根癌农杆菌介导的真菌转化
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是一种广泛应用于真菌基因功能研究与基因工程改造的技术。
通过利用根癌农杆菌T-DNA插入系统，将外源DNA转移至真菌细胞中，并将其整合到其基因组特定位点中，以此实现真菌基因突变、功能分析和引入外源基因等目的。
本文将介绍根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术的原理、方法和应用，并对其研究进展进行概述。
一、技术原理根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种经常被应用于植物基因工程的重要媒介，其T-DNA插入系统是实现外源基因整合的重要工具。
T-DNA是根癌农杆菌质粒中可转移DNA的一部分，其特点是，在植物感染过程中，T-DNA可被转移至寄主植物细胞内，并随后整合到其基因组中。
利用这一特点，将要转化的DNA导入到T-DNA载体中，然后插入到根癌农杆菌中，再将根癌农杆菌和真菌竹蜜菇接触，使得根癌农杆菌向真菌转移T-DNA，并通过T-DNA的插入将外源DNA整合到真菌基因组中。
二、方法简介根癌农杆菌介导的真菌遗传转化分为三个主要步骤，包括构建T-DNA载体、初始感染和筛选鉴定。
1. T-DNA载体构建T-DNA载体是根癌农杆菌之间传递转移DNA的载体，也是构建真菌遗传转化所需的载体。
在构建T-DNA载体时，需要创建flanking序列、筛选标记和转入基因。
其中，flanking序列是T-DNA插入到基因组中的标记，通常使用真核生物的基因表达元件，如启动序列或终止序列等，在T-DNA插入过程中随之整合到基因组中。
筛选标记则是指用于鉴定转化后的真菌是否包含T-DNA的标志，一般建议选择抗性基因或荧光蛋白基因。
转入基因则是要转入真菌中并施加特定的功能的外源基因。
2. 初始感染根癌农杆菌与真菌的接触是通过共培养实现的。
首先，将竹蜜菇生长在含有不同浓度的根癌农杆菌悬浮液的培养基上。
当根癌农杆菌悬浮液达到适当的浓度时，将其与真菌孢子混合，并将混合物培养在适当的时间和温度下，使根癌农杆菌向真菌细胞释放T-DNA，再经过植物激素、光照等处理，使真菌细胞产生表型变化，如生长速度快慢、菌丝分化、子实体大小等，这些都是外源DNA整合到基因组中的结果。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是一种重要的生物技术手段，被广泛应用于真菌基因工程研究和相关产业生产中。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术利用农杆菌Ti质粒中的T-DNA片段将外源基因导入真菌细胞内，使真菌细胞具有新的遗传特性。
近年来，随着生物技术的发展和研究的深入，根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究取得了令人瞩目的进展。
一、根癌农杆菌介导的真菌遗传转化原理及方法1.构建适合真菌的质粒载体，将外源基因插入T-DNA载体中，构建成适合真菌遗传转化的质粒载体。
2.将构建好的质粒载体通过农杆菌进行转化，使其含有T-DNA片段。
3.利用农杆菌与真菌细胞的接触，将质粒中的T-DNA片段导入真菌细胞内。
4.筛选和鉴定转化后的真菌株系，确认外源基因是否成功导入真菌细胞中，并对转化菌株进行鉴定和分离纯化。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术在农业生产中有着广泛的应用价值，主要体现在以下几个方面：1. 抗病力提高：根癌农杆菌介导的真菌遗传转化可以实现真菌对病原菌的抗性提高，使植物在生长过程中更加健康，减少病害发生的可能性。
2. 产量增加：通过真菌遗传转化技术可以使真菌获得更好的生长特性和代谢特性，从而提高作物产量。
3. 抗逆性提高：真菌经过遗传改造后，可能对环境中的逆境条件具有更强的抵抗能力，使植物更加适应不良环境的生长条件。
4. 品质改进：真菌遗传转化技术还可以用于改进植物的品质，比如提高农作物的风味、口感等。
1. 药物生产：利用真菌遗传转化技术可以大规模生产生物药物，比如抗生素、激素等，在生物医药领域有着重要的应用。
2. 新药研发：真菌遗传转化技术可以用于研发新的药物，通过改造真菌代谢途径等方式，获得新型的生物活性化合物。
3. 医学研究：真菌遗传转化技术也可以用于医学研究领域，比如用于疾病的基因治疗、蛋白质表达等。
1. 技术改进：研究者不断优化根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术，提高转化效率和稳定性，为真菌的遗传改造提供更好的手段。
根癌农杆菌介导烟曲霉遗传转化的研究
２１ ００年 ９ 月
第 ｌ ４卷
第 ９期
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文 章 编 号 ：０７ ２７ ２ １）９ ５７— ２ １０ —４ ８（００ ０ —１０ ０
根 癌农 杆 菌 介 导 烟 曲霉 遗 传 转 化 的研 究
张艳 华 一贺 ，， 丹 王 ， 丽¨
（． １吉林 大学 白求恩 医学 院 ， 吉林 长春 １０２ ； ． ３０ １２ 吉林大学植物 科学学院 ， 吉林 长春 １０６ ） ３０２
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转化 方 法 的效 率 高 得 多 。利 用 Ａ Ｍ Ｔ Ｔ转 化 泡盛 曲 霉 （ Ａ． ａ ａ ｏｉ的效率 比 Ｐ Ｇ法 高 ６０倍 ， 毛壳 菌 （ ｈｅ ｍ ｕ ｗｍ ｒ ） Ｅ ０ 球 Ｃ ａｔ ｉ ｏ ｍ
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根癌农杆菌介导法原理
根癌农杆菌介导法原理引言根癌农杆菌介导法是一种常用的基因转化技术，广泛应用于植物遗传工程领域。
它利用植物根癌农杆菌接触感染时产生的植物激素和DNA导入技术，将外源基因导入植物细胞，实现对植物基因组的改造。
本文将全面、详细、完整地探讨根癌农杆菌介导法的原理、应用以及优缺点。
根癌农杆菌的特点1. 根癌农杆菌简介根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 是一种通过植物接触感染的土壤细菌，在植物遗传工程研究中具有重要的应用价值。
它能够将其自身的T-DNA（转座子DNA）片段导入植物细胞，并在植物细胞中稳定表达。
2. 根癌农杆菌的感染机制根癌农杆菌感染植物的过程包括以下几个步骤：1.识别和结合：根癌农杆菌通过识别植物伤口释放的酚类化合物，结合到植物细胞表面。
2.感染透入：根癌农杆菌产生的信号分子诱导植物细胞产生细胞壁降解酶，使其自身进入植物细胞。
3.T-DNA转移：根癌农杆菌通过特殊的转移螺旋（vir蛋白）将T-DNA从细菌自身转移到植物细胞中。
4.T-DNA整合：转移的T-DNA片段在植物细胞染色体上整合，并导致植物细胞的遗传改变。
根癌农杆菌介导法原理根癌农杆菌介导法利用根癌农杆菌的感染机制，将外源基因导入植物细胞，从而实现对植物基因组的改造。
1. 构建适合的转化载体在根癌农杆菌介导法中，首先需要构建适合的转化载体。
转化载体通常包括以下几个重要组成部分：•T-DNA：携带待转化的外源基因片段。
•选择标记基因：用于筛选转化成功的植物细胞。
•根癌农杆菌起始核酸序列（ori）：用于在根癌农杆菌中复制转化载体。
2. 根癌农杆菌感染植物将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，然后让根癌农杆菌感染植物组织。
通常可以通过以下步骤实现：•制备根癌农杆菌感染液：将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，培养至菌体达到一定浓度。
•植物组织处理：将待转化的植物组织浸泡在根癌农杆菌感染液中，利用真空处理或共振法促使菌体进入植物细胞。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展植物真菌是一类重要的微生物，在自然界中具有重要的地位，它们可以在植物体内或外引起多种作物的病害。
为了有效防治和控制植物真菌的病害，基因转化技术已经成为一种重要的手段。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术具有高效、简单、灵活等特点，在植物真菌遗传改良研究中得到了广泛应用。
本文将对根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展进行综述。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术是利用根癌农杆菌T-DNA插入真菌染色体中，实现外源基因的导入。
根癌农杆菌T-DNA在感染植物组织过程中，T-DNA的两侧的重复序列对应产生质粒的头部和尾部，T-DNA插入到植物基因组中去除了生发区和生殖区基因的调节因子，导致细胞无法分化造成根癌，自然或人工去除这些基因后，再将目的基因嵌合到T-DNA后导入目标植物组织并在细胞层或组织层产生效应。
1. 研究目的明确根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术的研究目的是为了利用该技术将外源基因导入真菌细胞中，从而使真菌获得新的性状或功能。
目前，根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术已被成功应用于多种真菌，如白僵菌、酿酒酵母、木霉等。
这些研究表明，根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术在真菌改良中具有广阔的应用前景。
2. 技术改进在根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术的研究过程中，研究人员还对该技术进行了不断改进，以提高其转化效率和稳定性。
通过对根癌农杆菌T-DNA的结构和功能进行深入研究，研究人员已成功构建了一些具有高效转化能力的根癌农杆菌株系，并利用这些株系进行了真菌遗传转化研究。
研究人员还对真菌遗传转化的各个环节进行了逐一优化，从而取得了一系列令人满意的研究成果。
3. 应用领域拓展三、面临的挑战与未来展望尽管根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术在植物真菌遗传改良研究中取得了一系列的进展，但在实际应用中仍然面临着一些挑战。
由于真菌的遗传特性复杂，其遗传转化技术相对于细菌和植物来说较为困难，因此对真菌的遗传机制和代谢途径的研究仍需要进一步加强。
根癌农杆菌介导的淡紫拟青霉遗传转化体系的建立
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第４ ６卷 第 １ ０期
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根癌 农 杆 菌 介 导 的淡 紫 拟青 霉 遗 传 转 化 体 系 的建 — Ｌ术
北 京 １０ ９ ； ．安 徽 农 业 大 学 林 学 与 园林 学 院 合肥 ００１ ３
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摘 要 ： 基 于根 癌 农 杆 菌 介 导 的遗 传 转 化 方 法 ， 择 植 物 线 虫 生 防 真 菌 淡 紫 拟 青 霉 的分 生 孢 子 为 受 体 ， 立 以 选 建
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根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化
三、根癌农杆菌Ti质粒转化方法
• 整体植株接种共感染法 • 优点：实验周期短；充分利用无菌实生苗 的生长潜力；避免在转化过程中其它细菌 污染；避免农杆菌在培养基上的过度生长； 具较高的转化率。 • 缺点：嵌合体严重；转化细胞的筛选困难。 • 原生质体共培养转化法 • 最大优点实减少嵌合体产生；缺点是原生 质体再生困难，获得转化株少，操作比较 复杂。
• 叶盘转化法 • 优点：适用性广；改良的叶盘法可以适用于其它 外植体如茎段、子叶等；操作简单且重复性高。 • 注意事项：掌握叶组织侵入农杆菌培养液的适宜 时间；叶片在培养过程中常膨大而扭曲，可把切 口边缘压入埋藏在培养基中；制备叶盘是最好避 免叶脉进入。
农杆菌Ti质粒转化系统的优点
• 该转化系统是模仿天然的转化载体系统，成功率高， 效果好； • 机理研究最清楚，方法最成熟，应用最广泛； • Ti质粒的T-DNA区可以容纳相当大的DNA片段插入，目 前已把50kb的DNA转入植物细胞中； • 农杆菌Ti质粒转化系统的外源基因以单拷贝为多 数，遗传稳定性好，且多数符合孟德尔遗传规律。
• 根癌农杆菌通过基因转化把T-DNA上的基因 导入植物细胞并整合到核DNA上。这些外源 基因在植物细胞中得到表达，致使植物细胞 转化为肿瘤状态，并大量合成冠瘿碱。这些 冠瘿碱又是农杆菌的唯一碳源，有利于农杆 菌的繁殖和Ti质粒的转移，进一步扩大侵染 领域。
二、根癌农杆菌转化程序及操作原理
农杆菌基因转化可分为三部分： • 受体系统的建立； • Ti质粒转化载体的构建； • 目的基因的转化。
农杆菌附着后不能立即转化只有在创伤部位生存16h之后的菌株才能诱发肿瘤因此共培养时间必须长于16h时间过长由于农杆菌的过度生长植物细胞因受到毒害而死亡
根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是一种重要的生物技术手段，用于在真菌中引入外源基因，从而实现真菌遗传改良和生产目的。
通过这种方法，可以使真菌获得新的代谢途径、提高产酶能力、增强抗病性等，对农业、食品、医药等领域具有广泛的应用前景。
本文将介绍根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究的进展，包括转化技术、转化机理、影响因素等方面的最新成果。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是一种经典的转化方法，其基本原理是利用根癌农杆菌在侵染植物细胞时所产生的T-DNA插入到真菌基因组中，从而实现外源基因的导入。
目前，根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术已经被广泛应用于多种真菌中，包括担子菌门、霉菌门、子囊菌门等。
在这一技术中，首先需要构建适合真菌转化的质粒载体，然后将所需的外源基因插入到T-DNA中，最终通过根癌农杆菌介导的转化方法将T-DNA导入到真菌中，使其表达外源基因。
二、根癌农杆菌介导的真菌遗传转化机理根癌农杆菌介导的真菌遗传转化机理主要包括侵染、T-DNA转移、T-DNA插入和表达等过程。
在侵染过程中，根癌农杆菌通过细菌分泌的外膜蛋白和植物细胞的信号物质相互作用，从而进入植物细胞内部。
随后，T-DNA与细菌Ti质粒结合成核，在细胞核区域形成T型DNA复合物，通过核孔结构进入到植物细胞核中。
一旦T-DNA进入到植物细胞核中，它就会插入到宿主基因组中，并通过宿主细胞机理来转录和翻译成蛋白质，最终表达外源基因。
在根癌农杆菌介导的真菌遗传转化过程中，有许多因素会对转化效率产生影响，包括真菌种属、株系、生长条件、遗传材料、T-DNA构建等。
不同真菌种属对根癌农杆菌转化的敏感性不同，其中以担子菌门真菌为最敏感。
真菌株系的选择和优化也是影响遗传转化效率的重要因素，通常选择易于扩增和稳定的株系可以提高转化效率。
合适的生长条件对于真菌的生长和代谢活性都是至关重要的，比如温度、光照、培养基成分等都会对真菌的遗传转化效率产生影响。
根癌农杆菌介导的植物遗传转化1
实验三根癌农杆菌介导的植物遗传转化一实验目的了解植物遗传转化的方法和理论掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术二原理植物遗传转化技术是指通过物理的，化学的或生物学的方法，将外源的基因导入受体植物细胞中获得再生植株的转基因技术。
自1983转基因植物问世以来，至今不到20年时间里，植物转基因技术发展迅速，除了占指导地位，运用最为广泛的农杆菌介导法，还发展了10多种转基因方法，如物理方面的基因枪法，电激法，显微注射法，超声波法，激光微束法，炭化硅纤维介导法，电泳法等；化学方面PEG介导转化，脂质体介导转化；生物学方面的种质系统法如花粉介导法，花粉管通道法等。
农杆菌介导法土壤农杆菌（Agrobacterium）是一种革兰氏阳性菌，有两个种与植物转基因有关，即根癌农杆菌（Agrobacterium Tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium Rhizogenes）.它们在自然状态下具有趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠缨瘤或发状根，在离体条件下，可以在不加任何生长素的培养基中持续生长，研究表明根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti 和Ri质粒,上面有一段T-DNA区，可以通过一系列过程进入植物细胞并将这一段T-DN插入到植物基因组中，这是农杆菌侵染植物后产生冠缨瘤或发状根的根本原因，因此农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，人们可将所构建的目的基因插入到去除了致瘤基因的Ti(Ri)质粒的T-DNA区，借助农杆菌侵染受体植物细胞后T-DNA向植物基因组的高频转移和整合特性，实现目的基因对受体植物细胞的转化，然后通过植物细胞合和组织培养技术，利用植物细胞的全能性获得转基因再生植株。
农杆菌介导法转基因技术的关键是T-DNA整合受体植物基因组的过程，这一过程依赖与Ti质粒上的T-DNA区，和Vir区各种基因的表达以及一系列蛋白质和核酸的相互作用。
简略地说。
其过程是：植物细胞在受伤后细胞壁破裂，分泌高浓度的创伤诱导分子，它们是一些酚类化合物，如乙酰丁香酮（acetosyringone,AS）和羟基乙酰丁香酮（hydroxy- acetosyringone,OH-As）农杆菌对这类物质具有趋化性，首先在植物细胞表面发生贴壁，继而植物创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达。
一种根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的新方法
一种根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的新方法
鲍广稳;祝嫦巍
【期刊名称】《食品与生物技术学报》
【年(卷),期】2015(034)011
【摘要】设计了一种简单高效的根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的方法.利用嵌套平板的方法,在内层平板培养平菇菌丝,待菌丝生长至平板边缘,将经诱导的根癌农杆菌与共培养培养基(CCM)混合,倒入内层平板与外层平板的间隙中,与正在生长中的菌丝共培养,实现转化,利用潮霉素抗性筛选获得转化子,平均转化效率33％左右.此方法操作简单,周期短,极易扩大实验规模,为平菇的分子育种以及其他丝状真菌的遗传转化提供参考.
【总页数】4页(P1168-1171)
【作者】鲍广稳;祝嫦巍
【作者单位】安徽科技学院生命科学学院,安徽凤阳233100;安徽科技学院生命科学学院,安徽凤阳233100
【正文语种】中文
【中图分类】Q819
【相关文献】
1.共培养条件对农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响 [J], 黄顺;董金星
2.根癌农杆菌介导转化番茄的影响因素 [J], 张录霞;牛建新;马兵钢
3.根癌农杆菌介导转化马铃薯研究 [J], 朱英;刘永翔;黄永会;邱礽;刘作易
4.高渗处理对根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响 [J], 任艳;黄玉杰;张新建;杨合同
5.根癌农杆菌介导转化红曲菌及转化子发酵性能的研究 [J], 王璐;许赣荣;王武因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
农杆菌介导的真菌遗传转化及其应用
农杆菌介导的真菌遗传转化及其应用论文导读：农杆菌是一种土壤习居菌，在自然条件下可以通过病斑或伤口进入寄主组织，刺激寄主在侵染部位形成冠瘿瘤，引发根癌病。
以真菌菌株作对照。
关键词：农杆菌，真菌，遗传转化一、农杆菌介导真菌遗传转化的现实意义真菌在自然界具有重要的地位，它是不同生态环境中的最初分解者之一。
真菌在工业、农业、食品行业和医药等领域应用十分广泛。
例如，在生物技术领域，可以利用真菌生产对人类有益的次级代谢产物抗生素、紫杉醇等；在植物病理学研究领域，许多真菌本身就是人类、动物及植物的病原菌；一些真菌可作为生防剂控制病虫害的发生。
构巢曲霉（Aspergillus nidulans）和粗糙链孢霉（Neurospora crassa）由于结构比较简单，一般作为模式生物用于基础性的分子生物学及遗传学的研究[1]。
但从自然界直接分离的菌株和通过常规育种得到的菌株在多种性状上并不能满足人们的需要，而通过常规方法用真菌生产异源蛋白更难以实现[2]。
论文检测。
而农杆菌介导的真菌遗传转化具有效率高，成本低，操作方便和重复性好等特点[3,4 ]，大大提高了真菌的转化效率，增加了转化子的稳定性，为研究真菌基因功能，分离克隆相关基因提供了一条崭新的途径。
二、农杆菌介导真菌遗传转化的分子基础农杆菌是一种土壤习居菌，在自然条件下可以通过病斑或伤口进入寄主组织，刺激寄主在侵染部位形成冠瘿瘤，引发根癌病。
冠瘿瘤的生成，是由于农杆菌染色体外遗传物质—Ti质粒上的一段DNA(T-DNA)转移到植物细胞，整合进染色体组并进行表达的结果。
T-DNA整合到真菌基因组的方式分为两种，一种为同源重组，另一种为异源重组。
对丝状真菌而言，当T-DNA中存在与宿主基因组同源的序列时，可实现同源重组（Gouka等，1999）。
Gouka等发现当T-DNA上含有与泡盛曲霉基因组同源的序列时，T-DNA可以通过同源重组多拷贝的整合到受体的基因组序列上。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展根癌农杆菌介导的真菌遗传转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT）是一种常用的真菌遗传转化技术，它利用根癌农杆菌作为介导者，将目标DNA转移到真菌细胞中，从而改变真菌的遗传特性。
近年来，ATMT技术在真菌遗传转化研究中得到了广泛应用，并取得了许多进展。
ATMT技术的基本原理是将目标DNA插入到根癌农杆菌的转化质粒中，然后通过存在于转化质粒中的跨界转座系统（T-DNA）将目标DNA转移到真菌细胞中。
跨界转座系统是根癌农杆菌特有的一个DNA片段，可以携带外源基因插入到真菌基因组中的随机位置。
真菌细胞会利用此外源基因来表达目标基因，并产生相应的遗传变化。
ATMT技术的优点之一是转化效率较高，可以成功转化多种真菌。
研究人员已经成功地将ATMT技术应用于多种真菌，包括担子菌门（如酵母菌、拟南芥黄链菌等）、接合菌门（如粘帚菌、丝状菌等）和半知菌门（如滑子菌、刺球菌等）。
ATMT技术也可以用于转化真菌中的不同类型的细胞，包括营养体、分生孢子和菌丝等。
近年来，ATMT技术在真菌遗传转化研究中的进展主要包括以下几个方面：ATMT技术的转化效率得到了极大的提高。
研究人员通过优化转化条件和转化质粒的构建，使ATMT技术的转化效率大幅提高，从而提高了转化真菌的成功率。
ATMT技术在真菌功能基因组学研究中的应用取得了重要进展。
ATMT技术可以通过插入性突变的方式，破坏真菌中的特定基因并观察其对真菌生长、代谢和病原性等特性的影响，从而帮助研究人员深入了解真菌的功能基因组。
ATMT技术的潜力在农业和医学领域也得到了广泛关注。
ATMT技术可以用于改良农作物和药用真菌，使其具有抗性和高产性等优良特性，从而提高农作物和药物的产量和质量。
ATMT技术在真菌遗传转化研究中已取得了显著的进展。
随着该技术的不断改进和优化，相信ATMT技术将在真菌研究和应用中发挥越来越重要的作用。
根癌农杆菌介导的木霉遗传转化及应用进展
・综述与专论・生物技术通报Ｂ１０ＴＥｃＨＮｏＬｏＧＹＢＵＬＬＥＴｌＮ２０１０年第３期根癌农杆菌介导的木霉遗传转化及应用进展范亮波李梅冀颖刘卫德蒋细良（中国农业科学院植物保护研究所农业部生物防治重点开放实验室，北京１０００８１）摘要：木霉作为土传植物病原茵的生防真菌，研究其功能基因具有重要的意义。
根癌农杆茵介导的遗传转化（ＡＴＭＴ）为木霉功能基因的研究提供了一个强有力的工具。
对根癌农杆茵介导木霉遗传转化的机理、特点、方法及其在木霉中的应用进行了综述。
关键词：根癌农杆茵木霉茵遗传转化Ｔ・ＤＮＡＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＭｅｄｉａｔｅｄＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄＩｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．ＦａｎＬｉａｎｇｂｏＬｉＭｅｉｊｉＹｉｎｇＬｉｕＷｅｉｄｅＪｉａｎｇＸｉｌｉａｎｇ（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ如ｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｕｎｇａｉｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｇｅｎｔｔｏａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓｏｉｌ－ｂｏｒｎｅｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｓａｎｄｉｔｉｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｓｔｕｄｙｉｔ＇ｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｆｏｒｗｈｉｃｈＡＴＭＴｐｒｏｖｉｄｅｓａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔ００１．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｓａｎｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎｔｒａｎｓ—ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．ｍｅｄｉａｔｅｄｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｃｆａｃｉｅｎｓａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．ＧｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＴ・ＤＮＡ木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．）属半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，是一种广泛存在于土壤中的丝状真菌。
根癌农杆菌介导脂肪酶在无孢黑曲霉中的高效表达
根癌农杆菌介导脂肪酶在无孢黑曲霉中的高效表达潘力;王云艳;王斌;何攀;李俊星【摘要】黑曲霉(Aspergillus niger)具有高效的蛋白表达和分泌能力.为实现异源蛋白在无孢黑曲霉中的高效重组表达,在优化遗传筛选标记的基础上,建立了根癌农杆菌介导的、以潮霉素抗性基因为筛选标记的黑曲霉转化体系.利用该体系介导米黑根毛霉脂肪酶(RML)转化黑曲霉SH-1,通过PCR鉴定、酶活检测、镍柱亲和层析及SDS-PAGE电泳检测等确定成功获得了RML的黑曲霉转化子,并通过发酵条件优化实现了RML的高效表达,对硝基苯酚比色法测得转化子酶活最高可达15U/mL,是其在酵母中表达水平的10倍以上.%Aspergillus niger (A. niger) owns effective capabilities of protein expression and secretion. In order to implement the effective recombinant expression of heterologous protein in non-spore A. niger, several selection markers were evaluated and hygromycin B resistance gene was selected to establish an Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens)-mediated transformation system of A. niger. Then, Rhizomucor miehei lipase ( RML) was transformed into A. niger SH-1 via the A. tumefaciens-medialed transformation and was verified by means of PCR identification, enzyme activity assay, Ni affinity chromatography and SDS-PAGE. Finally, RML transformants effectively expressing RML protein were obtained after the fermentation optimization. The p-nitrophenol colorimetry results show that the transformants possesses a lipase activity of 15U/mL, which is more than ten times that expressed in yeast.【期刊名称】《华南理工大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(040)005【总页数】6页(P84-89)【关键词】无孢黑曲霉;根癌农杆菌介导转化;米黑根毛霉脂肪酶;基因表达【作者】潘力;王云艳;王斌;何攀;李俊星【作者单位】华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】Q812黑曲霉(Aspergillus niger)是丝状真菌中的重要类群，具有高效的蛋白表达、分泌和修饰能力，被美国食品及药物管理局(FDA)认定为安全菌株，在食品、医药、饲料、工业酶制剂等领域正受到越来越多的关注［1-4］.在基因工程中，外源基因进入黑曲霉细胞后会整合在其染色体上，重组子具有很高的遗传稳定性［5］，有利于异源基因的高效表达，因此黑曲霉作为异源蛋白的重组表达系统日益受到重视.黑曲霉作为表达系统的关键技术是遗传转化方法的建立.根癌农杆菌介导的转化(ATMT)具有操作简便、重复性好等优点［6］，其效率远高于原生质体转化、电转化等传统方法［7］，已成功应用于丝状真菌的遗传转化［8-11］.目前，ATMT 介导丝状真菌转化局限于基因功能研究［6］，钟耀华［12］曾利用 ATMT 转化瑞氏木霉分析其生长代谢突变子.然而，由于遗传筛选标记的限制，利用ATMT介导黑曲霉表达异源蛋白的研究鲜见报道.本研究以在轻工食品行业具有重要应用的米黑根毛霉脂肪酶(RML)为研究对象，在优化遗传筛选标记的基础上，采用根癌农杆菌介导RML表达载体转化无孢黑曲霉，并对转化子表达RML进行初步的发酵条件优化，以期为RML的大规模工业应用奠定基础.1 材料与方法1.1 菌种与质粒无孢黑曲霉SH-1，华南理工大学生物科学与工程学院微生物实验室保藏;根癌农杆菌LBA4404，由广东省农科院惠赠.华南理工大学生物科学与工程学院微生物实验室构建了3种根癌农杆菌工程菌:LBA4404A含pHGW-PT表达载体、潮霉素(HygB)抗性基因、吡啶硫胺素(PT)抗性基因;LBA4404B含pHGW-amdS表达载体、HygB抗性基因、乙酰胺酶基因(amdS);LBA4404C含脂肪酶表达载体pHGWRML、HygB抗性基因、RML基因表达盒(3'端添加His6组氨酸标签)［13］.1.2 培养基根癌农杆菌LC培养基、黑曲霉诱导培养基(IM培养基)、黑曲霉基础培养基(MM 培养基)、乙酰胺培养基参照文献［8］配制.黑曲霉淀粉培养基:牛肉膏3g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉2 g/L，淀粉10 g/L，NaCl 2g/L，琼脂 1.7%，pH=5.5.YPD 培养基:葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L.察氏培养基(CD培养基):蔗糖 20 g/L，硝酸钠 3 g/L，KCl 0.5g/L，MgSO40.5 g/L，K2HPO41 g/L、FeSO4 0.01g/L，琼脂粉 1.5%，pH=5.5.1.3 试剂与仪器HygB购自美国Merck公司;PT、乙酰丁香酮、牛血清白蛋白(BSA)、对硝基苯酚辛酸酯(pNPC)购自Sigma-Aldrich公司;三丁酸甘油酯购自百灵威公司;其它试剂为国产分析纯.主要仪器包括德国Eppendorf公司PCR仪，美国Thermo Scientific SORVALL高速冷冻离心机，美国Bio-RAD公司蛋白、核酸电泳仪，美国Pall公司纯水仪，美国GE公司蛋白质纯化系统AKTATM purifier，瑞士TECAN公司Sunrise多功能酶标仪等.1.4 黑曲霉药物敏感性试验制备100 μg/mL 潮霉素、0.1 μg/mL 吡啶硫胺素的水溶液.参照文献［8］制备含0.01 mol/L乙酰胺的培养基.各取200μL黑曲霉菌种涂布分别加有100μg/mL HygB、0.1μg/mL PT的 CD 固体培养基.取200μL黑曲霉菌种涂布含有0.01mol/L乙酰胺的固体培养基.各取200μL黑曲霉菌种涂布不加上述药物的CD培养基平板，作为对照.30℃培养4天后观察黑曲霉在药物作用下的生长情况.1.5 ATMT法介导的黑曲霉转化体系的建立参照文献［8］报道的转化方法.将在淀粉培养基平板上活化后的黑曲霉单菌落转移至CD液体培养基中34℃培养5天待用.将含有待转化质粒的根癌农杆菌在LC培养基平板(含20 μg/mL利福平和100μg/mL壮观霉素)上活化，挑取较大的单菌落接种于LC液体培养基(含上述药物)，28℃、250r/min培养24 h;取1.5 mL根癌农杆菌培养液离心弃上清，加入5mL IM液体培养基(含5 μL 0.2 mol/L乙酰丁香酮)重悬菌体，28℃、100 r/min避光培养4～5h，待菌体D(600)值为1.0左右时取出待用.将100μL黑曲霉培养物与100 μL根癌农杆菌培养物混合均匀后涂布于含0.2 mmol/L乙酰丁香酮的IM培养基平板上，22.5℃避光培养3天;将培养物转移至含0.2 mol/L头孢噻肟和100 μg/mL潮霉素的MM培养基平板，30℃培养4～6天，待转化子长出后提取基因组DNA进行聚合酶链式反应(PCR)鉴定，所用引物见表1.1.6 根癌农杆菌介导的脂肪酶RML转化黑曲霉1.6.1 脂肪酶表达载体pHGW-RML转化黑曲霉脂肪酶表达载体pHGW-RML转化黑曲霉的方法参见1.5.筛选标记为HygB抗性基因.1.6.2 RML转化子的PCR鉴定和表观酶活检测将在筛选平板上出现的转化子，用灭菌牙签转接至含0.5%(体积分数)三丁酸甘油酯的CD培养基平板上，30℃培养3～5天，观察转化子周围有无水解圈出现.提取转化子的基因组DNA作为模板，对筛选标记基因、RML基因进行PCR扩增，以鉴定RML表达载体是否已整合在黑曲霉基因组上，所用引物见表1.表1 PCR引物序列Table 1 Sequences of PCR primers引物名称引物序列(5'－3')扩增片段长度/bp HygB-forward HygB-reverse解链温度/℃CTTGTTCGGTCGGCATCTAC GTCGCCTAAGGTCACTATCAG 56561166 PT-forward PT-reverse CGATGGAATGGCTAACAGAT TCAAAGACCGTAAGACAAAT 5050 1141 amdS-forward amdS-reverse GGCCCTGAAGGTCGGAT TACTGATGTCTATTGGAAGAAAACT 5555 3430 RML-forward RML-reverse CTGCTTTGGCTGTCCCTATC GGTGACGGCGACCTTGTA 57576441.6.3 RML转化子蛋白的提取及鉴定将在CD培养基(含0.08%琼脂)中培养5～7天的黑曲霉RML转化子菌液经离心浓缩后获得RML转化子种子培养液(D(600)值＞2.0).吸取2mL种子液接种50mL YPD液体培养基，30℃、250r/min振荡培养3天，发酵液用四层擦镜纸过滤除去培养基及菌丝，滤液离心得蛋白粗提液.蛋白粗提液经超滤浓缩并测定浓度后备用.蛋白粗提液的亲和层析纯化参照镍柱产品使用说明及分子克隆方法［14］进行，测定所得RML蛋白样品的浓度，并采用10%分离胶进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测.1.6.4 RML转化子发酵条件的初步优化及脂肪酶酶活测定对转化子表达脂肪酶的发酵优化主要针对3个因素:碳源、温度和pH.碳源选用葡萄糖，用量分别为2%、3%、4%和5%;培养温度分别为30、33和36℃;pH 值选择4.5、5.5 和 6.5.其它培养基成分与 YPD培养基相同，样品于250r/min恒温振荡培养5～8天.自第3天开始取样测定脂肪酶活力，以确定合适的发酵培养条件.脂肪酶活力测定方法:将脂肪酶底物pNPC溶于水中，添加0.5%Triton作乳化剂，经匀浆制备浓度为2.5mmol/L的底物溶液.将500 μL底物溶液、20 μL RML 转化子发酵液和 480 μL 50mmol/L Tris-HCl缓冲液混合，配制1 mL酶活反应体系，于45℃预热后反应10 min，加入20 μL 5%三氯乙酸终止反应.取200μL反应液至96孔板，用酶标仪测定D(405)值.脂肪酶活力单位(U)定义为每分钟水解底物pNPC生成1μmol对硝基苯酚所需的酶量.2 结果与讨论2.1 黑曲霉筛选标记的确定在含100μg/mL潮霉素的CD培养基平板上，黑曲霉SH-1的生长受到完全抑制，而在不加HygB的平板上黑曲霉生长旺盛(见图1(a)、1(b))，说明黑曲霉对HygB敏感.同样，0.1μg/mL的PT可以抑制黑曲霉在CD平板上的生长，而在不加PT的平板上黑曲霉生长正常(见图1(a)、1(c)).因此HygB、PT的抗性基因可以作为黑曲霉遗传转化的筛选标记.在以乙酰胺为唯一氮源的培养基平板上，黑曲霉SH-1生长十分缓慢(见图1(a)、1(d))，说明黑曲霉利用乙酰胺作为氮源的能力较弱.来源于构巢曲霉的乙酰胺酶能有效分解乙酰胺提供氮源，而序列分析表明黑曲霉的乙酰胺酶基因(amdS)与构巢曲霉amdS基因只有22.31%的同源性，导致黑曲霉利用乙酰胺的能力十分有限，这为黑曲霉的遗传转化提供了一个很好的筛选标记.图1 黑曲霉SH-1对潮霉素B、吡啶硫胺素、乙酰胺的生长敏感性Fig.1 Growth sensitivity of A.niger SH-1 tohygromycin B，pyrithiamine and acetamide 2.2 以HygB抗性基因为筛选标记的黑曲霉遗传转化体系的建立本研究以HygB抗性基因作为筛选标记，利用ATMT法介导表达载体pHGW-PT、pHGW-amdS转化黑曲霉SH-1.在筛选平板上获得4个具有HygB抗性的pHGW-PT转化子(见图2(a))，其在含PT的平板上生长旺盛，而宿主菌基本没有生长(见图2(b))，经PCR扩增在转化子中获得了HygB、PT抗性基因的 PCR产物(见图3(a)、3(b)).pHGW-amdS转化宿主菌得到3个转化子(见图4(a))，其在乙酰胺培养基平板上生长旺盛而野生型宿主菌则生长较差(见图4(b))，经PCR扩增在转化子中得到了HygB抗性基因和amdS基因的PCR产物(见图5(a)、5(b)).以上结果表明，以HygB抗性基因作为筛选标记可以有效地获得转化子，间接证明了PT抗性基因和amdS基因可以作为遗传筛选标记.由此建立了以HygB为筛选标记的黑曲霉遗传转化体系.图2 黑曲霉SH-1的pHGW-PT表达载体转化Fig.2 Transformation of A.niger SH-1 with pHGW-PT expression vector1－4—转化子;5—宿主菌图3 pHGW-PT转化子的PCR鉴定Fig.3 PCR identification of pHGW-PT transformantsM—DNA标准物;1—质粒对照;2－4—转化子;5—宿主菌2.3 黑曲霉RML转化子的鉴定用pHGW-RML表达载体转化黑曲霉后，在含头孢噻肟和潮霉素的筛选平板上出现4个转化子(见图6(a))，将其转移至含三丁酸甘油酯的CD培养基平板，培养5天后转化子菌落周围出现底物水解圈，而宿主菌则没有水解圈(见图6(b))，表明RML基因已在黑曲霉中表达.以所得转化子基因组DNA为模板，经PCR获得了HygB抗性基因、RML基因的PCR产物(见图7(a)、7(b))，将扩增得到的RML基因的PCR产物(644 bp)进行测序，测序结果与RML基因原始序列完全一致，表明所得黑曲霉RML转化子是阳性克隆.由于所用宿主为不产孢子的无孢黑曲霉，有利于根癌农杆菌介导的遗传转化的顺利进行;实验结果证明，转化效率较高.图4 黑曲霉SH-1的pHGW-amdS表达载体转化Fig.4 Transformation ofA.niger SH-1 with pHGW-amdS expression vectorA1、A2、A4—转化子;W—宿主菌图5 pHGW-amdS转化子的PCR鉴定Fig.5 PCR identification of pHGW-amdS transformantsM—DNA标准物;1—质粒对照;2—宿主菌;3—转化子图6 黑曲霉RML转化子的底物水解鉴定Fig.6 Hydrolyzing verification ofA.niger transformants bearing RML gene1－4—RML转化子;5—宿主菌图7 黑曲霉RML转化子的PCR鉴定Fig.7 PCR identification of A.niger RML transformantsM—DNA标准物;1—RML转化子;2—宿主菌;3—质粒对照2.4 RML蛋白的亲和层析及SDS-PAGE鉴定将活化的RML转化子在YPD培养基中培养3天后收集发酵液上清，经超滤浓缩后进行亲和层析，洗脱峰非常明显，说明带有His6组氨酸标签的RML蛋白与镍柱可以牢固结合并有效洗脱，纯化效果较好(见图8(a)).将纯化后的RML蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，在相对分子质量33000处出现了显著的单一目的蛋白条带，与RML蛋白的大小吻合［15］(见图8(b))，因此本研究构建的黑曲霉RML转化子成功表达了重组脂肪酶.图8 重组脂肪酶的亲和层析纯化及SDS-PAGE电泳鉴定Fig.8 Affinity chromatography of recombinant lipase and its verification by SDS-PAGEM—蛋白质标准物;1—宿主菌;2—纯化前蛋白粗提液;3—亲和层析纯化后蛋白样品2.5 黑曲霉RML转化子发酵条件优化丝状真菌的培养温度一般是30℃.本研究选择30、33和36℃ 3个温度梯度进行试验(pH=5.5，葡萄糖用量为2%)，培养时间设定为6天，结果表明30℃培养时黑曲霉发酵液脂肪酶酶活最高(3.3 U/mL)，因此选择30℃作为最适的培养温度.丝状真菌生长pH 值一般选择5.5，本研究选择 4.5、5.5 和 6.5 进行试验(培养温度为30℃，葡萄糖用量为2%)，培养时间设定为6天，结果表明在pH=4.5时，发酵液的脂肪酶酶活最高(6.4 U/mL)，因此选择pH=4.5为最佳pH值.对于碳源(葡萄糖)用量的优化，选择2%、3%、4%和5%4个梯度配制YPD培养基，培养温度和pH按照上述优化后的条件:30℃、pH=4.5.转化子发酵培养至第7天时，葡萄糖用量为5%的发酵液的脂肪酶酶活达到最高(15 U/mL).在培养过程中发现，第4天时葡萄糖用量为2%的发酵液的酶活最高，第5天时葡萄糖用量为3%的发酵液的酶活最高，第6天时葡萄糖用量为4%的发酵液的酶活最高，而在第7天时葡萄糖用量为5%的发酵液的酶活达到最高.推测原因可能是初始葡萄糖浓度过高导致产生“葡萄糖效应”即代谢物阻遏效应，从而影响了基因的表达.因此，在转化子发酵过程中维持培养基中葡萄糖的浓度在一个合适的水平，对于脂肪酶的高效表达十分重要.经优化，用对硝基苯酚比色法测定RML转化子的酶活，其最高可以达到15U/mL，是其在酵母中表达水平(0.3 U/mL［16］、1.4U/mL［17］)的10倍以上.江慧芳等［18］研究表明脂肪酶酶活的测定方法不同会导致测定结果在数值上存在差异，本研究采用的对硝基苯酚比色法测定的脂肪酶酶活在数值上仅为橄榄油－碱滴定法的1%左右.徐苏炜等［19］在毕赤酵母中表达RML基因，用橄榄油－碱滴定法测定的脂肪酶酶活为102U/mL;Brocca等［20］重组表达来源于皱褶假丝酵母的脂肪酶lip1，采用碱滴定法测定的酶活为150 U/mL;将其换算为对硝基苯酚比色法测定的酶活则只有1.02 U/mL和1.50U/mL，远小于本研究获得的重组黑曲霉的脂肪酶酶活，表明黑曲霉重组表达系统是非常有潜力的异源蛋白表达系统.3 结语将植物基因工程的技术应用于丝状真菌，建立了根癌农杆菌介导的黑曲霉转化体系，对提高工业微生物育种效率作了有益的尝试.利用该黑曲霉转化体系表达脂肪酶RML，经PCR鉴定、酶活检测、镍柱亲和层析及SDS-PAGE电泳检测等成功获得了脂肪酶RML的黑曲霉转化子，通过发酵条件优化实现了RML的高效表达，转化子的RML酶活是其在酵母中表达水平的10倍以上，为RML在油脂、食品、生物柴油、医药和日化等诸多领域的应用奠定了基础，也为异源蛋白在黑曲霉中的高效表达提供了研究线索.在此基础上，本研究将利用所获得的脂肪酶开展油脂转化生产生物柴油等工作，为重组脂肪酶的工业应用进行工艺探索.参考文献:［1］ Baker S E.Aspergillus niger genomics:past，present and intothe future 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根癌农杆菌介导工业化产甘油假丝酵母的遗传转化_饶志明
应用与环境生物学报 2007,13(6):868~871Chi n J App lEnvi ron B i o l =ISSN 1006-687X2007-12-25收稿日期:2006-11-21 接受日期:2007-02-12*国家自然科学基金(N o .30570142)、江苏省青年科技创新人才(学术带头人)基金(BK2006504)及及教育部长江学者和创新团队发展计划资助(I RT0532)资助 Supported by t he National Nat u ral S ci ence Foundati on of Ch i na (No .30570142),the You t h Scientific and Techno -l og i ca l Innovation Foundation of Ji angsu ,Ch i na and t h e P rogra m for C hangjiang Scholars and Innovati ve Res earch Tea m i n Un i versit y ofC h i na (I RT0532)**通讯作者 Correspond i ng author (E -m ai :l raoz m@yahoo .co m.c n )根癌农杆菌介导工业化产甘油假丝酵母的遗传转化*饶志明1**张君胜1,2沈微1 方慧英1 诸葛健1(1江南大学工业生物技术教育部重点实验室和工业微生物中心 江苏无锡 214036)(2江苏畜牧兽医职业技术学院 江苏泰州 225300)摘 要 通过构建质粒pCAM 3300-zeocin ,将其电击转化到根癌农杆菌LBA4404中.将含有目的质粒pC AM 3300-zeocin 的根癌农杆菌和工业化产甘油假丝酵母(Candi da glycerinogenes )W L2002-5共培养,利用z eoci n 抗性基因为筛选标记,实现了pCAM 3300-z eoci n 对产甘油假丝酵母的转化.并根据产甘油假丝酵母的生长特性,对转化条件进行了优化,在共培养时间为24h ,产甘油假丝酵母和根癌农杆菌的细胞比例为1B (500~1000)时最高转化率达到2个转化子/104个酵母细胞.初步建立了根癌农杆菌介导转化产甘油假丝酵母的转化方法.图3表2参12关键词 产甘油假丝酵母;转化;根癌农杆菌;zeocin 基因CLC Q 75:TQ 923Geneti c T ransfor m ation of Industrialized Strai n Cand i da g l yceri nogenesby Agrobacteri u m t u m efaciens*RAO Zhim i n g1**,Z HANG Junsheng 1,2,SHEN W e i 1,FANG H u i y i n g 1&Z HUGE Jian1(1K e y L aboratory of Indu st rial B iot echnol ogy,M inistry of Educa ti on,R ese arc h Cen t er of Industri a lM i croorg an is m s ,J i angnan Un iversit y ,W ux i214122,Jiangsu ,Ch i n a)(2Ji ang s u A ni ma lH u sband ry and Ve t erina ry Colle g e ,T ai zhou 225300,J i angs u,C h i na)Abstract In th i s resea rch ,the plas m id p CAM 3300-zeo cin was constructed and transf o r m ed i nto Agrobacter i um t umefaciens .The A.t u m efaciens con tai n i ng t he b i nary vector pCAM 3300-z eoci n w as co -cultivated w ith i ndustrialized stra i n Cand i da g l y cero logenes is W L 2002-5.T hen ,transfor m ants w ere screened on a plate conta i n i ng 150m g /L Z eo ci n .PCR results demon -stra ted t hat zeocin gene w as i ntegrated i nto nuclear genom e of C.glycerologenesis .R esearch results i ndicated tha t z eoci n gene cou l d be utilized as se l ec ti on m arker and the Z eoc i n coul d be used as selecti on pressure i n transfo r ma ti on o f C.g l y cero logene -sis .A cco rd i ng to the gro w th charac teristi cs o f C .g l y cero logenesis ,t he transfor m ation conditi ons were furt her opti m ized .T he re -sults show ed t hat the transfor m ation e ffi c iency cou l d reach t w o trasfor m ants per 104C.gl y cero logenesis cellw hen cocu lti vation ti m e re m a i ned 24hours and cell rati o o f C.g l y cero logenes is and A.tu m efaciens w as 1B 500~1000.The successf u lly construc -ted transfor m ation sy stem of C.gly cerologenesis by A.tu m efaciens can prov i de a pow erful too l f o r f urther research o f foreign g enes expressi on i n C.glycerologenesis .F i g 3,T ab 2,R e f 12K eyword s Agrobacteriu m tu m efaciens ;Candida gl y cerinogenes ;genetic transfo r ma ti on ;zerci n g ene CLC Q 75:TQ 923转化是酵母基因操作中的重要步骤之一.1978年H i n -nen [1]和B eggs [2]首次报道应用原生质体法将质粒成功转入酿酒酵母.目前广泛采用的酵母转化方法主要有原生质体转化法、醋酸锂转化法、电击转化法等,这些方法在酵母的遗传转化研究上已取得了巨大的成功[3].但是它们在转化工业化生产菌株产甘油假丝酵母时遇到了很大的困难.根癌农杆菌介导的遗传转化以其操作简单、转化率高、转基因低拷贝、易于得到稳定的转化子等特点,被广泛的应用于植物的基因转化.Bundo -ck 等[4]于1995年首次成功实现了根癌农杆菌介导酿酒酵母的遗传转化.耐高渗产甘油假丝酵母(Cand i da g l y cerinog enes )W L 2002-5是江南大学工业微生物研究中心的科技工作者经过30余年的潜心研究获得的工业化生产甘油的优良菌株.产甘油假丝酵母除了具有甘油产率高、耐高渗、生长快、发酵原料简单等优点,还能产生多种其他多元醇,如赤藓醇、D -阿拉伯醇和甘露醇等,因此是一类应用价值极高的酵母[5].采用基因工程手段构建重组菌是进一步改进产甘油假丝酵母性能的重要途径,实现这一目标首先要获得有效的载体和转化方法,在此基础上才有可能对产甘油假丝酵母代谢途径进行有目的的改造,以达到提高甘油产量和改善工艺的目的.因此,建立产甘油假丝酵母的遗传转化体系具有重要意义.常规的酵母转化方法转化产甘油假丝酵母未有成功报道.在作者成功建立根癌农杆菌转化酿酒酵母方法的基础上[6],本研究尝试了采用根癌农杆菌转化产甘油假丝酵母的可行性;并针对产甘油假丝酵母生长较快的特点结合本研究的转化方法对转化条件进行了适当的优化.1材料与方法1.1菌株和质粒根癌农杆菌LBA4404含利福霉素及链霉素抗性为本研究室保藏,耐高渗产甘油假丝酵母W L2002-5为本研究室保藏.质粒pCAM3300,含卡那霉素抗性由中国水稻研究所馈赠. zeocin抗性基因由本研究室工作人员从质粒pP I CZB上克隆得到,质粒pP I CZB购自Inv itrogen公司.pEGM-T-easy vector试剂盒为P rom eg a公司产品.1.2工具酶和试剂实验中的各种酶、氨基酸营养因子和抗生素(头孢噻肟除外)均购自上海华美生物工程公司,头孢噻肟和乙酰丁香酮(A cetosyr i ngone,A S)购自Sig m a公司,抗生素Zeoc i n购自上海普飞生物科技有限公司,质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自博大泰克,T r i s、CTAB、SDS购自S i gm a公司,其他化学试剂均为国产分析纯.1.3培养基LB培养基(Q/g L-1):蛋白胨10100、酵母膏5100、氯化钠10100;Y PD培养基(Q/g L-1):蛋白胨20100、酵母膏10100、葡萄糖20100;S M培养基(选择培养基)(Q/g L-1):酵母氮基6170、葡萄糖20100;p H610.MM培养基(基本培养基)、I M 培养基(诱导培养基)见文献[7,8].1.4根癌农杆菌的转化将含有zeo cin基因的质粒pCAM3300-zeocin通过电击法转化到根癌农杆菌LBA4404中.在卡那霉素抗性平板上挑取抗性转化子,提取质粒酶切验证.根癌农杆菌感受态的制备及转化方法见参考文献[7],根癌农杆菌质粒提取方法见参考文献[9].1.5根癌农杆菌T i质粒转化产甘油假丝酵母根癌农杆菌T i质粒转化产甘油假丝酵母的方法参考文献[10]并有所改进.接种含有质粒pCAM3300-zeocin的根癌农杆菌LBA4404于LB培养基(卡那霉素50L g/mL,利福霉素50 L g/mL,链霉素30L g/mL)中,30e,200r/m i n摇床培养36 h,离心收集菌体,用等体积的I M培养基重悬,培养6h;接种产甘油假丝酵母于Y PD培养基中,30e,200r/m i n摇床培养过夜;产甘油假丝酵母的Y PD培养液按1B5稀释到YPD新鲜培养基中,培养6h.分别离心收集产甘油假丝酵母和根癌农杆菌菌体,用生理盐水清洗一次,用I M培养基重悬菌体,产甘油假丝酵母细胞终浓度达到109个/mL,根癌农杆菌细胞终浓度达到1011个/mL,各取50L L加入20mL I M培养基(乙酰丁香酮200L m o l/L,卡那霉素50L g/mL,利福霉素50L g/mL)中30e,200r/m i n培养过夜.取200L L培养液涂布到铺有玻璃纸的I M+A S固体培养基平板置于25e培养24h;将玻璃纸转接到S M培养基(头孢噻肟200L m o l/L,Zoec i n150m g/L)上培养2d,筛选阳性酵母转化子.1.6产甘油假丝酵母阳性转化子表型验证将筛选的阳性转化子和产甘油假丝酵母同时在S M培养基(Z oeci n150m g/L)上划线30e培养24h后观察生长情况.1.7产甘油假丝酵母阳性转化子染色体的提取及PCR验证经过初步筛选的产甘油假丝酵母阳性转化子进行染色体提取和PCR验证.产甘油假丝酵母染色体的提取参考参考文献[11].根据z eoci n基因的特异性设计引物:引物F:5p-ATGGC-C AAGTTGA CCAGTGCCGTTC-3p;引物R:5p-GTCAGTCCT-GCT CCTCGGCCA CGAAG-3p.用该对引物在特定条件下扩增产甘油假丝假丝酵母染色体没有条带,扩增zeocin基因会得到大小为300bp的DNA片段.酵母18S r DNA两端引物:引物F:5p-ACCGGAATTCG-GCAGGGACGTAATCAACG C-3p;引物R:5p-ACCGGAATTCGC-CTGAGAAA CGGCTA CCAC-3p.PCR反应条件为:95e5m i n,94e变性50s,52e退火115m i n,72e延伸1m in,经过30个循环后,72e延伸10 m i n.PCR扩增产物用115%的琼脂糖凝胶电泳检测.1.8产甘油假丝酵母转化子稳定性验证将阳性转化子在YPD培养基斜面培养,24h后挑取菌落再次在YPD斜面培养基上划线培养.每转接一次定义为一代.转接10代以后挑取菌落接种于S M培养基(含Zoec i n150m g/ L)和YPD培养基对照实验,并提取染色体PCR验证.1.9转化条件优化策略1.9.1I M固体培养基诱导共培养时间优化取培养过夜的I M培养液,适当稀释涂布I M固体培养基,共培养0、12、18、24、30、36、40h将玻璃纸平行转移到S M固体培养基进行筛选培养,观察S M平板上转化子的生长情况.同时对I M培养液进行酵母菌落计数,计算转化率.1.9.2共培养根癌农杆菌菌体量优化取109个/mL的酵母细胞10L L,和1011个/mL的根癌农杆菌细胞1、10、50、100、200、500L L混匀共培养,筛选阳性转化子并计算转化率.2结果与讨论2.1质粒pC AM3300-zeocin的构建及酶切验证质粒的构建如图1,分别提取质粒pCAM3300、T-zeocin,经过E co RÑ酶切,胶回收zeocin基因和线性pCAM3300;在T4图1重组质粒pCA M3300-zeoc i n的构建Fi g.1C onstru cti on of reco m b i nant p l as m i d pCAM3300-zeoci n8696期饶志明等:根癌农杆菌介导工业化产甘油假丝酵母的遗传转化DNA 连接酶的作用下连接得到p CAM 3300-z eoci n .质粒p CAM 3300-zeocin 的酶切验证见图2,质粒p CAM 3300-z eoci n 经过Eco R Ñ酶切,切下了112kb 大小的片段,与预期的zeocin 基因大小一致,说明z eoci n 基因已成功地连入了载体pCAM 3300.2.2 根癌农杆菌阳性转化子的获得将在抗性平板上挑取的阳性根癌农杆菌转化子在液体LB 培养基(卡那霉素50L g /L )中培养24h 后提取质粒,将得到的质粒进行酶切验证(同图2未列出),证明已得到了含有质粒pCAM 3300-zeocin 的根癌农杆菌.图2 质粒pCA M 3300-zeoc i n 酶切验证Fi g .2 En z y m ati c d i gesti on of pCAM 3300-zeoci n1.T -zeocin /E co R Ñ;2.DL2000;3.zeoc i n /E co R Ñ;4.pCAM 3300/E c o R Ñ;5.pCA M 3300-zeoci n /Eco R Ñ;6.pCAM 3300-zeoci n /Bam H Ñ;7.K DNA /H in d Ó2.3 产甘油假丝酵母转化子的获得及初步鉴定在I M 培养基上共培养1d ;然后转移到S M 培养基(头孢噻肟200L m o l/L )上培养1d ,已经可以看到中间长出许多的酵母单菌落.挑取长势较好的酵母菌落,在S M 培养基上划线,30e 培养1d 后菌落生长良好的转化子可以初步确认为阳性转化子,转化子命名为Cand i da glycerinogenes-zeo cin (C .g -z).在产甘油假丝酵母的转化研究中,发现由于产甘油假丝酵母生长迅速,在I M 平板上诱导培养达到36h 时候产甘油假丝酵母菌落就已经长满I M 平板,无法进行后期抗性转化子的选择工作,因此我们对I M 固体培养基最佳诱导共培养时间进行了研究.2.4 产甘油假丝酵母转化子PCR 验证将初步确认的产甘油假丝酵母阳性转化子接中于Y PD 液体培养基中,30e ,200r/m i n 培养18h ,提取染色体进行PCR 鉴定,同时作阴性对照,琼脂糖凝胶电泳见图3.从图中可以看出,阳性转化子中可以扩增出zeocin 基因的特异性片断,而阴性对照染色体中无法扩增出该特异性片段,但产甘油假丝酵母染色体可以扩增得到18S rDNA 基因片段,说明产甘油假丝酵母的染色体是可以用于扩增的.由于产甘油假丝酵母染色体上不含有zeocin 基因,因此产甘油假丝酵母染色体无法扩增出zeocin 基因,而阳性转化子可以扩增得到zeoci n 基因,说明转化子中已含有了z eoci n 基因.PCR 鉴定的结果初步表明通过根癌农杆菌介导转化的方法已实现了zeocin 基因对产甘油假丝酵母转化.图3 阳性转化子PCR 验证Fig .3 PCR results of positive trans f or m ants1.zoecin 基因的特异扩增;2.DNA M arkerDL2000;3、4、5、6.阳性转化子zoe c i n 基因特异扩增;7.产甘油假丝酵母zoecin 基因特异扩增;8.产甘油假丝酵母18S r DNA 扩增1.Am p lified p roduct of zeoc i n gene ;2.DNA m ark er DL2000;3,4,5and 6.Amp lifi ed produ cts of positive trans f or m ants w ith p ri m ers of zeocin gene ;7.Amp lifi ed p roduct fro m geno m i c DNA of host strai n w it h pri m ers of zeoci n gene ;8.Am pli fi ed produ ct fro m geno m i c DNA ofh ost strai n w ith pri m ers of 18S r DNA2.5 转化条件优化结果在不同诱导共培养时间下产甘油假丝酵母的转化率见表1.从表1结果中可见,随着诱导时间的增加转化率也在增加.说明产甘油假丝酵母在根农杆菌介导的转化中,随着诱导时间的增加T i 质粒T-DNA 进入酵母细胞的几率增加.试验中发现,由于产甘油假丝酵母生长迅速,随着诱导共培养时间增加,当在I M 培养基上共培养达到30h 的时候产甘油假丝酵母就已经开始在玻璃纸上形成菌落,这时候再向S M 平板上转移玻璃纸,在S M 平板上转化子很难分辨,这对后期玻璃纸转移后的筛选增加了难度.而当共培养时间为36h 时在S M 培养基上则无法辨认转化子.因此应用这种筛选方法最佳的诱导共培养时间应该在18~24h 之间,不应超过24h .表1 不同共培养时间对转化率的影响T ab l e 1 E ffect o f cocu lti vation ti m e on transforma ti on effic i ency共培养时间Coculti va ti on ti m e (t /h)61218243036阳性转化子数P ositi ve tra nsf o r m a nts (n /103m L -1)15.0102.0310.0395.0452.0821.0无数产甘油假丝酵母细胞浓度Conce ntrat i o n of C.gl y cerino -genes cell (n /1093mL -1)2.5转化率(转化子/105产甘油假丝酵母细胞) T rasfor m at i o neffici ency (N o .o f tra nsf o r m a n t s /105C.g l yceri no g enes ce ll s)0.64.012.415.718.032.7无数:Num erous870 应用与环境生物学报 Chi n J App lEnvi ron B i o l 13卷在不同的根癌农杆菌浓度下产甘油假丝酵母的转化率见表2.相同酵母细胞浓度下500~1000倍的根癌农杆菌细胞浓度为最佳,当农杆菌的浓度再增大时转化率并无明显提高,浓度减小时转化率会降低.这与我们前期酿酒酵母转化研究中1B100的比例不同,可能是因为产甘油假丝酵母分裂增殖比较快,在产甘油假丝酵母细胞分裂前周围需要有更多的根癌农杆菌,增加他们的结合效率来提高T-DNA转入产甘油假丝酵母的几率.表2根癌农杆菌浓度对转化率的影响T ab l e2E ffect o f A.tu m efaciens ce lls p concentrationon transfor m ation e ffi c iency加入根癌农杆菌菌体量Am ounts of C.g l yce rinogenescell s added(V/L L)11050100200500阳性转化子个数Pos i ti ve transfor m an ts(n/103mL-1)536296352361343产甘油假丝酵母细胞数No.of C.g l yceri n o g enescell(n/109mL-1)1.51.62.02.21.71.8转化率(转化子/106产甘油假丝酵母细胞)Transfor m ati on effici enc y(No.oft rans for m a nts/106C.gl yc eri no ge nes cel ls)3.022.2147.2163208.7188.52.6转化子稳定性鉴定将转接了10代的转化子和原始菌株同在S M培养基(含Zeoc i n150mg/L)和Y PD培养基划线30e培养对照培养,在d1观察发现,转化子在两种培养基上均生长良好,原始菌株则无法在S M培养基上生长.提取染色体PCR验证,转化子依然可以扩增到zeoc i n特异条带.这些结果初步表明,产甘油假丝酵母阳性转化子特性可以稳定遗传.3讨论本研究通过将含有目的质粒pC AM3300-zeocin的根癌农杆菌LBA4404和产甘油假丝酵母共培养,利用zeocin抗性基因为筛选标记,得到了阳性转化子菌株.根据zeo cin基因序列特异性设计引物,利用该引物进行了PCR验证,在产甘油假丝酵母染色体中无法扩增出目标产物,而在阳性转化子染色体中可以扩增得到目标产物,初步证明z eoci n基因已经成功地转入了产甘油假丝酵母染色体.表型验证结果也说明zeocin基因已经转入了产甘油假丝酵母.以上结果表明,已初步成功建立了根癌农杆菌介导转化产甘油假丝酵母的方法.研究中还根据根癌农杆菌的生长特性,对转化诱导共培养时间以及酵母细胞和农杆菌细胞比例进行了优化,发现最佳共培养时间为24h,最佳细胞比例为1B500~1000,最高转化率达到2个转化子/104个酵母细胞.根癌农杆菌转化系统具有操作简单(不需要制备原生质体)、转化效率高、易于得到转化子、转化子遗传稳定等优良的特点[12].本研究成功建立了根癌农杆菌介导转化产甘油假丝酵母的方法,为开展相关产甘油假丝酵母的分子生物学研究,尤其是为将外源基因导入工业化产甘油假丝酵母进行表达提供了有力的工具.目前我们正在进一步采用根癌农杆菌转化法将酵母甘油合成的关键酶基因导入产甘油假丝酵母基因组中,相关结果将另文发表.R eferences1H i nn en A,H ic k s J B,F i nk GR.T rans f or m ati on of yeas t.Proc Na tlA c ad Sci U SA,1978,75(4):1929~19332Beggs J D.Transfor m ati on of yeast by a rep licating hybrid p l as m i d.N a-t ure,1978,275:104~1093L iM(李敏),N ie DS(聂东宋).C l on i ng and expression of a neu ro-tox i n p epti de gene f ro m Ch i nese b i rd s p i der(S ele nocos m i a huw e na)i n yeas t.Ch i n J Appl E nviron B iol(应用与环境生物学报),2006,12(5):651~6554Bundock P,Am keden DR,Be ij ersbergen AG M,H ooykaas PJ.T rans-k i ngdo m T-DNA trans f er fro m Agroba cte rium t um e fa cie n s to Saccharomy-c e s ce revisi a e.EM BO 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根癌农杆菌介导的真菌转化
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根癌农杆菌介导的真菌转化
(一)农杆菌电击感受态制备及电击转化A感受态的制备
1)将农杆菌菌液划线于Yeb平板（50μg/mlkana），28℃，36-48h。
2)挑单菌落至3mlYeb试管（50μg/mlkana）中，28℃，200rpm培养过夜。
3)转1ml至50mlYeb中，28℃，200rpm培养至oD600=0.8。
4)于4℃，5000rpm，10min收集菌体。
5)用50mL10%的甘油（去离子水配置，湿热灭菌）洗沉淀3次（4℃，5000rpm，10min），洗涤时一定要把菌体悬浮均匀。
6)重悬于1ml10%甘油中（约1011个细胞/ml），可立即使用，或分装为每管50μl，液氮速冻后，-80℃保存备用。
b电击转化
1)将1μl质粒加入到农杆菌感受态细胞中，混匀，转至无菌预冷的电击杯中。
2)将电击杯放入电转化仪的电极之间，16kv/cm，5ms。
3)取出电击杯，迅速加入200-300μlYeb（不加抗生素），并将混合液转入ep管中。
4)于28℃，220rpm，2-3h。
5)将50-100μl菌液涂布于Yeb平板（50μg/mlcar和50μg/mlkana）上，于28℃培养2-3天后，挑斑鉴定。
(二)农杆菌化学感受态制备及化学法转化petentcells
1)Inoculateasinglecolonyto5mlLb2)growat28℃tologphage,shakingat250rp m
3)Inoculate2mlofthecultureto50mlLbmediumandgrowtooD600=0.5ca.8h ours4)chillonicefor10minutes
5)spindownthecellsbycentrifugationat3000g(8000rpm)for10minutesat4℃
6)Resuspendcellsin1mlof20mmcacl2
7)Aliquotsinto0.1ml,thenfreezeinliquidnitrogen,andstoreat-80℃bplasmid Transformation
1)Thawcompetentcellsonice.
2)Add1μgplasmid(5μl)tothecompetentcellsandmixwell.3)Freezeinliquidni trogenfor5min.4)heatshockat37℃for5min.
5)Add1mlLbandgrowat28℃for3hrwithshakingat150rpm.
6)spreadcellsontoLbplatescontaininganappropriateantibioticandincubate atroom
temperaturefor2-3days.
(三）农杆菌介导的真菌转化
1将已转入目的质粒的农杆菌接种于4mlYeb液体培养基（50μg/mlcar和50μg/mlkana）中，于28℃摇床中220rpm过夜培养（16-20h）。
2将培养液12000rpm,3min，并用ImAs液体重悬菌体至oD660=0.1-0.15，体积约为10-15ml（一般用50ml三角瓶）。
3于28℃摇床220rpm培养6-7h。
4制备真菌孢子悬液，浓度105-106/ml（制备方法参见（四））。
5将上述农杆菌菌液100μl和孢子悬浮液100μl混匀，涂布于ImAs
平板（涂板后要将其风干至未见明显水纹为止），25℃共孵育2天。
6用3-5ml无菌水洗涤共孵育2d后的培养物，将充分混匀的洗涤物200μl涂布于m-100平板（200μg/mlppT和300μg/mlcef）上，适当风干后，放入25℃培养，5-6d后挑选生长比较大的菌落于48cellsDAY 板。
7培养3-4天，再将48cellsDAY板中的菌丝转接到小平板（直径6cm，贴有玻璃纸）上，3d后抽提基因组验证是否转化成功。
(四）孢子悬液的制备（现配现用）
1从培养约14d的pDA平板上刮取适量的孢子粉到1.5ml无菌的0.05%Tween-20中，涡旋分散。
2用脱脂棉过滤除去菌丝，滤液收集于1.5mlep管中，12000rpm，3min收集孢子。
3去上清，用1ml无菌水重悬孢子，12000rpm，2min，再次收集孢子。
4再用适量的无菌水重悬孢子，血球计数板计算孢子数目，并将孢子悬液调到105-106/ml。
(五）相关培养基配方1Yeb培养基
蔗糖0.5%（w/v）细菌用酵母提取物0.1%（w/v）细菌用蛋白胨1%（w/v）mgso4.7h2o0.05%（w/v）
121?c灭菌20min，固体加入1.5%琼脂粉
2培养基母液（stocksolutions）2.12.5×mmsaltsforIm1L
K2hpo43.625gKh2po45.125gmgso4.7h2o1.25gnacl0.375gcacl2.2h2o(w/v
)0.165gFeso4.7h2o(w/v)0.0062g(nh4)2so4(w/v)1.25g
Dissolveeachsaltoneatatime,donotautoclave.storeatroomtemperature.Fi nalsolutiontypicallycontainsasmallamountofwhiteprecipitate.2.2m-100tr aceelementsolution
h3bo330mgmncl2.4h2o70mgZncl2200mgna2moo4.2h2o20mgFecl3.6h2 o50mgcuso4.5h2o200mgddh2oTo500mlfinalvolume
2.3m-100saltsolution
K2hpo416g
na2so44g
Kcl8g
mgso4.7h2o2g
cacl21g
m-100Traceelementsolution8ml
ddh2oTo1Lfinalvolume
3mediaandplates3.11mmes
称9.762gmes，溶于约40mlddh2o中，然后用5mKoh调ph值至5.3，最后定容到50ml，并过滤灭菌。
3.210mmAs
称0.0981gAs，溶于约40mlDmso中，然后用5mKoh调ph值至8，最后定容到50ml，并过滤灭菌。
3.3Inductionmedium(Liquid)
Ingredients1xmmsalts10mmglucose5‰glycerolddh2o
Autoclave.coolto50℃,thenadd:
40mmmes
200μmAs
For200mlmedium
80mlof2.5xmm0.36g1ml
To188mlfinalvolume8mlof1mstock4mlof10mmAs
notethatthereistwiceasmuchglucoseintheliquidinductionmediumthanthe inductionmediumplates.
3.4Inductionmediumplates:
IngredientsFor200mlmedium1xmmsalts80mlof2.5xmm10mmglucose0.1 8g5‰glycerol1mlddh2oTo188mlfinalvolume1.5%Agar3g
Autoclave.coolto50℃,thenadd:
40mmmes8mlof1mstock
200μmAs
4mlof10mmAs
3.5m-100plateswith300μg/mlcefotaximeand200μg/mlppTIngredientsFor 1000mlmediumm-100saltsolution62.5mlglucose10gKno33gddh2oTo100 0mlfinalvolume1.5%Agar15g
Afterautoclavingandcoolingthemediumuntilitisjustwarmtothetouch,add3 ml100mg/mlcefotaximeandappropriatevolumeofppT(dependingonconce ntrationofcommercialstock).
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