药物对豚鼠离体肠平滑肌的作用及PA2、PD2测定的实验方案

中药学院综合设计性实验方案 中药学院综合设计性实验方案
学生学号、姓名： 2006038068 苏鹤桂 桃 2006038062 彭冠 2006038071 谭柏森 2006038102 钟润
2006038075 王衍栋
年级、专业： 06 药学
实验课程名称：药物对豚鼠离体肠平滑肌的作用及 PA2、PD2 测定 实验分组号： 填写日期： 09.11.11.
近视。ACh 尚可作用于自主神经节和骨骼肌的神经肌肉接头的胆碱受体，引起 交感、副交感神经节兴奋，肌肉收缩。由于 ACh 不易进入中枢，故尽管中枢神 经系统有胆碱受体存在，但外周给药很少产生中枢作用。临床常见药物有卡巴胆 碱，毛果芸香碱，氯贝胆碱等。
（三）M 受体对胃肠道的研究状况 1）作用机制 M受体广泛分布在全身各平滑肌中，包括胃肠道，它在维持全身平滑肌收缩 状态时起主要作用。 分布在肌纤维膜上的M受体亚型主要为M1和M2其中M2数量 占75%-80%，但M3受体是主要的功能类型。许多实验表明，当离体的胃肠平滑 肌束接触M兴奋剂时，所引起的收缩对M受体竞争性拮抗剂敏感，这种现象与 M3激活机制一致。 这种情况可用下述机制解释： M3受体与GQ家族的G蛋白耦联， 导致磷脂酶C活化、磷酸肌醇水解，促使三磷酸肌醇和1,2-二酰基甘油水平增高， 从而引起钙离子动员，即肌浆网内储存钙离子释放，胞浆内钙离子增多，触发平 滑肌收缩。DG水平的增高可激活蛋白激酶C，而使其发生重分布至胞膜，产生 磷酸化功能。在大多数情况下，M1,M3,M5亚型的磷酸肌醇反应对PTX不敏感。 而M2亚型与GI家族的G蛋白相互作用，介导PTX 敏感性的针对CAMP聚集的抑 制反应。M2,M4受体也可通过直接耦联GI,GO蛋白来介导内向整流钾通道的激活 和神经元钙通道的抑制，这些离子反应也表现为PTX敏感性。 2) M受体在小肠的分布和介导作用 1986 年CHOO等采用放射配体法发现M2受体在回肠分布的高度优势倾向。 此后，许多实验表明在小肠全层组织中均存在M2,M3受体，其中M2受体比例占 多数，M3受体数量大约仅占M2受体1/4。比如，MICHEL等用［3H］-联苯乙酰 氧基甲基六氢吡啶 (M3配体）选择性标记豚鼠回肠纵肌层内的M3受体，发现M3 受体密度较低。在豚鼠、大鼠、狗和人的在体、离体及单个平滑肌细胞众多实验 中均发现，M3受体是调节小肠平滑肌收缩的主要受体。有实验表明， M3受体 特异性拮抗剂等对兔和豚鼠回肠的亲和力与M3受体的活化一致。另外，选择性 M 受体烷基化和脱敏实验也表明，M3受体在标准条件下介导回肠收缩，包括纵 肌层和环肌层。也有实验证实，M3受体是调节狗小肠移行性运动复合波的主要 受体。这些实验的对象大多是全层平滑肌，而有人提出环肌和纵肌的收缩机制可 能不一样。SHI等在分别分析狗小肠环肌和纵肌实验后发现，虽然M3受体是调节 环肌收缩的主要受体，但M2,M3均参与纵肌的收缩，因为M2受体拮抗剂在离体 或在体实验中用较低浓度即可显著抑制纵肌收缩，而对环肌无明显影响。
2、PA2、PD2 值 PA2 是一种用以表示竞争性拮抗剂作用强度的指标， 其意义是能使激动剂 提高到原来的 2 倍时，可产生与原来浓度相同效应所需的拮抗剂克分子浓度的 负对数(-log(B))。PA2 的值越大说明拮抗剂的作用越强。pA2 是拮抗参数(ant agonism parameter)：当有一定浓度的拮抗药存在时，激动剂增加 2 倍时才能 达到原来效应，此时拮抗药的负对数即拮抗参数， pA2 = -log[I] = -logKI PD2：是激动剂与受体亲和力的定量表示。按照Ariens的定义，PD2是产 生50％最大效应(E=1／2Emax)的摩尔浓度的负对数(-log[D])。PD2值越大，说 明药物和受体的亲和力越大，药效越强。计算方法与PA2相似
1．离体肠肌的制备 猛击豚鼠头部至昏，立即剖开腹腔，自幽门下 5cm 剪取空肠和回肠上段， 迅速置于台氏液液中。 小心剪去肠系膜， 用吸管吸取台氏液液缓慢冲洗肠内容物； 将空肠段分割成 2 cm 的小段备用，然后用缝针在肠段两端各穿一根线，作为固 定肠肌之用。 2．实验装置 将制成的标本一端固定于通气钩上，另一端连接于肌力换能器并接入 PowerLab 系统的桥式放大器上，浴池内放 20ml 台氏液液，加 500mg 负荷，恒 温 37±1°C，浴池内持续通入 95％O2 与 5％CO2 的混合气体。 3．累积剂量－效应曲线的制作 实验装置完毕以后，打开 PowerLab 系统，按“操作指南”设置参数： （1）选择 channel 1 （2）记录速度 10 /s （3）Bridge Amplifer 中“rang”选择 20 mv，“Low Pass”选择 50 Hz （4）调零“zero” 描记肠肌收缩曲线，待收缩基线平稳后，按下列（表 6-2）次序在浴池中加 入预先配好的不同分子浓度的乙酰胆碱。 表 6-2 累加次 序 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 药液浓度 药液的毫升数（ml） （mol/L） 10-6 10-6 10-5 10-5 10-4 10-4 10-3 10-3 10-2 10-2 0.2 0.4 0.14 0.4 0.14 0.4 0.14 0.4 0.14 0.4 （µmol） 0.01 0.03 0.1 0.3 1 3 10 30 100 300 累积剂量法加药顺序 每 L 中累积剂量
－Log KD 即 pD2
斜率b = 1 E max
E max =
1 b
K a = D × E max = K D b E max
根据公式 pA2 = pAx + log (x-1)，式中 pAx 为拮抗剂摩尔浓度的负对数，x 为 用拮抗剂后与用拮抗剂前 KD 之比。
实验安排 2009/11/2-2009/11/20 2009/11/30～2009/12/1 2009/12/2～2009/12/3 2009/12/4 制定实验方案，并对方案进行陈述
实验材料
乙酰胆碱（mol/L） ：10-6、10-5、10-4、10-3、10-2 阿托品（mol/L） ：3×10-7 台 氏 液 配 制 1000ml 台 氏 液 含 ： NaCl 8.0g、 10% KCl 2.0ml(0.2g)、 10% MgSO4.7H2O 2.6ml(0.26g)、 5% NaH2PO4 .2 H2O 1.3ml(0.065g)、 NaHCO3 1.0g、1M CaCL2 1.8ml（0.2g） 、葡萄糖 1.0g。 离体器官浴池及恒温装置、PowerLab 系统、混合气体（95％O2＋5％CO2） 、负 荷 500 mg、加液器、培养皿、缝针、线、眼科镊子、剪刀。 【实验步骤】
实验名 称
药物对豚鼠离体肠平滑肌的作用及 PA2、PD2 测定
项目背景（实验的目的、 项目背景（实验的目的、意义，以及欲解决的问题和国内外研究现状） 以及欲解决的问题和国内外研究现状） 实验的目的 1. 建立豚鼠离体肠平滑肌实验模型； 2. 观察阿托品对乙酰胆碱的竞争性拮抗作用 3. 掌握 pA2、pD2 值的测定方法 实验意义 1 建立方法研究药物拮抗作用 2 掌握 pA2、pD2 值的测定方法 国内外研究现状分析 （一）阿托品对胃肠道的研究状况 阿托品可以抑制受体节后胆碱能神经支配的平滑肌与腺体活动，并根据 本品剂量大小，有刺激或抑制中枢神经系统作用。解毒系在 M-胆碱受体部 位拮抗胆碱酯酶抑制剂的作用, 如增加气管、肠道系粘液腺与唾液腺的分 泌，肠道平滑肌挛缩，以及植物神经节受刺激后的亢进。此外，阿托品能 兴奋或抑制中枢神经系统，具有一定的剂量依赖性。对心脏、肠和肠道平 滑肌作用比其他颠茄生物碱更强而持久。 （二）乙酰胆碱的研究状况 ACh 可明显兴奋胃肠道，使其收缩幅度、张力增加，胃、肠平滑肌蠕动增 加，并可促进胃、肠分泌，导致恶心、嗳气、呕吐、腹痛及排便等症状。Ach 还 可使泪腺、 气管和肠道腺体、 唾液腺、 消化道腺体和汗腺分泌增加， 使肠道收缩， 颈动脉和主动脉体化学受体兴奋。当 ACh 局部滴眼时，可致瞳孔收缩，调节于
[D ] KD 1 = + [D ] E E max E max (y) (a) (b)
(x)
式中：D 为药物剂量（浓度） 为某一剂量的效应，KD 为药物的解离常数， ，E Emax 为药物的最大效应。 以[D]/E 为纵坐标，[D]为横坐标进行直线回归。
截距a = KD E max
按直线公式 y = a + bx，则
随药液的依次加入，浴池内药物浓度不断提高。每加入一个剂量后，约经数 秒钟肠肌的收缩达高峰。应在高峰未下降前，迅速加入下一个剂量。当反应到一 定高峰，再递增剂量，效应不再增加，此时的效应为最大效应。 4．阿托品拮抗乙酰胆碱的剂量－效应曲线的制作 放去浴池中的液体，用台氏液液冲洗三次，以后每隔 10min 冲洗一次，共冲 洗三次，再加入台氏液液至 20ml。待收缩基线平稳后，加入阿托品 3X10－7 mol/L 0.2ml，培育 15min，再按“方法 3”依次加入不同浓度的乙酰胆碱，便可得到有拮 抗剂时乙酰胆碱的累积剂量效应曲线，此时拮抗剂（阿托品）摩尔浓度的负对数 即 pAx。 【统计与处理】 1．绘制累积剂量效应曲线 取方格纸，以肠肌收缩幅度（mv）作为纵坐标即效应（E） ，以药物对数浓 度（lg C）为横坐标，绘制量效曲线。 KD 值即达到 50％最大效应时，在横坐标上所对应的药物浓度。 药物的最大效应（Emax）即曲线的高度。当比较同类药物的 Emax 时，即 比较曲线的高度（肠肌收缩最大幅度） 。 2．直线回归（LR）计算参数 为了正确求得各参数，必须将曲线直线化。可按 D/R 式（改良 Lineweaver －Burk 式）使剂量效应曲线直线化。
二、实施方案（包括实验的原理或技术路线、实验器材与药品、具体操作过程、 实施方案（包括实验的原理或技术路线、实验器材与药品、具体操作过程、 每个成员的具体分工、实验的进程安排等） 每个成员的具体分工、实验的进程安排等） 实验原理
1、
激动药与拮抗药
（1）.激动药(agonist)：与受体有亲和力又有内在活性药物。 完全激动药(full agonist): α= 1 部分激动药(partial agonist, mixed agonist): 与受体有亲和力，但内 在活性较弱 （α<1）的药物。 （2）.拮抗药(antagonist)：与受体有亲和力，而无内在活性的药物（α= 0）。 竞争性拮抗药(competitive antagonist)与激动药竞争同一受体的拮抗药。 激动药的量效反应曲线可以被竞争性拮抗药平行右移。 非竞争性拮抗药 （noncompetitive antagonist） 与激动剂作用于同一 受体，结合牢固，分解慢或是不可逆的，或作用于相互关联的不同受体。