红外光谱法在壳聚糖脱乙酰度测定中的应用

红外光谱法在壳聚糖脱乙酰度测定中的应用与进展

（芮立强淮海工学院生物工程082班040822218）

摘要：综合探讨了应用红外光谱法定量测定壳聚糖的脱乙酰基度的方法，论述了红外光谱法在壳聚糖测定分析中的应用与发展前景。

关键字：红外光谱法甲壳素壳聚糖脱乙酰度

1.引言

甲壳素(chitin)是一种天然高分子化合物，大量存在于甲壳动物的外壳和真菌的细胞壁中，自然界每年生物合成的甲壳素约有15亿吨之多。由于其资源丰富、应用前景广阔，因而越来越受到人们的重视。经结构分析，甲壳素是自然界中唯一的带正电荷的一种天然高分子聚合物，属于直链氨基多糖，化学名称为（1，4）-2-脱氧-β-D-葡萄糖，经碱处理后可以制得壳聚糖，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-β-D葡萄糖，这类聚合物在纺织、印染、造纸、医疗、水处理及化妆品工业中具有广泛的应用价值。[16]

甲壳素的脱乙酰度对其溶解度、吸附金属离子的能力等具有很大的影响，因而控制甲壳素的脱乙酰度显得尤为重要。这篇论文就红外光谱法在壳聚糖脱乙酰度的测定中的应用与进展作了一定的研究。

2.红外光谱法的原理

红外光谱法又称“红外分光光度分析法”。简称“IR”,分子吸收光谱的一种。利用物质对红外光区的电磁辐射的选择性吸收来进行结构分析及对各种吸收红外光的化合物的定性和定量分析的一法。被测物质的分子在红外线照射下，只吸收与其分子振动、转动频率相一致的红外光谱。对红外光谱进行剖析，可对物质进行定性分析。化合物分子中存在着许多原子团，各原子团被激发后，都会产生特征振动，其振动频率也必然反映在红外吸收光谱上。据此可鉴定化合物中各种原子团，也可进行定量分析。

3.壳聚糖的应用

壳聚糖以其稳定性、保湿性、成膜性、凝胶性、絮凝性、生物安全性和生理功能性等优良性状而在食品工业中得到广泛的应用。[17]

壳聚糖来源于生物体结构物质，与人体细胞有很强的亲和性，可被体内的酶分解而吸收，对人体无毒性和副作用，加上良好的吸湿性、纺丝性和成膜性，因而广泛的被开发应用，成为优良的生物医学、药学材料。[9]

壳聚糖在化学工业、环保方面、农业方面和烟草工业中也有广泛的应用。[14] 4.壳聚糖的发展情况

中国国内用甲醛和乙酸酐为交联剂，制备了以壳聚糖为母体的壳聚糖凝胶LCM-X(LCM1,LCM2)。并对其性质进行研究。国内外关于壳聚糖凝胶的研究及应用报导较少。制备LCM-X既不溶于水，稀酸和碱溶液，也不溶于一般的有机溶剂，但是LCM-X是具有活性基团(NH2)的凝胶，并且具有较好的机械强度和化学性质稳定性等优良性能且不需特殊处理，即带有活性基团(NH2)，以及其母体几丁质资源丰富，价格低廉，是一种很有应用前景的生物多聚物。但是由于尚未找到适宜的分散剂，致使LCM-X未能形成颗粒化的产品，应用受限制。这一点有待于进一步研究解决。[7]

中国国内外对水凝胶的方面的研究很重视，开发新的水凝胶资源是主要的任务之一，水凝胶具有优良的生物相容性，抗凝血性，吸水溶胀性和良好的光学性能。在固定化酶，细胞分离，蛋白制备，缓释药物，较接触旋的制造以及人工脏器的研究中具有重要的作用。但是在中国国内外见详细的报导有关壳聚糖水凝胶性质的研究，中国国内仅对水凝胶的初步性质进行了探索，结果认为水凝胶以甲醇为成胶介质凝胶的吸胀性最强，交链度与壳聚糖水凝胶的RV值成反比。关于壳聚糖凝胶的研究有待于进一步开展。[8]

5.红外光谱法测定壳聚糖的脱乙酰度

5.1 简要的实验方法

1壳聚糖的制备

将虾壳、蟹壳去杂，洗净，经脱钙、脱蛋白质处理，并用高锰酸钾溶液脱色，草酸还原得灰白色片状产品，为甲壳素。

甲壳素在40一60%的氢氧化钠溶液中50一140℃下反应10一24小时，再洗至中性，得白

色略有透明感的固体物质，为壳聚糖。[13]

2红外光谱的测试与分析

用红外光谱分析仪对不同脱乙酞化时间的虾壳壳聚糖和相同脱乙酞化时间

的虾、蟹壳壳聚糖作红外光谱图，观察分子链上不同基团的吸收峰。在实验中用KBr压片法进行制样。当红外光通过聚合物样品时，某些频率的光被吸收，红外吸收所产生的跃迁与分子内部的振动有关，因此可以通过红外光谱的特征吸收频率来鉴定聚合物不同基团的存在，也可根据吸收峰的强弱进行定性分析。[4] 3.操作方法

称取5个已知不同脱乙酰度的、干燥过的壳聚糖标准样品（200目），每个

3mg，分别与5份300mgKBr与研钵中研磨10min，同时用红外灯照射干燥，防止研磨时吸潮。将全部混合好的粉末压片，立即进行红外扫描，在红外谱图上按标准方法在1550cm-1峰和2878cm-1峰的上方分别画出2条切线，垂直于横坐标通过1550cm-1峰和2878cm-1峰画出的长度，即为峰高，此2个峰高之比即为A1550/A2878，将这5个A1550/A2878与标准样品的已知脱乙酰度作图，即得标准曲线。

在测定未知壳聚糖样品的脱乙酰度时，也如上操作，求出A1550/A2878，然后在标准曲线上找到对应的脱乙酰度即为样品的脱乙酰度。

红外光谱定量法的误差要比滴定法大一些，但非常方便，样品不会被破坏，可回收。

从我们的经验角度来看，干燥对于数据的重复性极为重要，一般认为，

1550cm-1峰不易受到水的干扰，而1655cm-1峰易受到样品所含水分的影响，因此必须认真干燥。样品一定要研磨得很细，否则扫描出来的谱图吸收峰不尖锐，影响峰高的确定和测定。[11][12]

据林瑞洵等人的研究，A1550/A2867、A1550/A1420、A1550/A1378对脱乙酰度都有较好的线性关系，尤以A1550/A1420对脱乙酰度的线性关系为最好。[15]不同的作者采用的特征峰和参照吸收峰常常是不一样的，其原则是，选择的吸收峰一定要稳定，不易受到其他因素的影响与干扰。

5.2应用与进展综述

甲壳素是地球上贮量仅次于纤维素的可再生天然资源，另一方面它又是地球上除蛋白质外数量最大的含氮天然化合物，它的重要性是显然的。[3]甲壳素不溶于普通溶剂，而难以应用，但它的脱乙酰化产物———壳聚糖能溶于酸性溶液从而应用相当广泛。壳聚糖的性质很大程度上取决于脱乙酞度(D.D.)，脱乙酞度是壳聚糖最基本的结构参数之一，无论壳聚糖的生产、研究或应用都少不了脱乙酞度的测定。测定脱乙酞度可以用化学方法(酸碱滴定法、胶体滴定法、苦味酸法、水杨酸法、盐酸盐法和氢嗅酸法等)或仪器方法(红外光谱法、核磁共振谱法、紫外光谱法、折光率法和色谱法等)，化学方法操作繁琐，耗时较多，而仪器方法一般较昂贵。在仪器方法中，红外光谱是最值得推广应用的一种，它仪器较易得，操作简单快速，可直接使用固体样品。[10]虽然已有一些红外光谱法测定脱乙酰度的研究，但被引用和采用最多的还是Sannan等的工作，这一工作提供了A1550/A2878对D.D.的工作曲线。其测定范围约为0.15一0.95，没有包括高脱乙酰端和低脱乙酰端。Miya等则用A1655/A2867测定了高脱乙酰端(即0.90一1.00)的脱乙酰度。其他一些作者还报道了以1655cm-1分析谱带和以3450cm-1为参比谱带的测定结果。Shigemasa等以酰胺I谱带1655和1630cm-1以及酞胺Ⅱ谱带1560cm-1为分析谱带，以1070cm-1为内标，测定了全范围的脱乙酞度。可是Ferreira等则观察到1070cm-1等C一O伸缩谱带用作参比谱带效果明显较2873或3437cm-1差。我国的厦门大学材料科学与工程系的董炎明等人对这一方面也有所研究。他们以从完全脱乙酰壳聚糖通过均相N一乙酰化法制备的不同脱乙酸度(D.D.）。壳聚糖为红外标准样品，通过评价1655，1560，1380和1320cm-1四条可能的分析谱带，3430，2920，2880，1425，1155，1070，1030和895cm-1八条可能的参比谱带以及2种基线法组成的48种组合，选出了适合于壳聚糖脱乙酸度红外测定的最佳组合为A1560/A2920，A1560/A2880和A1655/A3430(推荐使用A1560/A2880)。测量1560和1655cm-1谱带的吸光度以第2种基线作法(即此两峰相邻的峰谷连线)为佳.D.D.的测量范围几乎覆盖了全程即1%一100%.后两种最佳组合的工作曲线还可适用于N一丙酞化、N一丁酸化和N一己酞化等N一烷酞化壳聚糖的取代度测定。[2][5][6]

6.结论

利用壳聚糖的红外光谱中特征集团的吸收峰可以进行脱乙酰度的测定。这种方法的好处是壳聚糖样品不必溶解到溶剂或溶液中，可直接将干燥粉末样品与KBr研成细末（最好200目以上），压片后在红外光谱仪上扫描，得到一张红外光谱图，然后用特征谱带如酰胺Ⅰ或者酰胺Ⅱ与某个特定谱带的吸收峰的比值，对一系列已知的脱乙酰度作图，得到一条标准曲线，从而可测定未知壳聚糖样品的脱乙酰度。此法的另一个好处是可以测定甲壳素和壳聚糖的脱乙酰度。[1]