SDS-PAGE电泳问题总结
SDS-PAGE原理及常见问题
几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS－PAGE电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW 为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是，分离胶；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
Q：样品如何处理？A：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
电泳常见问题解答
1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
2. 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta 巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。
一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。
100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris －HCL系统，TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
SDS-PAGE电泳常见问题
SDS-PAGE电泳问题总结蛋白质条带为什么走到下面逐渐变宽发散？回答:多数情况是因为小分子在胶里的运动不规律，这种情况常发生在高浓度胶或凝固不一致的胶里，你可以加大阴极的缓冲液浓度，可能会有点改善胶凝的快慢不在于TEMED多少，在于APS的量，APS提供自由基，TEMED帮助自由基作用，是催化剂，对凝固速度影响不是太大，可以试试加大APS的量丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的分辨范围15 ％ 15～45 kDa12.5％ 15～60 kDa10 ％ 18～75 kDa7.5％ 30～120kDa5 ％ 60～212kDa来源于《蛋白质技术手册》汪家政每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质，而是指在这个区间内，蛋白质迁移率基本和分子量成正比，也就是线性关系，为了数据的可靠性，大家尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。
下层也就是阳极缓冲液的作用当然是导电，用普通TRIS缓冲液做阳极缓冲液，一样跑得好，阴极就不一样了，需要提供离子强度和SDS环境，而在电泳过程中，阴极缓冲液的一些离子损失，而且与样品接触，不适合再次使用<br />至于有些时候跑太大浓度的胶，因为药品，BUFFER配制过程的一些问题，导致会出现蛋白带无法电泳到分离胶的最下方，胶跑得难看情况比较多，一般来说，15%的胶已经能够跑出大约15KDa左右的蛋白，对于普通SDS-PAGE已经几乎到了极限，还跑不出来的MARK带，就不必去追究商品的问题了SDS-PAGE胶的凝结速度受温度影响很大，随着温度的升高，凝结速度越来越快，温度降低则反之。
所以，夏天时胶凝结的比较快，而冬天脚的凝结速度则变慢，甚至不能凝结，解决此类问题较可行的方法是：冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和TEMED的使用量，可很好的解决胶凝结速度过慢的问题。
做SDS-PAGE的时候，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽，方便后面的比较，特别是WB。
SDS-PAGE的常见问题
SDS－PAGE电泳常见问题及解答Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
SDS-PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法
SDS－PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS－PAGE电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：Q：SDS－PAGE电泳的基本原理A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是，分离胶；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
实验室 SDS-PAGE 电泳中常犯的错误
3． SDS 样品中产生聚集物 单向 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品通常须在 1-2 % SDS 和 1 %（w/v）DTT（≈65 mM）或 2 %（v/v）β-巯基 乙醇（≈350 mM）存在时煮沸几分钟，以实现多肽链的彻底变性和解折叠。 错误 样品常常在冷却后直接上样到 SDS 凝胶中。通常还原剂被部分氧化，其中一部分半胱氨酸不受保护，导致重折叠和 多肽间聚集物的形成。重折叠形成模糊的区带，有时是两条带。一些聚集物在高分子量区域形成了人为的区带；其 他聚集物则过大，无法迚入凝胶，在点样孔形成了沉淀聚集。还原剂的过量可能在整个凝胶上 40-60 kDa 的分子量 范围内形成两条或三条水平线。 正确的操作 煮沸后让样品冷却至 60°C 左右，然后加入碘乙酰胺。通常我们在 100 μl 样品中加入 10 μl 20%（w/v）的碘乙 酰胺水溶液，并在室温下孵育 30 分钟。 通过这一步，我们可以获得更为锐利的条带，并排除了一些假象，如两条带、其他的高分子量条带、点样孔中的沉 淀，以及凝胶上的线。 4． SDS 电泳中运行缓冲液的滴定 到目前为止，大部分单向和双向 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用是在基于 Lämmli 的不连续缓冲液系统中开展的[1]。 其他基于磷酸盐、咪唑或其他缓冲液的均一系统表现出的分辨率和重复性不高。在不连续的“Lämmli”系统中，积 层胶和分离胶缓冲液是由指定 pH 值的 Tris 和氯离子缓冲液组成的 – 其中含有或不含 SDS，运行缓冲液中则包含 SDS、Tris 和甘氨酸。氯离子作为前导离子和甘氨酸作为尾随离子之间的不连续性控制蛋白缓慢迚入聚丙烯酰胺凝 胶，并实现积层效应，产生非常锐利和清晰可辨的区带。 错误 不幸的是，有一些操作步骤建议将 Tris-甘氨酸缓冲液的 pH 调整至 pH 8.3-8.4。这导致上层缓冲液槽中的氯离子载 量过高，产生下列影响：分离将比预期时间要长得多，且一些区带不好分辨。因氯离子相对其他所有离子有着非常 高的电泳迁移率，所以只有氯离子向阳极方向迁移，直到上层缓冲液槽中没有任何的氯离子剩余。到那时蛋白离子 才会开始迁移。在大型的电泳槽中，这需要几个小时至过夜。此外，积层效果也不如理想的不连续缓冲液那样好。 正确的操作 只使用 Tris 碱、甘氨酸和 SDS 作为运行缓冲液。请勿滴定缓冲液，即使它的 pH 高于 9。使用高质量的试剂。
SDS-PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法
SDS－PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS－PAGE电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS 会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
SDS-PAGE常见问题与解决方法
SDS-PAGE常见问题与解决方法一.凝胶问题1. 胶的凝结不好，例如有花纹特别是浓度高的胶在冬天温度较低的情况下，在分离胶的下部有波浪样的花纹，凝胶不均匀。
解决方法：加大TEMED 和过硫酸胺的量，使其凝结速度加快。
同时洗干净玻璃板，防止有残留的胶干结在玻璃板上。
2. 胶不凝，解决方法：温度较低时加大TEMED 和过硫酸胺的量，过硫酸胺必须新鲜配制。
如若还是不行重新配制一下缓冲溶液。
3. 胶易碎，例如浓度较高的胶在染色和脱色过程以及扫描过程中破裂。
解决方法：首先在上述过程中一定要动作轻缓，其次在室温较高的情况下可以适当减少 TEMED 和过硫酸胺的量。
4. 电泳完后胶上有很多长条纹的杂带，解决方法：建议电泳缓冲液不要回收利用。
配制胶的溶液一定要纯。
二. 凝胶时间不对通常胶在 30分钟到1 小时内凝。
如果凝的太慢，可能是 TEMED，AP 剂量不够。
如果凝的太快，可能是AP和TEMED 用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。
三. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳的影响前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的，一般对电泳结果不会有太大的影响。
四. 样品的处理根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS 处理、非还原 SDS 处理、带有烷基化作用的还原 SDS处理。
1. 还原SDS 处理：在上样buffer中加入 SDS 和 DTT（或Beta 巯基乙醇）后，形成SDS 与蛋白相结合的分子。
2. 带有烷基化作用的还原 SDS 处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的保护SH 基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止纹理现象的产生。
100uL样品缓冲液中加入 10uL20%的碘乙酸胺，并在25℃下保藏 30min。
3. 非还原 SDS 处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用 1%SDS 沸水中煮 3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
SDS-PAGE(聚丙烯凝胶电泳)常见问题及解决方案
1.配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
2.样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。
一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。
100ul样品缓冲液中10ul20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
3.SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED 与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
SDS-PAGE电泳、westernblotting过程中常见问题以及解决方法
SDS－PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS－PAGE 电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
SDS-PAGE聚丙烯凝胶电泳常见问题及解决办法2
（7）还有一个问题不知道大家碰到过没有。梳子的一端在浓缩胶里会自己往下降（非持续 下降）。开始梳子明明是摆放水平的，但后来就倾斜了。考虑胶已经开始聚合，就不敢再移 动梳子了。事实上梳子的厚度和 spacer 的厚度是一样的，而且梳子在胶里也有一定的浮力， 可还是出现这样的问题，不知道这是什么原因。
原文地址:/biotech/exp/bioexp/electrophoresis/2009/n82121661.html
加完分离胶后小弟一般是用 75%的酒精封顶的，不知道这样做是否正确？酒精也可以，不 过胶板洗干净后很少出现楼主说的问题的欢迎分享。关于第四条，不知道版主现在有没有找 到原因，我也出现这种情况，而且换了试剂和玻板斗不管用，以前做好好的，不知道现在怎 么出现的。关于第一点，其实主要的要保证你的两块玻璃不要有任何的缺刻（底部），否则 很容易漏胶。你们应该用的是第二代的电泳槽或者是自制的（第三代的电泳槽很少出现漏胶 现象）。关于此，我的经验是将小玻璃面向自己，左右两边放置 Spacer 之后把玻璃上缘轻 轻向怀里倾斜，这样大小玻璃底部大概有半毫米左右的差距，然后上紧螺丝（拧的时候我一 般是成对角线拧，并且不要一步到位，而是四个角换着拧，这样容易受力均匀）。什么都不 用加，我几乎从来不漏胶。同实验室的人常常用琼脂糖凝胶封底，效果也很一般。这可是一 个私人绝活哦。关于第四条，胶孔漏样的原因现在还没有找到很好的解释，但是保证浓缩胶 完全聚合，保证加浓缩胶之前彻底清除封顶水，保证拔梳子时小心别破坏胶孔，这样的问题 几乎就能避免。我和实验室另一位室友没人遇到过一次，后来就再没有发生过这种情况。东 阳水仙战友可以在这些细节上多加注意。希望这几个小点对您有帮助！：） 祝好运！关于加水封分离胶出现的问题,我们是加异丙醇封分离胶的,优点是压得严实,还有分 离胶凝固后倾倒掉异丙醇后,剩下的一点易被纸吸尽,或者挥发掉,不会留下水印关于加水封 分离胶出现的问题,我们是加异丙醇封分离胶的,优点是压得严实,还有分离胶凝固后倾倒掉 异丙醇后,剩下的一点易被纸吸尽,或者挥发掉,不会留下水印封胶的时候我们实验室用的是 正丁醇，不过气味的却太大了 《蛋白质与蛋白组学实验指南》上面推荐用正丁醇或异丁醇（异丙醇也可以） 用水上层会稀释，并且表面不平拔梳子很重要，猜测这是造成胶孔漏样的主要原因 我们 封胶不用水，而是用 75%的酒精，效果非常好，几乎不需要注意什么，加时很潇洒的从一 侧划到另一侧，凝固后胶就非常齐了，也无气味。用水封容易压不齐，毕竟水的比重还是挺 大的。
SDS-PAGE原理及常见问题
几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS－PAGE电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD 到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
Q：样品如何处理？A：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
SDS PAGE经验总结
做SDS PAGE一年多了，出现了好多问题，中间没出现过问题，现在又出现问题了，现加以总结经验及教训，望能做出完美的SDS PAGE条带出来。
1、一开始做SDS PAGE时还没出现什么问题，后来有一次开始，将5*电泳缓冲液稀释成1*时立马变得浑浊几乎浑浊到看不到梳孔的位置，让我心生纳闷，为什么稀释反而浑浊了呢，以为是污染了，于是用干净的容器仔细取试剂重新配制，结果重复了几遍还是一样的一加水稀释立即就浑浊，然后考虑是新开的一瓶鼎国的SDS（进口分装）有问题，于是更换成旧的试剂，浑浊有一点点改善，但还是一加水就浑，试着跑胶，指示剂还是能跑下来，但那片浓雾一样的浑浊看着特不舒服，网上查各位战友的经验，只见也有人有这种情况但也不明确原因，最后我无意间采用从另一处实验室制作去离子水的机子的水，稀释后很清澈透明，再也没有浑浊了，原来之前是水质不好，水中的杂质可能与缓冲液母液中SDS反应沉淀下来导致浑浊。
2、开始做电泳不久后，发现经CCB R250染色30min后，再用棕色瓶中由活性碳吸附染料的反复使用的脱色液脱色后，脱色3天仍总是不见条带，以为是电泳不好或者样品没有诱导成功所要的蛋白，不断改变电泳条件，重新配制试剂或再次诱导，重复多次仍未果，7天后才惊喜地看到还是有条带，最后经老师提醒，可能是脱色液使用多次后中间甲醇挥发了还有CCB R250染色不够，因此重新配制30%甲醇10%醋酸的脱色液，并配制新的CCB R250染色液，再次染色脱色，条带明显。
3、之前跑胶时，跑完浓缩胶后样本之间指示剂形成一条笔直的细线很漂亮，但从最近开始，跑完浓缩胶不再形成一条蓝色细线，而是很宽的带，明显样本没有浓缩好，为什么？之前用的4*Loading buffer是之前老师们配好的，这次用了同学配的6*，自己配的两种配方的4*指示剂都很宽，不知是不是Loading buffer没配好的原因，今天又重新配了浓缩胶缓冲液PH6.8和分离胶缓冲液PH8.8，排除缓冲液放太久效果不好的原因，明天再做，另外，发现老师给的配方4*Loading buffer（200mM Tris-Hcl PH6.8,0.02%溴酚蓝，8%SDS,20%甘油）配出的不仅指示剂很宽，而且配完后看上去颜色很淡，加样本后仅为淡蓝色了，比平时用的要淡很多，上样跑胶后到分离胶处时已很淡.(补充：分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、30%Acr/Bis 均重新配置，且采用另一种4*Loading buffer配方为0.2MTris-Hcl PH6.8,0.2%溴酚蓝，8%SDS,20%甘油后,浓缩胶跑完后形成一条细线，且颜色较深，因此以后当试剂放过一段时间如1个月后应重新配置)4、cfp10 esat6 cfp10-esat6三种表达蛋白经His-band Ni柱纯化，咪唑洗脱后三次透析后用PEG6000浓缩后存于-20度，后拿出溶解发现常温下EP管底部会有片状结晶，于37度消失，再置于常温又出现，后经指点，此结晶为没有透析干净的咪唑，正确透析方法为：待样本与透析液比例为1：500左右，至少应高于1：300每次震荡过夜，透析三次，比例、震荡条件及过夜相当重要。
蛋白质SDS-PAGE电泳实验常见问题及改进措施
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ｐｌｏｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ＰＡＧＥ）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳技术，常 用作蛋白 质 分 离 鉴 定［１］。聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 由 丙 烯 酰 胺 单 体 （Ａｒｃ）和交 联 剂 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 （Ｂｉｓ）在 催 化 剂 过 硫 酸 铵 （ＡＰＳ）和加速剂四甲基乙二胺 （ＴＥＭＥＤ）的作用下聚合而成。 十二烷基硫酸钠（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ，ＳＤＳ）是一种阴离子蛋 白质变性剂，它能 破 坏 蛋 白 质 分 子 内 和 分 子 间 的 氢 键，并 且 覆 盖在其表面，各亚 基 在 从 电 场 负 极 向 正 极 端 泳 动 时，其 迁 移 率 主要取决于分子量的大小［２］。
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｓａｎｅｘｔｒｅｍｅｌｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｉｓａｃｏｍｍｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｐｕｒｉｔｙ，ａｓｓｅｓｓｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔａｓｗｅｌｌ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｓｏｌｖｅｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｓｏｆｇｅｌｌｅａｋａｇｅ，ｓｏｌｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｊｕｄｇｍｅｎｔ，ｌｏｎｇｄｅｃｏｌｏｒａｔｉｏｎｔｉｍｅ，ａｎｄｕｓｅｏｆｍｅｔｈａｎｏｌｄｕｒｉｎｇＳＤＳ－ＰＡＧＥｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｓｏｍｅｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓｓｕｃｈａｓｕｓｉｎｇｗｈｉｔｅ ｔｉｐｔｏｓｏｌｖｅｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍ ｏｆｌｅａｋａｇｅ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇａｃｏｎｔｒｏｌｇｅｌｔｏｊｕｄｇｅｔｈｅｓｏｌｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｌ，ａｓｗｅｌｌａｓｒｅｐｌａｃｉｎｇｔｈｅ ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅＲ２５０ａｎｄｍｅｔｈａｎｏｌｗｉｔｈＧ２５０ａｎｄｅｔｈａｎｏｌｗａｓｐｒｏｐｏｓｅｄ．Ｔｈｅｉｍｐｒｏｖｅｄｍｅｔｈｏｄｈａｓｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆ ｓｈｏｒｔｔｉｍｅ－ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ，ｌｅｓｓｕｓｅｏｆｔｏｘｉｃｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄｉｓｍｏｒｅｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｃｌａｓｓｔｅａｃｈｉｎｇ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ；ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ｐｒｏｔｅｉｎｓｔａｉｎｉｎｇ；ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅＧ－２５０
sds-page聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质含量实验注意事项
SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质含量的实验注意事项如下：
1. 实验器材的清洁：ACr和BIs是神经性毒剂且对皮肤有刺激作用，配制贮液、配胶、灌胶操作时，要戴上医用乳胶手套或指套，避免与皮肤接触。
只要细心操作，一般不会引起损伤。
2. 严谨操作：SDS-PAGE 测定分子量有误差，不可完全信任。
有必要时，应同时作标准曲线。
并且SDS—PAGE 测定分子量有10%误差，不可完全信任。
3. 注意个人安全：在实验过程中请注意个人安全，避免直接接触化学试剂。
以上就是用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质含量的注意事项，如果您对实验步骤有疑问或者想了解更多信息，请咨询专业人士。
SDSPAGE蛋白质电泳常见问题分析
SDS-PAG窿白质电泳常见问题分析日期：2012-05-25来源：互联网作者：青岚点击：2218次摘要：SDS-PAG电泳主要利用聚丙烯酰胺的分子筛效应分离蛋白质和核酸，SDS-PAG蛋白质电泳分析可从蛋白质亚基分子量的大小就分离蛋白质。
SDS上要利用的筛效应分离蛋白质和核酸，SDS-PAG!白质电泳分析可从蛋白质亚基量的大小就分离蛋白质。
几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：Q: SDS-PAG电泳的基本原理？A: SDS聚丙烯酰胺，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS什二烷基硫酸钠），SD8与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS勺量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS^肽复合物在内稀酰胺中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与去污剂结合。
当分子量在15KD 到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX 式中：MV的分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q:配胶缓冲液系统对电泳的影响？A:在SDS-PAG不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶是，分离胶；而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL 离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH 的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
SDS-PAGE问题及解决方法
SDS-PAGE问题及解决方法一：电泳跑的太慢A.内槽缓冲液要没过凹玻璃板，低于平玻璃板。
内槽和外槽缓冲液不能相通。
B.电泳缓冲液pH值及浓度是否配制正确。
C.分离胶缓冲液和浓缩胶缓冲液pH 值及浓度是否配制正确。
D. 电压太低，选择合适的电压。
E. 样品盐浓度太大，除去样品中的盐。
二：微笑现象.电泳温度太高或者太低，1．选择合适电压；2．加入缓冲液太少，将缓冲液加满；3．如确实需要高电压，可将电泳仪至于4℃冰箱中。
三：蛋白条带歪曲或波浪形A:凝胶原因：1．胶时，胶中有气泡。
2．放入梳子时，梳子下面有气泡；3．分离胶表面不平，一定要用水覆盖；B: 样品原因：1．盐浓度高，透析除盐；2．样品有沉淀，上样前离心。
四：条带不清楚A. 凝胶原因：1．试剂一定要用高纯度；2．胶配置后不能放置时间太长；3．样品PH不对；4．缓冲液PH不对；5．降低电压或电流。
B. 样品问题：1．样品离子浓度比凝胶中的离子浓度低；使用和凝胶缓冲液一样的样品缓冲液。
2．样品浓度太高或低，减少或增加浓度；3．上样前加热样品，加热后马上放入冰水中；4．样品保存在低温中，防蛋白降解。
五：样品跑完浓缩胶，进入分离胶前没有压缩成一条直线1.浓缩胶和分离胶pH值不正确；2.浓缩胶太短；3.试剂一定要用高纯度；4.样品中钠离子或钾离子浓度高。
六：样品分不开1．凝胶浓度太大，凝胶浓度太小；调整浓度大小；2．蛋白亚基没有完全分开，样品缓冲液SDS浓度不够，充分加热。
七：制胶时漏胶玻璃板没有装好。
重新安装玻璃板，锁紧螺丝要拧紧，密封条老化。
八：样品孔之间的凝胶凝固不好凝固温度低，时间太长。
凝胶最好在25℃到30℃之间，凝固时间40分钟到一个小时。
九：电泳太快了缓冲液浓度低，电压太高。
重新正确配置缓冲液；选择合适的电压。
十：电泳结束后，凝胶底部的样品泳道比上部收缩变窄样品中的离子浓度比胶的离子浓度大，除去样品中的盐。
SDS-PAGE电泳的常见问题解析(FAQ)
活性蛋白整体方案SDS-PAGE电泳的常见问题解析（FAQ）1.关于凝胶的一些问题1.胶的凝结不好，例如有花纹特别是浓度高的胶在冬天温度较低的情况下，在分离胶的下部有波浪样的花纹，凝胶不均匀。
解决方法：加大TEMED和过硫酸胺的量，使其凝结速度加快。
同时洗干净玻璃板，防止有残留的胶干结在玻璃板上。
2.胶不凝，解决方法：温度较低时加大TEMED和过硫酸胺的量，过硫酸胺必须新鲜配制。
如若还是不行重新配制一下缓冲溶液。
3.胶易碎，例如浓度较高的胶在染色和脱色过程以及扫描过程中破裂。
解决方法：首先在上述过程中一定要动作轻缓，其次在室温较高的情况下可以适当减少TEMED和过硫酸胺的量。
4.电泳完后胶上有很多长条纹的杂带，解决方法：建议电泳缓冲液不要回收利用。
配制胶的溶液一定要纯。
2.凝胶时间不对通常胶在30分钟到1小时内凝。
如果凝的太慢，可能是TEMED，AP剂量不够。
如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。
3.浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳的影响前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的，一般对电泳结果不会有太大的影响。
4.样品的处理根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS 处理。
1.还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，形成SDS与蛋白相结合的分子。
2.带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止纹理现象的产生。
100uL样品缓冲液中加入10uL20%的碘乙酸胺，并在25℃下保藏30min。
3.非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
蛋白电泳常见问题
蛋白电泳常见问题1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
2. 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta 巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。
一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。
100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
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SDS-PAGE电泳问题总结(2012-04-19 20:07:12)转载▼标签：杂谈分类：々☆常用技术☆々蛋白质条带为什么走到下面逐渐变宽发散？回答:多数情况是因为小分子在胶里的运动不规律，这种情况常发生在高浓度胶或凝固不一致的胶里，你可以加大阴极的缓冲液浓度，可能会有点改善胶凝的快慢不在于TEMED多少，在于APS的量，APS提供自由基，TEMED帮助自由基作用，是催化剂，对凝固速度影响不是太大，可以试试加大APS的量丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的分辨范围15 ％15～45 kDa12.5％15～60 kDa10 ％18～75 kDa7.5％30～120kDa5 ％60～212kDa来源于《蛋白质技术手册》汪家政每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质，而是指在这个区间内，蛋白质迁移率基本和分子量成正比，也就是线性关系，为了数据的可靠性，大家尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。
下层也就是阳极缓冲液的作用当然是导电，用普通TRIS缓冲液做阳极缓冲液，一样跑得好，阴极就不一样了，需要提供离子强度和SDS环境，而在电泳过程中，阴极缓冲液的一些离子损失，而且与样品接触，不适合再次使用<br />至于有些时候跑太大浓度的胶，因为药品，BUFFER配制过程的一些问题，导致会出现蛋白带无法电泳到分离胶的最下方，胶跑得难看情况比较多，一般来说，15%的胶已经能够跑出大约15KDa左右的蛋白，对于普通SDS-PAGE已经几乎到了极限，还跑不出来的MARK带，就不必去追究商品的问题了SDS-PAGE胶的凝结速度受温度影响很大，随着温度的升高，凝结速度越来越快，温度降低则反之。
所以，夏天时胶凝结的比较快，而冬天脚的凝结速度则变慢，甚至不能凝结，解决此类问题较可行的方法是：冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和TEMED的使用量，可很好的解决胶凝结速度过慢的问题。
做SDS-PAGE的时候，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽，方便后面的比较，特别是WB。
做法就是拿1X的上样缓冲补全要加的样做到体积一致，否则跑出来会有的宽有的窄，特别是上样体积相差较大的加入染色液后，先放入微波炉里加热5-10秒，使染色液微热即可（千万不要加热太久，否则冰醋酸就挥发了）。
然后放水平摇床上摇20分钟，最多半小时就染好了。
脱色也很简单，不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉里煮沸5分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次，就可以了。
效果可能比正常的脱色稍差一点点，不如那样清楚，只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液）。
方便快捷！放心，反复煮胶不会把胶煮坏的。
在做蛋白表达的时候，包涵体的出现常常令大家头疼不已，现在给大家推荐盐离子染SDS-PAGE的方法，这种方法简单快速还干净，适合于切胶免疫的同学，具体操作就是把配好的0.5M的氯化钾放在冰箱预冷，然后加在胶上慢慢晃动，大约5分钟就可以看见你的蛋白条带，切胶回收后直接乳化免疫，不会有什么影响。
如果无法识别，还可以再用实验室传统的方法染色！拍胶时的“黑十字”聚焦法！很多人用相机的微距聚焦都无法使识别框变绿，其实你只需要在胶所在的平面划一个黑十字就可以很好的聚焦，尤其是western blot的图，直接在膜的边上划就可以聚焦SDSPAGE的话可以找个颜色深东西放在胶的边上就可以了，把镜头对准它SDS-PAGE [Laemmli法]这种方法帖出来，大家是不是感觉非常的陌生呢？其实这种发方法很普遍，现在大部分的实验室都是用Laemmli法跑电泳的。
如今实验室中用的最多的蛋白电泳是源于Laemmli于1970年发表在nature上的一篇文章中的方法,这篇文章很特别,不仅被引用的次数较多,而且该篇并不是专门阐述蛋白电泳方法上的提出和改进问题,而是对噬菌体头部包装过程中的蛋白进行分析过程中用到电泳分析方法而已,所以阐述如何操作的文字只有那么一小段(但相当经典),这是SDS-PAGE(不连续系统)的首次成功应用。
现在我们在实验室进行的SDS-PAGE试剂的配方仍然是沿用了它的数据,许多论文在描述其SDS-PAGE时引用Laemmli方法,目前常用的具有浓缩胶和分离胶的不连续SDS-PAGE的基础的确来自Laemmli方法,但也略有差别例如一些缓冲液的具体组成。
你也许会恍然大悟：原来我们用的就是Laemmli！借鉴Tricine-SDS-PAGE中添加甘油或者尿素来提高分辨率的成功经验，在普通的SDS-PAGE 中加入约13%的甘油，同样可以提高分辨率，有效防止小分子量蛋白的弥散。
只要把原来配方中的水换成60%的甘油，就可以了。
在分离胶中加尿素和甘油都可以，加上尿素和甘油改变胶的孔径！特别是对分离糖蛋白的时候很有用处！一方面可以把条带压窄，减少拖尾现象的产生,另一方面对分离小分子量的蛋白有好处!一般加的量在0.5－3g尿素/12ml分离胶！自己可以跑来实验一下你跑9KD 分子量的蛋白，建议用tricine-sds-page电泳来跑！也可以在分离胶中加尿素！自我经验来看，加尿素会好于甘油！Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
Q：样品如何处理？A：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1、还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或β-巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。
一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
2、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。
100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
3、非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
Q：SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？A：聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCl系统，具体作用后面介绍；TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
Q：提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。
建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。
忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。
一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。
Q：“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？A：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。
处理办法：待其充分凝固再作后续实验。
Q：“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？A：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
Q：为什么带出现拖尾现象？A：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。
Q：为什么带出现纹理现象？A：主要是样品不溶性颗粒引起的。
处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。
Q：什么是“鬼带”，如何处理？A：“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。
但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。
Q：为什么溴酚蓝不能起到指示作用？A：我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。
主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。
处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。
Q：为什么电泳的条带很粗？A：电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。
处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；Q：为什么电泳电压很高而电流却很低呢？A：这种现象一般初学者易出现。