721E型分光光度计原理和使用方法
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– 有色物质溶液颜色的深浅与其浓度有关，浓度 愈大，颜色愈深
光的基本性质
• 光是一种电磁波，具有波动性和微粒性。 • 波长(λ)、频率(υ)和光速(c)之间的关系是
υ=c/λ • 电磁波谱图
图1－1 电磁波谱
• 人的眼睛能感知的光区称为可见光区(Visible
Light) ，其波长范围约为380~760nm。
吸光光度法(Spectrophotometry )的原理
• 分光光度法：利用溶液对单色光的吸收度来 确定溶液中有色物质的含量
– 有色物质溶液颜色的深浅与其浓度有关，浓度 愈大，颜色愈深
• 吸收曲线(absorbance curve)
– 以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，即可得到一
条吸光度随波长变化的曲线，称之为吸收曲线或吸收光 谱。 – 光吸收程度最大处的波长，称为最大吸收波长 (maximal absorbance wavelength)，常用λmax表示。 – 在正常情况下，选用不同浓度的某种溶液，最大吸收 波长是固定不变的。
•条件：单色光，稀溶液 •Lambert’s Law（1760年）：It=Io×10-kb，A=kb •Beer’s Law（1852年）： It=Io×10-kc ，A=kc b：液层厚度
c:溶液浓度
光吸收基本定律
• Lambert-Beer定律(Lambert-Beer’s Law)
数学表达式：
A
应用：
• 可作为物质定性、定量 分析的依据
图1-2 KMnO4溶液的吸收曲线
λ(nm)
光吸收的基本概念
条件：一束平行单色光照射到均匀的、非散射的介质如溶液时
散射光
入射光Io
吸收光Ia
反射光
•I0=Ia+Ir+It
透射光It
•I0为入射光强度
(Intensity of the incident light)
分光光度计
仪器结构： 光源
钨丝灯 氢灯或氘灯
可见光 (Visible Light) 紫外光 (UV Light)
ห้องสมุดไป่ตู้
单色器
棱镜 光栅
吸收池（比色杯、比色皿）
检测器
光电管 光电倍增管
玻璃 可见光 石英 紫外光
显示器
检流计 数码管显示
测量条件的选择
• 入射光波长
– 一般选用被测物质溶液的λmax。可以获得较 高的灵敏度
– T=It/I0×100％ – 透光率的变化范围：?
• 吸光度(absorbance，A)：
– 透光率的负对数，又称为光密度(Optical density，OD) – A= -lgT= lg(I0/It) – 吸光度的变化范围： ?
光吸收基本定律
• Lambert-Beer定律(Lambert-Beer’s Law)
• 偏离的原因
– 物质浓度太高，改变了被吸收光的折射 率。
– 仪器的局限性:入射光、杂散光、吸光度 读数（0.2-0.7）
– 非对称的化学平衡
• 因其浓度、pH、溶剂和温度的改变，发生 解离、缔合、溶剂化和互变异构等化学变 化而发生偏离。
• 吸光光度法的原理 • 吸光度的测量 • 定量分析方法 • 721E分光光度计的操作方法 • 721E分光光度计操作练习
Io A= lg
= -lgT=abc
It
吸光度 吸光系数 液层厚度 （absorbance） (absorptivity (path
coefficient) length)
溶液浓度
(analyte concentration)
•吸光系数是物质的特征性常数
Lambert-Beer定律的偏离
(Limitations of the Lambert-Beer’s law )
光透射过去，溶 液呈现透射光的 颜色。
– 被吸收的光与透 射过去的光称为 互补色光
物质的颜色 吸收光颜色
黄绿 黄 橙红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
紫 蓝 绿蓝 绿 黄绿 黄 橙 红
吸收光波长 范围(nm) 380~435 435~480 480~500 500~560 560~580 580~595 595~650 650~760
生物化学基本实验技能训练（二）
721E型分光光度计的原理
(Spectrophotometry )
实验目的(Purpose)
1、掌握721E分光光度计的原理、结构与操 作 方法
2、学习未知溶液的浓度测定方法 3、制作CuSO4标准曲线，并用以求得未知
CuSO4溶液的浓度
主要内容(Contents)
•Ia为吸收光强度
(Intensity of the absorbant light)
•Ir为反射光
(Intensity of the reflecting light)
•It为透射光强度
(Intensity of the transmitted light)
透光率(T)与吸光度(A)
• 透光率(Transmittance，T)
• 控制适当的吸光度测量范围
– 最小误差出现在T%=20-65% (A=0.2 -0.7)的 范围内
• 选择适当的参比溶液
参比溶液的选择
a、当被测试液、显色剂及其他试剂在测定波长处都无 吸收时
可用纯溶剂(如蒸馏水 distilled water)作参比溶液；
b、当被测试液无吸收，而显色剂或其他试剂在测定波 长处有吸收时
• 物体的颜色是哪里来的？
物质对光的选择性吸收
物质对光的选择性吸收
结论：
– 物质对光的吸收具有选择性，同一种物质对不 同波长的光的吸收能力不同，不同物质对同一 波长的光的吸收能力也不同
– 物质所呈现的颜色正是它对不同波长光选择性 吸收产生的在人视觉上的反映
• 溶液的颜色
– 当白光通过某一 溶液时，该溶液 会选择性地吸收 某些波长光而让 那些未被吸收的
• 吸光光度法的原理 • 吸光度的测量 • 定量分析方法 • 721E分光光度计的操作方法 • 721E分光光度计操作练习
吸光光度法(Spectrophotometry )的原理
• 问题：如何测定溶液中某一物质的浓度？ • 提示(酸碱滴定、氧化还原、络合滴定、沉淀等)
• 分光光度法：利用溶液对单色光的吸收度来 确定溶液中有色物质的含量
可用不加试样的“试剂空白”(reagent blank)作参比溶液；
c、若被测试液本身在测定波长处有吸收，而显色剂等
无吸收时，
可用不加显色剂等的“试样空白” (sample blank)作参比溶
光的基本性质
• 光是一种电磁波，具有波动性和微粒性。 • 波长(λ)、频率(υ)和光速(c)之间的关系是
υ=c/λ • 电磁波谱图
图1－1 电磁波谱
• 人的眼睛能感知的光区称为可见光区(Visible
Light) ，其波长范围约为380~760nm。
吸光光度法(Spectrophotometry )的原理
• 分光光度法：利用溶液对单色光的吸收度来 确定溶液中有色物质的含量
– 有色物质溶液颜色的深浅与其浓度有关，浓度 愈大，颜色愈深
• 吸收曲线(absorbance curve)
– 以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，即可得到一
条吸光度随波长变化的曲线，称之为吸收曲线或吸收光 谱。 – 光吸收程度最大处的波长，称为最大吸收波长 (maximal absorbance wavelength)，常用λmax表示。 – 在正常情况下，选用不同浓度的某种溶液，最大吸收 波长是固定不变的。
•条件：单色光，稀溶液 •Lambert’s Law（1760年）：It=Io×10-kb，A=kb •Beer’s Law（1852年）： It=Io×10-kc ，A=kc b：液层厚度
c:溶液浓度
光吸收基本定律
• Lambert-Beer定律(Lambert-Beer’s Law)
数学表达式：
A
应用：
• 可作为物质定性、定量 分析的依据
图1-2 KMnO4溶液的吸收曲线
λ(nm)
光吸收的基本概念
条件：一束平行单色光照射到均匀的、非散射的介质如溶液时
散射光
入射光Io
吸收光Ia
反射光
•I0=Ia+Ir+It
透射光It
•I0为入射光强度
(Intensity of the incident light)
分光光度计
仪器结构： 光源
钨丝灯 氢灯或氘灯
可见光 (Visible Light) 紫外光 (UV Light)
ห้องสมุดไป่ตู้
单色器
棱镜 光栅
吸收池（比色杯、比色皿）
检测器
光电管 光电倍增管
玻璃 可见光 石英 紫外光
显示器
检流计 数码管显示
测量条件的选择
• 入射光波长
– 一般选用被测物质溶液的λmax。可以获得较 高的灵敏度
– T=It/I0×100％ – 透光率的变化范围：?
• 吸光度(absorbance，A)：
– 透光率的负对数，又称为光密度(Optical density，OD) – A= -lgT= lg(I0/It) – 吸光度的变化范围： ?
光吸收基本定律
• Lambert-Beer定律(Lambert-Beer’s Law)
• 偏离的原因
– 物质浓度太高，改变了被吸收光的折射 率。
– 仪器的局限性:入射光、杂散光、吸光度 读数（0.2-0.7）
– 非对称的化学平衡
• 因其浓度、pH、溶剂和温度的改变，发生 解离、缔合、溶剂化和互变异构等化学变 化而发生偏离。
• 吸光光度法的原理 • 吸光度的测量 • 定量分析方法 • 721E分光光度计的操作方法 • 721E分光光度计操作练习
Io A= lg
= -lgT=abc
It
吸光度 吸光系数 液层厚度 （absorbance） (absorptivity (path
coefficient) length)
溶液浓度
(analyte concentration)
•吸光系数是物质的特征性常数
Lambert-Beer定律的偏离
(Limitations of the Lambert-Beer’s law )
光透射过去，溶 液呈现透射光的 颜色。
– 被吸收的光与透 射过去的光称为 互补色光
物质的颜色 吸收光颜色
黄绿 黄 橙红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
紫 蓝 绿蓝 绿 黄绿 黄 橙 红
吸收光波长 范围(nm) 380~435 435~480 480~500 500~560 560~580 580~595 595~650 650~760
生物化学基本实验技能训练（二）
721E型分光光度计的原理
(Spectrophotometry )
实验目的(Purpose)
1、掌握721E分光光度计的原理、结构与操 作 方法
2、学习未知溶液的浓度测定方法 3、制作CuSO4标准曲线，并用以求得未知
CuSO4溶液的浓度
主要内容(Contents)
•Ia为吸收光强度
(Intensity of the absorbant light)
•Ir为反射光
(Intensity of the reflecting light)
•It为透射光强度
(Intensity of the transmitted light)
透光率(T)与吸光度(A)
• 透光率(Transmittance，T)
• 控制适当的吸光度测量范围
– 最小误差出现在T%=20-65% (A=0.2 -0.7)的 范围内
• 选择适当的参比溶液
参比溶液的选择
a、当被测试液、显色剂及其他试剂在测定波长处都无 吸收时
可用纯溶剂(如蒸馏水 distilled water)作参比溶液；
b、当被测试液无吸收，而显色剂或其他试剂在测定波 长处有吸收时
• 物体的颜色是哪里来的？
物质对光的选择性吸收
物质对光的选择性吸收
结论：
– 物质对光的吸收具有选择性，同一种物质对不 同波长的光的吸收能力不同，不同物质对同一 波长的光的吸收能力也不同
– 物质所呈现的颜色正是它对不同波长光选择性 吸收产生的在人视觉上的反映
• 溶液的颜色
– 当白光通过某一 溶液时，该溶液 会选择性地吸收 某些波长光而让 那些未被吸收的
• 吸光光度法的原理 • 吸光度的测量 • 定量分析方法 • 721E分光光度计的操作方法 • 721E分光光度计操作练习
吸光光度法(Spectrophotometry )的原理
• 问题：如何测定溶液中某一物质的浓度？ • 提示(酸碱滴定、氧化还原、络合滴定、沉淀等)
• 分光光度法：利用溶液对单色光的吸收度来 确定溶液中有色物质的含量
可用不加试样的“试剂空白”(reagent blank)作参比溶液；
c、若被测试液本身在测定波长处有吸收，而显色剂等
无吸收时，
可用不加显色剂等的“试样空白” (sample blank)作参比溶