的性质： 1. 流量稳定； 2. 流量范围宽； 3. 输出压力高； 4. 液缸容积小； 5. 密封性能好，耐腐蚀。
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操作时的注意事项：
1. 防止任何固体微粒进入泵；
2. 流动相不含有任何腐蚀性物质；
同一种检测器对不同种类的化合物的响应 值是不同的，而不同的检测器对同一种化合物 的响应也是不同的。所以当某一被测化合物同 时被两种或两种以上检测器检测时，两个或几 个检测器对被测化合物的检测灵敏度比值是与 被测化合物的性质密切相关的，可以用来对被 测化合物进行定性分析，这就是双检测器定件 体系的基本原理。
2.纯度；
3.必须与检测其匹配；
4.粘度要低；
5.对样品的溶解度要适宜；
6.样品易于回收。
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应用范围
高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发 的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极 性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产 物；合成的和天然的高分子化合物等。它们涉 及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工 产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的 80％。其余20％的有机化合物，包括永久性 气体，易挥发低沸点及中等分子量的化合物， 只能用气相色谱法进行分析。
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检测器
检测器是HPLC系统的三大关键部件 之一，作用是把洗脱液中的组分的量转 化为电信号。HPLC的检测器要求是灵敏 度高，噪音低，线性范围宽，重复性好， 适用范围广等特点。
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数据记录及处理
目前对于数据记录及处理所采用的是计算 机，计算机的广泛应用使得HPLC操作更加 迅速，简便，准确，精密和自动化，现在已 经可以在互联网上远程处理数据，目前计算 机在HPLC上的用途主要由： 1. 采集处理和分析数据； 2. 控制仪器； 3. 色谱系统优化和专家系统。
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3.内标法
内标法是比较精确的一种定量方法。它是
将已知量的参比物（内标物）加到已知量的试 样中．那么试样中参比物的浓度为已知；在进 行色谱测定之后，待测组分峰面积和参比物峰 面积之比应该等于待测组分的质量与参比物质 量之比，求出待测组分的质量，进而求出待测 组分的含量。
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谢谢大家!!!
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固定相的种类： 1. 硅胶 2. 氧化铝 3. 聚合物 4. 固定相的选择：（+++表示好，++表示一般，+表示差）
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流动相：
一个理想的流动相溶剂应具有低粘度、与
检测其兼容性好、易于得到纯品和低毒性的特 征。
选择流动相要考虑的因素：
1.流动相应不改变填料的任何性质；
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3. 工作时要注意溶剂瓶中的溶剂用完；
4. 泵的工作压力不能大于规定的最大压力；
5. 流动相要先进行脱气，防止产生气泡。
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进样器
进样器：
目前采用较多的是六通
进样阀和自动进样器。
对进样装置的要求：
密封性好，死体积小，
重复性好，保证中心进样，
进样时对色谱系统的压力、
流量影响小。
进样方式可分为：
隔膜进样、停流进样、阀进
样、自动进样。目前应用做多的
是阀进样和自动进样。
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色谱柱的要求：
色谱柱
柱效高、选择性好，分析速 度快等。市售的用于HPLC的各种 微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶 为基质的键合相、氧化铝、有机 聚合物微球(包括离子交换树脂)、 多孔碳等，其粒度一般为3，5， 7，10μm等，柱效理论值可达5～ 16万/米。对于一般的分析只需 5000塔板数的柱效;对于同系物分 析，只要500即可;对于较难的分 离物质对则可采用高达2万的柱 子，因此一般10～30CM左右的 柱长就能满足复杂混合物分析的 需要。