大豆蛋白的酶解及其抗氧化活性研究

表 1 正交实验设计及结果
C
D
#OH 清除
加酶量/ %
pH
率/ %
1( 0. 6) 2( 0. 8) 3( 1. 0)
1(8. 5) 2( 9)
3(9. 5)
39. 98 48. 95 52. 27
2
3
53. 28
3
1
48. 44
1
2
49. 97
3
2
47. 95
1
3
49. 76
2
1
50. 39
46. 570 50. 873 49. 553 4. 303 73. 503 72. 650
三氯乙酸溶解的是小分子蛋白 或肽, 大分子 的 蛋白或肽都在三氯乙 酸的作用下变成白色沉淀, 测 定TCA- NSI 的目的就是测定酶解物中可溶 于三氯 乙酸的小分子肽在酶解产物中所占的比重。为探讨
DH 与酶解物活性和 TCA- NSI 的关系, 在测定酶解 物羟自由基清除率和 Fe2+ 螯合率活性的同时, 测定 了酶解物的 DH 和 TCA- NSI( 见表 1) , 结果表明, 相 同水解条件下酶解物两种抗氧化活性指标的变化趋 势不同, 每种指标与 DH, TCA- NSI 之间也未呈现线 性关系。将这些指标归纳( 见图 2) 后可以看出, 随着 DH 的增大, 羟自由基清除率和 Fe2+ 螯合率活性呈现 出非同步的起伏变化, TCA- NSI 增减也没 有与 DH 同步, 意味着不同酶解条件下虽然水解度相同, 但可 能水解位点不同。因此, 可推测酶解物的 DH 和肽活 性没有直接关系。
2009 年 5 月 第 24 卷第 5 期
中国粮油学报
Journal of the Chinese Cereals and Oils Association
Vol. 24, No. 5 May 2009
大豆蛋白的酶解及其抗氧化活性研究
王章存 徐 贤 魏翠平
( 郑州轻工业学院 食品与生物工程学院, 郑州 450002)
关键词 大豆蛋白 酶解 抗氧化活性肽 三氯乙酸溶解指数 水解度 中图分类号: TS209 文献标识码: A 文章编号: 1003- 0174( 2009) 05- 0021- 04
蛋白质经酶水解制备活性肽不仅可以充分利用 蛋白资源, 所得产物在食品、日化和保健品中也具有 较高的应用价值, 因此近年来这方面的研究 报道较 多[ 1- 3] 。但目前的研究多注重不同反应条件下酶解 物活性的变化, 而对该活性变化与小分子肽含量、水 解度变化的关联性研究相对较少。抗氧化肽是蛋白 质酶水解中的重要目标活性肽, 它具有消除自由基、 抑制或减缓氧化反应的特点, 可用于改善食品品质、 延长食品的保质期, 在生物体内它可减轻自 由基对 机体的损伤等。本试验以大豆蛋白为原料研究制备 抗氧化活性肽酶解条 件及酶解物的抗氧化性能, 同 时测定了酶解物的三 氯乙酸溶解指数和水解度, 对 进一步认识活性肽的构效关系提供一定的基础。
2009 年第 5 期
2 结果与分析
2. 1 不同蛋白酶的酶解效果 首先考查不同蛋白酶对酶解物抗氧化活性、TCA
- NSI 和水解度 DH 的影 响, 以确定 合适的酶制剂。 酶反应条件依各酶制 剂产品使用建议设置, 试验结 果见图 1 所示。由图 1 可见, 碱 性蛋白酶( Alcalase) 的#OH清除率和 Fe2+ 螯合率最高, 其次是胰蛋白酶。 而在酶解物的 TCA- NSI 和 DH 的比较上, 碱性蛋白 酶仍然是最好的。综合考虑, 本试验将碱性 蛋白酶 作为最优酶选, 进一步研究和优化 大豆分离蛋白酶
图 2 大豆蛋白 DH 和酶解物活性、TCA - NSI 间的关系
2. 5 酶解物活性和 TCA- NSI 的关系 在表 1 中还发现酶解物的活性高时酶解物的小
肽含量并不高, 为了进一 步探讨酶解物活性和 TCA - NSI 的关系, 列出了酶解物活性和 TCA- NSI 的对 应关系( 见图 3) 。从图 3 中可见, 随着酶解物活性的 增加, 酶解物中小分子肽的含量并不呈增加趋势, 而 是呈起伏变化趋势。当酶解物的活性较低时小分子 肽的含量可能较多, 可推测酶解物的活性与 酶解物
46. 270 48. 957 51. 770 5. 500 70. 087 73. 503
71. 797 1. 706 16. 900 20. 467 20. 683 3. 783
74. 360 4. 273 19. 290 18. 627 20. 133 1. 506
74. 337 76. 687 76. 153 2. 350
取 1 mL 样品分别加入 3. 9 mL 去离子水, 然后加
入 FeCl2( 2 mmol/ L, 0. 1 mL) , 混匀后 加入邻菲口罗 林 ( 5 mmol/ L , 0. 2 mL) 混匀后静置 10 min。在 562 nm 下
测定样品吸光度值 Ai 。空白组以双蒸水代替样品测 得的 吸 光 值 记 为 A0, 则 样 品 对 Fe2+ 的 螯 合 力 用 E( Fe2+ ) 表示为:
B 时间/ h
1( 1) 2( 1. 5)
3( 2) 1 2 3 1 2 3
47. 070 49. 050 50. 877 3. 807 72. 223 72. 220 73. 507 1. 287 18. 020 19. 047 20. 983 2. 963 76. 630 73. 260 77. 287 4. 027
在 510 nm 处测吸光值记为 Ai, 当用双蒸水代替水杨 酸时测得的吸光值记为 Aj 。空白对照组以双蒸水代 替样品测得的吸光值记为 A0。则酶解物对羟自由基 ( #OH) 的清除率( % ) 可用 E( #OH) 表示为:
E( #OH) =
[
1-
(
Ai- Aj ) A0
]
@
100%
1. 3. 3 酶水解物对 Fe2+ 的螯合能力测定[ 6]
79. 197 75. 227 72. 753 6. 444
Fe2+
DH
螯合率/ %
/%Fra Baidu bibliotek
74. 36
15. 30
76. 93
19. 23
78. 21
22. 89
75. 64
20. 34
70. 51
20. 74
76. 92
18. 23
66. 67
18. 42
69. 23
17. 17
65. 39
21. 83
图 1 不同酶制剂水解物羟自由基清除率、 Fe2+ 螯合率、TCA- NSI 和水解度
解制备抗氧化肽的工艺条件。 2. 2 大豆分离蛋白酶解条件的确定
选用碱性蛋白酶, 分别研究 不同加酶量、温度、 pH 和酶解时间等因素对酶解物羟自由 基清除率和 Fe2+ 螯合率的变化, 并以羟自由基清除 率为主要指 标确定各因素的水平范围, 通过正交试验优化制备 抗氧化肽的酶解条件。试验结果如表 1 所示。
从表 1 中的极差分析可知, 影响#OH 清 除活性 的酶 解 因 素 顺 序 为 D > C > B > A, 最 优 组 合 为 A2B3C2D3, 即反应温度 55 e , 时间 2 h, 加酶量 0. 8% , pH 9. 5; 影响 Fe2+ 螯合活性的酶解因素顺序为 A > D > C> B, 最优组合为 A 1B3C1D3, 记反应温度 50 e , 时 间 2 h, 加酶量 0. 6% , pH 9. 5, 可见酶解过程中酶解 产物的#OH 清除活性和 Fe2+ 螯 合活性变化并非 同 步, 可能与这两种指标所需的酶解物分子组 成和大 小差异有一定关系。按上述优化的酶解条件分别做 放大试验, 所得产物羟 自由基清 除率可达 53. 43% , Fe2+ 螯合率为 80. 13% 。均高于正交试验中的组合。 2. 4 DH 与酶解物活性和 TCA- NSI 的关系
1 试验材料与方法
1. 1 材料和仪器 大豆分离蛋白: 郑州同创益生食品有限公司; 木
瓜蛋白酶: 上海源聚生物科技公司; 其他蛋白酶: 诺 维信公司; 试剂均为分析纯。
酶反应器: 自制; SC- A 型精密 恒温水槽: 宁 波 莱福公司; UV- 2000 型分光光度计: 尤尼柯上海仪器 公司; 868 型 pH 计: 上海热电仪器公司。 1. 2 蛋白质酶解方法
D> C> B> A
A> D> C> B
C> B> D> A
A> D> B> C
TCA - NSI /% 83. 54 78. 55 79. 57 74. 07 76. 61 74. 85 72. 28 64. 62 77. 44
第 24 卷第 5 期
王章存等 大豆蛋白的酶解及其抗氧化活性研究
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摘 要 研究了大豆分离蛋白的酶解条件及其产物的抗氧化活性, 分析了酶解过程中蛋白水解度( DH) 、 TCA- NSI 变化。结果表明, 碱性蛋白酶用于制备大豆蛋白抗氧化肽具有明显的优势, 正交试验优化酶解条件 下得到的酶解物羟自由基清除率可达 53. 43% , 清除活性的 IC50 为 1. 708 mg/ mL, Fe2+ 螯合率为 80. 13% , 螯合 活性的 IC50为 0. 822 mg/ mL。酶解物的羟自由基清除活性、Fe2+ 螯合能力与 DH、TCA - NSI 之间并不呈线性关 系。
#OH 清除率/ % Fe2+ 螯合率/ % DH/ % TCA - NSI/ %
试验 序号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 极差 K1 K2 K3 极差 K1 K2 K3 极差
K1 K2 K3 极差
A 温度/ e
1( 50) 1 1
2( 55) 2 2
3( 60) 3 3
47. 067 50. 563 49. 367 3. 496 76. 497 74. 357 64. 097 9. 400 19. 140 19. 770 19. 140 0. 630 80. 553 75. 177 71. 447 9. 106
E( Fe2+
)=
( 1-
Ai A0
)
@ 100%
1. 3. 4 水解度( DH) 测定 pH- stat 法[ 7] ;
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中国粮油学报
1. 3. 5 酶解物三氯乙酸溶解指数( TCA- NSI) 的测 定[ 8]
将 2. 5 mL 10%TCA 溶液加到 2. 5 mL 酶解液中, 混合振荡, 静置 10 min 后离心 4 000 r/ min @ 20 min, 取上清液测蛋白含量, 则上清液中总氮量与 酶解液 中总氮量的百分比即为 TCA- NSI( % ) 。
中小分子肽的含量并没有直接关系。当酶解物中的 小肽被水解为更小分子的肽或者氨基 酸时, 可能具 有抗氧化活性的部位被水解掉导致酶解物的抗氧化 活性降低。
图 3 酶解物活性和 TCA- NSI 的关系
2. 5 大豆分离蛋白酶解物与 VC 的抗氧化活性比较 酶解物清除自由基能力是其抗氧化的一个重要
机理, #OH 是人体内最活泼的活性氧, 可导致许多病 变, 因此清除羟自由基 可以作为抗氧化活性的重要 指标。本试验测定了不同浓度下酶解物的抗氧化能 力, 并与和 VC 的羟自由基清除活性进行了比较( 见 图 4 所示) , 可见, 大豆蛋白酶解物和 VC 的羟自由基
按不同试验条件配成大豆分离蛋白溶液, 加入
收稿日期: 2008- 05- 25 作者简介: 王章存, 男, 1963 年出生, 博士, 教授, 粮油植物 蛋白质
和食品生物技术
一定量的蛋白酶进行水解, 水解结束后沸水浴灭酶
10 min, 离心 3 500 r/ min @ 15 min, 测定上清液的羟自 由基清除率、Fe2+ 螯合率等指标。
1. 3 分析方法
1. 3. 1 蛋白质含量测定
固体物蛋白测定用凯式定 氮法( GB/ T 5009. 5 ) 2003) ; 上清液中蛋白含量测定用双缩脲法[ 4] 。 1. 3. 2 羟自由基( #OH) 清除方法[ 5]
取稀释后的样品 2 mL, 依次加入 2 mL 6 mmol/ L
的 FeSO4、2 mL 6 mmol/ L 的 H2O2, 混匀后静置 10min, 再加入 2 mL 6 mmol/ L 水杨酸, 混匀, 静置 30 min 后,
图 4 大豆分离蛋白酶解物和 VC 对#OH 的清除作用
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中国粮油学报
2009 年第 5 期
清除活性都随着其浓 度的增加而增大, 通过 线性回 归得到大豆蛋白酶解物的 IC50为 1. 708 mg/ mL, VC 的 IC50为 0. 076 mg/ mL, 虽然大豆蛋白酶解物的#OH 清 除活性不如 VC, 但大豆分离蛋白酶解物也具有较强 的清除#OH 能力。 2. 6 大豆分离蛋白酶解物与 EDTA 的抗氧化活性比较