酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
酵母双杂中文手册
蛋白的酵母双杂交实验——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用第一部分 系统简介1. 实验原理蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。
很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。
这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。
目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4系统两种。
在LexA 系统中，DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。
在利用GAL4系统筛选cDNA 文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。
一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。
在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。
GAL4系统的原理如图所示：图一：酵母双杂交系统工作原理Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA 生物 w .e b i o e .c o m2．系统特点同以往研究蛋白质—蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优势。
酵母双杂交实验流程(精)
模块七蛋白质之间的相互作用1. 实验目的本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。
主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术; 让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。
2. 实验原理1989年 Fields 和 Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与 ,提出并建立了酵母双杂交系统。
该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台,近几年得到了广泛的运用和发展。
相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1检测在真核活细胞内进行,在一定程度上代表细胞内的真实情况。
(2作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
(3检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。
(4酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。
(5 通过 mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。
同时,酵母表型、 X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。
酵母双杂交系统也具有一定的局限性。
首先, 经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内, 因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。
酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性” 。
在酵母双杂交系统建立的初期阶段,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。
由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使 DNA 结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。
另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域, 能与其他蛋白形成稳定的复合物,从而引起报告基因的表达,产生“假阳性”结果。
酵母双杂交的原理及流程
酵母双杂交的原理及流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质之间的相互作用。
酵母双杂交试验流程
酵母双杂交试验流程4月4日划线配培养基te/liacpeg/liac从培养基（ypdypda）中提取酵母细胞，划线30°培养3天。
所需产品：三角瓶灭菌密封膜酵母膏蛋白胨注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。
4月6号星期三（1）选择2-3mm单克隆抗体（枪头抽吸），放入3-5ml ypda液体培养基中。
将细菌在30°下摇动200rpm，持续8小时7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。
所需用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、ypda液体培养基、摇床。
4月7号星期四（2）吸取2.5-10ul酵母培养基，加入25mlypda液体培养基，摇匀16-20h，直至OD值为0.15-0.3。
下午4点开始8号8点结束提示：由于首次激活的细菌夜间浓度不同，建议在此处设置梯度。
分别取2.5、5和10微升酵母培养基，并添加25毫升PDA液体培养基（如果转化的质粒少于5个，则25毫升细菌足以供后续使用）。
4月8号星期五（3）将细菌溶液转移至已灭菌的50ml离心管中，用天平平衡，并在室温下离心700g 5分钟。
（4）弃掉上清，加入50ml新鲜的ypda液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒滴上清液时要小心）。
（5）30°震荡培养，直到od值达到0.4-0.5（3-5h）。
8号8点开始下午一点结束在进行以下操作之前，准备TE/liac溶液并准备冰浴。
（6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。
（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。
（8）再次用天平平衡后，在室温下离心700g 5分钟，丢弃上清液并添加1.5ml 1 1xte/liac悬浮液。
（9）将上述溶液转移至已灭菌的1.5mlep试管中，高速离心15s。
（10）弃去上清，加入600ul1.1xte/liac，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。
酵母双杂交实验步骤
酵母双杂交实验步骤嘿，咱今儿就来唠唠酵母双杂交实验步骤这档子事儿！首先呢，你得准备好各种材料和试剂，这就好比要做饭得先把食材准备齐全一样。
酵母细胞那肯定是不能少的，就像做菜得有主要的食材原料呀。
然后呢，构建好你的“猎物”和“诱饵”载体。
这“猎物”和“诱饵”就像是游戏里的角色，得给它们打扮得妥妥当当，让它们能在这个实验的“大舞台”上好好表现。
接下来，把这些载体转化到酵母细胞里。
哎呀，这就好像把演员送上舞台，让它们开始表演啦。
之后，就是筛选的环节咯。
这就好比在一群人里找出最有特点、最合适的那一个，得仔细着点呢。
再然后，对筛选出来的阳性克隆进行验证。
这可不能马虎呀，得反复确认，就像你买了个宝贝，得好好鉴定鉴定是不是真货一样。
接着呢，分析实验结果。
这就像是看完一场精彩的表演后，得回味回味，看看哪里演得好，哪里还能改进。
在整个过程中，每一步都得小心谨慎，就跟走钢丝似的，一个不小心可能就前功尽弃啦！你想想，要是前面都做得好好的，到最后一步掉链子了，那不就太可惜了嘛！做这个实验啊，真的需要耐心和细心，就跟绣花似的，一针一线都不能马虎。
而且还得有敏锐的观察力，就像侦探一样，能从蛛丝马迹中发现关键信息。
咱再回过头来想想，这酵母双杂交实验不就像是搭积木嘛，一块一块地往上搭，每一块都得放对地方，最后才能搭出漂亮的城堡。
如果有一块放歪了，那这城堡可就不牢固啦！所以啊，做这个实验可得打起十二分的精神，不能有丝毫懈怠。
要是因为一点点小失误导致实验失败，那多不甘心啊！总之呢，酵母双杂交实验步骤虽然有点复杂，但只要咱认真对待，一步一个脚印地去做，肯定能取得好结果的。
加油吧！。
630490 酵母双杂交文库构建实验流程(clontech)
第一链cDNA合成1.准备: 高质量的Poly A 或总RNA2. 在微量离心管中混匀以下试剂：1–2 μl RNA 样本(0.025–1.0 μg poly A+或0.10–2.0 μg 总RNA)1.0 μl CDS III 或CDSIII/6 引物1–2 μl 去离子水(补齐体系到4.0 μl)4.0 μl 总体积注意: 对照实验时，请使用1μl *1μg+ 的对照RNA。
CDSIII = Oligo-dT；引物CDSIII/6 =随机引物3. 72°C ，孵育2 min。
4. 冰上冷却2 min，然后14000rpm，10sec，瞬时离心。
5. 混合以下试剂，将混合液加入Step4中的经过变性且结合有引物的RNA样本中，轻拍混匀。
2.0 μl 5X First-Strand 缓冲液1.0 μl DTT (100 mM)1.0 μl dNTP 混合物(10 mM )1.0 μl SMART MMLV 反转录酶6. 只有使用随机引物(CDSIII/6)实验才进行此步骤[如果采用Oligo-dT(CDSIII)请忽略此步骤，直接进行Step7]，25°C，室温孵育10 min。
7. 42°，孵育10 min。
注意: 孵育在热盖的PCR仪中进行。
若用非热盖的PCR仪或水浴，请在反应管中加入一滴矿物油来避免水分蒸发。
8. 加入1 μl SMART III-modified oligo，混匀，42°C，孵育1 hr。
9. 75°C ，10 min终止第一链合成反应。
10. 室温冷却，加入1 μl RNA酶H (2U)。
11. 37°，孵育20 min。
12. 继续进行LD-PCR 扩增(Section VII.B)。
注意: –20°C下可保存3个月。
第一链反应最终体积为15μl• 10 μl SMART III Oligo(10 μM; 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG CCATTATGGCCGGG-3’)• 10 μl CDS III 引物(10 μM; 5’-AT TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA TG-d(T)30VN-3’)*23个碱基• 10 μl CDS III/6 引物(10 μM; 5’-AT TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA TG-NNNNNN-3’)注意: N = A, G, C, or T; V = A, G, or C• 50 μl 5’ PCR 引物(10 μM; 5’-TTCCACCC AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’)25个碱基•50 μl 3’ PCR 引物(10 μM; 5’-GTATCGATGCCCACCC TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’)第二链cDNA合成（LD-PCR）尽量使用最小的循环数来得到3-6ug的ds cDNA。
酵母双杂交操作步骤
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
酵母双杂交技术1
发展背景
酵母双杂交系统是由Fields等在1989年提出的一种在活细 胞中鉴定蛋白质相互作用的遗传系统。
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始
过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录因子都是由 两个可以分开的、功能上相互独立的结构域组成的。
酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析 蛋白质相互作用的技术。 它可用于： 检验蛋白质间的相互作用； 分析蛋白质相互作用的结构域； 发现新的作用蛋白质。
酵母双杂交技术的原理
基于对真核生物基因调控转录起始过程的认识。 基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构，而且也需 要有反式转录激活因子的参与。 转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构 成,其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, DB)和转录激活 结构域(activation domain, AD), 它们都是能激活基因转录，但不同转录激活因子 的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。
酵母双杂交操作主要流程
1. 2. 3. 4. 5. 6. 分别构建BD和AD融合蛋白载体 分别将重组载体转化酵母菌细胞 对酵母转化子进行自激活检测 将重组载体共转化酵母菌细胞 检测报告基因表达产物 分析酵母双杂交实验结果
酵母双杂交技术的优点：
1. 是一种细胞内蛋白质相互作用研究技术，比体外的蛋白 质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。
如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两 个蛋白分别与DB和AD形成的融合蛋白。 与DB 融合的蛋白称为“诱饵”(bait)， 与AD融合的蛋白称为“猎物”(prey)。 如果这两个蛋白能发生相互作用, 这两个融合蛋白上的 DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活报告 基因(reporter gene)的转录与表达。通过检测报告基因的 表达产物, 可判别“诱饵”和“猎物”这两个蛋白质之间是 否存在相互作用。
酵母双杂实验操作手册和注意事项
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。
基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。
后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。
酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000ml) （？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖 20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
酵母双杂实验步骤
2.1.1 酵母双杂交2.1.1.1 Gateway入门克隆设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TTG-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TTG-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。
其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。
通过PCR扩增获得带有attB位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。
获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下：将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。
进行BP反应时，需注意以下几项：(1) 对于BP反应来说，最高效的是采用线性的attB-PCR产物和超螺旋的attP入门载体；(2) 为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的；(3) 提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物最好不要超过250ng。
TAKARA酵母双杂交实验步骤
酵母双杂交实验方法一）酵母感受态细胞的制备1. 于YPDA平板上划线培养酵母Y2H Gold菌株，30℃培养约3d；2. 挑取单菌落（2-3mm）接种于YPDA液体培养基中，30℃、250rpm摇培8-12h；3. 接种0.5μL至5mL YPDA液体培养基中（1:1W的接种比例），30℃、250rpm 摇培至OD600 = 0.15~0.3（16-20h）；4. 700g离心5min，弃上清后用10mL YPDA（2倍体积）重悬；5. 30℃、230rpm摇培至OD600 = 0.4~0.5（3-5h）；6. 将10mL菌液分装成2管5mL，700g离心5min，用3mL ddH2O重悬（0.6倍体积）；7. 700g离心5min，用150μL 1.1×TE/LiAc重悬（0.05倍体积）；8. 转移至1.5mL离心管后，高速离心15s；9. 用60μL 1.1×TE/LiAc重悬（0.02倍体积）。
二）酵母感受态转化方法1. 感受态细胞转化体系：感受态细胞50μLYeastmaker Carrier DNA（10ng/μL）5μL质粒DNA 100ng**共转化时，prey的质粒DNA量两倍于bait于50μL酵母感受态细胞中依次加入5μL Carrier DNA、100ng 质粒DNA，共转化时，猎物蛋白（未知蛋白）质粒DNA量为诱饵蛋白的2倍。
2. 混匀后加入500μL PEG/LiAc，30℃孵育30min，每10min轻微混匀；3. 加入20μL DMSO，42℃水浴15min，每5min轻微混匀；4. 10000rpm离心15s，用1mL YPD Plus重悬；5. 10000rpm离心15s，用1mL 0.9% NaCl重悬；6. 涂布于二缺培养基，30℃培养。
酵母双杂交流程
酵母双杂交流程嘿，朋友们！今天咱就来讲讲酵母双杂交流程，这可真是个有趣又神奇的事儿啊！咱先来说说酵母这小家伙，它就像是个勤劳的小精灵，在我们的实验里扮演着重要的角色呢。
那酵母双杂交是啥呢？简单来说，就是让两个蛋白质在酵母里“相遇”，看看它们能不能擦出点“火花”。
首先呢，我们得准备好各种材料，这就像是给酵母小精灵们准备好吃的和好玩的。
要有合适的酵母菌株，就像给它们准备了一个舒适的家。
然后呢，把我们感兴趣的两个蛋白质对应的基因分别连到不同的载体上，这就像是给它们穿上了特定的“衣服”，让它们能被酵母认出来。
接下来，把这两个带着基因的载体一起转到酵母里去。
哇，这时候就好像把两个小伙伴放到了一个大派对里，它们开始在酵母的世界里活动啦。
如果这两个蛋白质能相互作用，那就会产生一些特别的信号，就像是它们在悄悄说“嘿，我找到你啦”。
你说这神奇不神奇？就好像我们在一个微观的世界里导演了一场小小的戏剧。
然后我们就通过各种检测手段，去发现这些信号，看看这两个蛋白质是不是真的“看对眼”了。
要是它们真的相互作用了，那可就太棒啦！这就像是我们找到了一把解开谜题的钥匙。
想想看，通过这么一个小小的实验，我们就能知道蛋白质之间那些神秘的关系，是不是很有成就感呢？而且啊，这个过程中也会有很多小惊喜和小挑战呢。
有时候可能会出现一些假阳性或者假阴性的结果，就像生活中有时候会出现一些小误会一样。
但这也是实验的乐趣所在呀，我们要像侦探一样去仔细分析，找出真正的答案。
你看，科学就是这么神奇又有趣，小小的酵母也能给我们带来这么大的发现。
所以啊，别小看了这些看似普通的实验步骤，每一步都可能隐藏着巨大的奥秘呢！咱就得认真对待，仔细钻研，说不定就能在这个酵母的世界里发现大宝藏呢！这酵母双杂交流程，真的是让人着迷啊，你说是不是？。
Mate_Plate酵母双杂交文库构建中文说明书(clontech)
系统说明书PT4085-1 (PR013451)Cat. No. 630490Published February 2010“Mate & Plate™”文库构建系统说明书目录I. 介绍&操作流程 (4)II. 组份列表 (5)III. 附加产品推荐 (7)IV. 缩写列表 (8)V. 宿主菌株信息 (9)VI. 对照实验 (10)A. 总论 (10)B. 操作:对照同源重组克隆的实验操作 (10)VII. cDNA文库构建 (11)A. 操作:第一链cDNA合成 (11)B. 操作:长距离PCR (LD-PCR)扩增cDNA (13)C. 操作: CHROMA SPIN™ TE-400 纯化ds cDNA (14)VIII. 双杂交文库构建 (16)A. 酵母双杂交文库构建&筛选总论 (16)B. 操作:制作Mate & Plate文库 (16)IX. 参考文献 (18)X. 疑难解答指南 (19)附录A: 文库滴度测定 (24)附录B: 质粒信息 (22)附录C: 酵母生长培养基&补充物 (23)附录D: SMART™ 技术概述 (25)Protocol No. A Clontech Laboratories, Inc. Version No. PR013451 Takara Bio Company2“Mate & Plate™”文库构建系统说明书目录，续图表Figure 1.利用酵母的生物学知识构建Mate & Plate文库 (4)Figure 2. Mate & Plate文库构建概述 (11)Figure 3. SMART cDNA合成高质量cDNA (14)Figure4. CHROMA SPIN纯化柱和收集管 (15)Figure 5. pGADT7-Rec 载体图谱和克隆位点 (22)Table I:酵母宿主菌株的基因型 (9)Table II:根据不同SD培养基的表型测试 (9)Table III: RNA起始量和PCR最优循环数的相关性分析 (13)Table IV:酵母培养基套装2&酵母培养基套装2Plus的各组份 (23)Table V: Matchmaker黄金酵母操作用独立包装的酵母培养基 (23)Table VI:酵母双杂交筛选用的附加培养基&培养基补充物 (24)＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿A Clontech Laboratories, Protocol No. PT4085-1 Takara Bio Company Version No.PR0134513“Mate & Plate™”文库构建系统说明书1.介绍&操作流程酵母双杂交系统主要是从prey文库中筛选与已知蛋白（bait）有相互作用的蛋白（prey）。
第一实验：酵母双杂交（YeastTwo-Hybrid）
第一实验：酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）一、目的掌握酵母双杂交原理和方法。
利用酵母双杂交方法在拟南芥转录因子AP2-EREBP家族中筛选与拟南芥Med25有相互作用的蛋白。
二、原理酵母双杂交系统由 Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。
典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain，DBD)和转录激活结构域(transcription-activating domain，AD)。
DNA结合结构域可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
二个结构域可在其连接区适当部位断开，仍具有各自的功能。
将两个待测蛋白分别与这两个结构域组成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与DBD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
图 1-1 酵母双杂交基本原理酵母双杂交系统在发展中增添了接合型酵母双杂交和反向酵母双杂交系统。
其中接合型双杂交系统就是已预先将文库转化了某个接合型的单倍体酵母，然后再和转化了诱饵质粒的相反接合型的单倍体进行接合，形成二倍体，并检测报告基因的表达。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与DBD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
酵母双杂交系统常应用在：(1)研究两个已知蛋白是否存在相互作用，同一蛋白是否有自身相互作用以及相互作用的分子区域。
酵母双杂交原理和具体流程
酵母双杂交原理和具体流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!一、酵母双杂交原理。
酵母双杂交是一种利用酵母遗传学方法来研究蛋白质相互作用的技术。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？各种SD培养基：1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his（组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4) SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5) SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
我们这用的是含硫酸铵的。
（买来就加进去了的）。
如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。
实际配制的方法是：1. 配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。
（过滤即可使用）2. 酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（大约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。
3. 高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。
YPD培养基(1000 ml)20 g/L 蛋白胨10 g/L 酵母提取物20 g/L 琼脂（只有制作平板才用）20 g/L 葡萄糖 (即2%)1x YPDA培养基(1000 ml)20 g/L 蛋白胨10 g/L 酵母提取物0.03 g/L 腺嘌呤 （即终浓度为0.003％）腺嘌呤可以耐受高温20 g/L 葡萄糖 (即2%)实际配制的方法是：1. 配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。
（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2. 配制0.2%的腺嘌呤溶液，过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将15ml腺嘌呤溶液加入。
（或将腺嘌呤直接加进去，为了方便我将直接加进去一起高压）3. （蛋白胨 20g ；酵母提取物10g ；水大约925ml）混合后，调至PH至6.5，加水至935ml，121℃高压15min。
注意：高压的温度和时间不能太长与太高，121℃高压15min即可。
可以在YPDA中加入20 g/L的琼脂，以配成平板。
需要加kanamycin时，kan终浓度是10–15 mg/L。
（kanamycin可以20℃贮存一个月，加入到平板中去可以4℃贮存一个月。
）PEG/LiAc溶液（即配即用）用下列贮存液来配制50% PEG 3350：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。
10X TE buffer：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。
10X LiAc：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。
最后配成PEG/LiAc溶液是：（以10ml为例）终浓度 为配制10mlPEG/LiAc需要加入的物质PEG 4000 40% 8 ml of 50% PEGTE buffer 1X 1 ml of 10X TELiAc 1X 1 ml of 10X LiAc无菌1x TE/LiAc溶液（用10x已灭菌的贮存液稀释）10x TE buffer :0.1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.5(高压)10x LiAc ： 1 M 用稀醋酸调节PH至7.5 高压For β-galactosidase 滤膜实验Z buffer溶液：Na2HPO4• 7H2O 16.1 g/L （如换Na2HPO4• 14H2O 则 20.739 g/L）NaH2PO4• H2O 5.50 g/L （如换NaH2PO4• 2H2O 则 6. 21g/L）KCl 0.75 g/LMgSO4 • 7H2O 0.246 g/L最后调PH至7.0，高压，室温下可以贮存1年X-gal 溶液：X-GAL溶解于DMF（二甲基甲酰胺）中至浓度为20 mg/ml.，–20°C避光保存Z buffer/X-gal 溶液：100 ml Z buffer0.27 ml β-mercaptoethanol （β-巯基乙醇）1.67 ml X-gal 贮存液ONPG 溶液：（即配即用）ONPG溶于Z buffer中，终浓度4 mg/ml，调PH至7.0.注意：1. ONPG需要1～2h才能溶解2. 每次用之前新鲜制备。
带有β-巯基乙醇的Z buffer将0.27 mlβ-巯基乙醇加入100 ml Z buffer中即可为了转化成功的小提示：1.用一个1～3周龄（直径2～3mm）的菌落去接种液体培养基。
如果菌落直径＜2mm，就用多几个菌落去接种。
（也要大力涡旋使细胞团分散开来。
）2.如果过夜或者3hr之后的培养基明显成块，那么在使用之前一定要充分涡旋使培养基。
3.当通过离心收集细胞的时候，使用一个离心管即可，可以更好、更充分地收集细胞。
4.为了提高转化效率，要在1小时内准备酵母感受态细胞。
如果有必要，可以在11步之后在室温条件下储存酵母感受态细胞几个小时，而活性却只有一点降低。
5.当进行通同转化的时候，诱饵（BD）质粒的量必须过度，而AD质粒的量要不足。
一般BD是AD的两倍。
（李博士：此要求一般是针对文库筛选而言）6.为了使菌落更好地生长，在涂布转化复合物到琼脂平板上时要直到所有液体被吸收。
可以选择直径5mm的无菌玻璃珠（每一个100mm的平板用5-7个玻璃珠，直径150mm的平板用7-9个玻璃珠）去促进转化复合物的扩散，摇动的时候shake the plate back and forth—not round and round. （科内似并无此操作，而仅仅以玻棒涂布耳）一. 复苏酵母：将酵母细胞接种到YPD固体培养基中培养，培养1-3周。
（接种的时候采取四区分区画线法）二. 酵母感受态细胞置备和转化步骤：1.取直径2～3mm的克隆接种到1ml的YPD或SD培养基中。
2.剧烈振荡或涡旋5min，使所有团块分散开来。
3.转移酵母液到50 mlYPD（？固体——也有液态的，未加入琼脂粉耳）或者SD培养基中。
4.置于30℃摇床中，以250 rpm的转速震荡培养基16～18h，直到OD600>1.55.转移部分过夜培养物（30ml）到300mlYPD培养基（？固体）中，使最终OD600在0.2～0.3之间。
6.30℃摇床以230 rpm的转速震荡培养基3～4h直至OD为 0.4～0.6.（If the OD600 is < 0.4, something is wrong with the culture）7.转移酵母液至50ml离心管中，1000g室温（20～21°C）离心5min8.弃去上清，加入25～50ml无菌水或无菌的1x TE重悬酵母。
9.在1000g室温（20～21°C）条件下离心5min10.轻轻倒出（弃去）上清11.将细胞重悬于1.5ml新鲜准备的，无菌的1xTE/1xLiAc（在实验开始之前置备）(至此酵母感受态细胞制备完毕)12. 向无菌的1.5ml微量离心管中加入质粒DNA各0.1ug和0.1mg鲱鱼精载体DNA，之后轻轻混匀。
13.再向每管中加入0.1 ml 酵母感受态细胞，并且震荡混匀。
14.向每一管加入600 ul无菌PEG/LiAc溶液，高速振荡混匀。
15.30℃摇床以200 rpm的转速振荡培养30 min16.向每一管加入70 ul DMSO 轻轻颠倒混匀，不要震荡。
17.42℃水浴热激15 min18.取出后在冰上冷却1-2 min19.1000 rpm室温离心5 min，弃去上清。
20.用0.5 ml 无菌的1×TE重悬酵母。
21.取合适体积的菌液（一般是100 ul）涂在选择性的SD培养基的平板上，在30℃培养箱中培养2-4天。
（将克隆分成三份涂与不同平板上，1/3涂在SD/–His/–Leu/–Trp，1/3涂在SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp，最后1/3涂在SD/–Leu/–Trp上。
）（科内仅涂布二缺与四缺板）（在21步之后涂一个二缺板和一个四缺板）因为在二缺板中AH109能生长，说明BD和AD已经转进去了。
如果在四缺板中能生长，说明诱饵和文库肯定有作用，接着做一个α- gal实验。
如果是将质粒转到Y187中的话，21步之后涂一个二缺板就行了。
如果酵母能生长的话就接着做一个β- gal。
所以有的人同时转化两种菌种。
这样就完全可以确定两蛋白是否有作用了。
之后计算转化率，如果转化率达到10的6次方以上，那么就可以接着做后面的检验实验。
三. α和β-gal实验：（我就做β-gal试验，要注意如果做β-gal的话，这时候菌种要换成Y187，而不是之前的AH109）（在protocol 的24～28页）1.试剂：2.原理：ONPG为无色物质，在β-半乳糖苷酶的作用催化下生成黄色的onitrophenol(硝基苯酚)，在420 nm (OD410)处有光吸收。
Na2CO3可以提高PH值，使酶变性，从而终止反应。
（Na2CO3在配制时，不需要高压）3.实验方法一. Colony-lift Filter Assay（滤膜分析或滤膜试验）（这是定性试验）a) 将要测试的菌株（直径1-3mm）转接到新的选择性SD培养基中，30℃培养2-4天。