第二章发酵液的预处理

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目前最常见：聚丙烯酰胺类絮凝剂
聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点
? 用量少，一般以mg/L计量； ? 絮凝体粗大，分离效果好； ? 絮凝速度快； ? 种类多，适用范围广。
聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：
存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用 于食品和医药工业时应谨慎。
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2）天然有机高分子絮凝剂
人工合成有机高分子絮凝剂虽然发展很快，但还存在 着残留单体有毒，生物降解难等问题，所以其应用受 到了限制。天然有机高分子絮凝剂具有无毒，易生物 降解，原料来源广等优点。 ?天然有机高分子改性絮凝剂根据其原料来源不同可 分为淀粉类、纤维素类、植物胶类和聚多糖类。 ?其中淀粉改性絮凝剂的研究开发最引人注目。
提取生化物质的第一步，分两部分：
发酵液
预处理
固液分离
胞外 上清液/滤液
胞内 富集细胞
4
? 发酵液成分很复杂，包含菌（细胞）体，胞内 外代谢产物，及剩余的培养基残分等。
? 不管人们所需要的产物是胞内还是胞外，都首 先要进行培养液的预处理和固液分离开，才能 进行后续操作：
? 对于胞外产物，可先将菌体或其他悬浮杂质去 处，才能从澄清的滤液中提取代谢产物。
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3）无机高分子聚合物
有聚合铁系和铝系两大类 ? 铁系絮凝剂具有操作简单、费用低，受温度影
响小，亲和力强，能有效地去除悬浮物、表面 活性剂、破坏油水乳状液的能力很强等优点， 缺点腐蚀性强、稳定性差。 ? 铝系是目前应用广、工艺较成熟的一类无机金 属盐絮凝剂，絮凝效果好，缺点具毒性等。
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微生物絮凝剂
? 电解质的凝聚能力可用凝聚价或凝聚值来表示， 使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（毫摩 尔／升），称为凝聚价或凝聚值。
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? Schulze－Hardy法则：反离子的价数越高，凝 聚价越小，即凝聚能力越强。
? 阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力受化合价、 水化半径、离子运动能力的影响，次序为
Al3+ >Fe3+ >H+ >Ca2+ >Mg2+ >K+ >Na+ >Li+
? 细胞(碎片)及某些胶体物质在某个 pH值下也可能趋于絮 凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。
? 调节发酵液的 pH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效 方法。大幅度改变 pH还能使蛋白质变性凝固。
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3
600 400
pH 2.8 pH 3.8 pH 4.2
200
pH 4.6
0
0
6
12
18
Time,minutes
? 采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发 酵液较易分离。
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絮凝
?絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分 子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其 链节上含有许多活性官能团，包括离子基团以及非 离子型基团。 ?它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强 烈地吸附在胶粒的表面。 ?当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的 胶粒表面上，产生架桥联结时，就形成较大絮团， 产生絮凝作用。
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高分子絮凝剂的吸附架桥作用
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工业上使用的絮凝剂
可分为三类：人工合成有机高分子聚合物、天然有 机高分子聚合物、无机高分子聚合物 1）目前常用的是人工合成有机高分子聚合物，如聚 丙烯酰胺类衍生物、聚乙烯亚胺衍生物；聚丙烯酸 类和聚苯乙烯类衍生物。
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高分子聚合物絮凝剂根据活性基团在水中解离情况 不同，可分为三类：阴离子型（含有羧基)、阳离子 型（含有胺基） 、非离子型
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胶体双电层结构
? 发酵液中菌体表面带有 负电荷，由于静电引力 使溶液中反离子被吸附 在其周围，在界面上形 成了双电层。
? 正离子同时受到使它们 均匀分布的热运动影响， 具有离开胶粒表面的趋 势。
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胶体双电层结构
两种相反作用力下，双电层分裂成两部： ?1）吸附层或 stern层；2）扩散层。 形成了扩散双电层的结构模型 (GouyChapman-Stern model)。
半被聚合物覆盖； ? 絮凝剂的分子量； ? pH 控制； ? 搅拌速度。
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（三） 混 凝
?对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子 型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和 产生吸附桥架的双重机理，单独使用可达到较好 絮凝效果； ?对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用 凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果。 ?这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。
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为何要对发酵液进行预处理？
? 固液分离方法主要是过滤和离心。 ? 对于细菌及某些放线菌，菌体细小，液体粘度
大，不能直接过滤，若用高速离心，能耗很大， 设备昂贵。若用膜分离技术（如微滤）易产生 膜污染，通量降低。 ? 发酵液中由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它 有机粘性物质的存在也会影响固液分离。 ? 因而寻找一种经济有效的方法来提高固液分离 速度显得十分必要。
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? 常用的凝聚剂电解质有：
硫酸铝 Al2(SO4)3?18H2O（明矾）； 氯化铝 AlCl3?6H2O; 三氯化铁 FeCl3; 硫酸亚铁 FeSO4·7H2O ； 石灰； ZnSO 4；MgCO 3
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（二）絮 凝 flocculation
? 絮凝：大分子聚电解质将胶体粒子交联 成网状，形成絮凝团的过程 机理：架桥作用
生物产品生产过程示意图
生物催化剂
灭菌 原材料
空气 除菌
检测 控制系统
生物反应器
提Βιβλιοθήκη Baidu纯化
副产品 产品 废弃物
机械能、热能
本门课程解决的问题
1
生物分离过程的一般流程
原原料料液液 细 细胞 胞分 分离 离(( 离 离心 心， ，过 过滤 滤))
细细胞胞－－胞胞内内产产物物 路线一
路线二 清液－胞外产物
路线一B 包含体
? 凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类） 作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成１ mm 大小块状凝聚体的过程。
? 絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子 量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成 10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起 架桥作用。
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（一） 凝 聚 Coagulation
凝聚：胶体粒子在中性盐促进下脱稳相互聚集成 大粒子（ 1mm） 机理： 1）中和粒子表面电荷 2）消除双电层结构 3）破坏水化膜
? ζ电位是控制胶粒间电排斥作用的电位，用来表
征双电层的特征，并作为研究凝聚机理的重要参
数。
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δ— 扩散层的有效厚度
? 式中 N一 阿伏伽德罗常数； ? T一 热力学温度： ? k — 波尔兹曼常数； ? e — 电子电荷； ? Zi— i种反离子的化合价； ? Ci — i种离子的摩尔浓度。
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二 预处理-加热
加热是发酵液预处理最简单最常用的方法。加 热能改善发酵液的操作特性。 1）加热降低液体粘度
液体黏度是温度的指数函数， 升温是降低黏度的有效措施。 流体力学原理过速率与液体的 粘度成反比，降低液体粘度 （加水稀释法和加热法等）可 有效提高过滤速率。
麦芽汁的黏度-温度曲线。
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二 预处理-加热
细胞破碎 碎碎片片分分离离
路线一A
溶解(加加盐盐酸酸胍胍、、脲脲)
粗分离(盐盐析析、、萃萃取取、、超超过过滤滤等)等
复性
纯化( 层层析析、、电电泳泳)
脱盐(凝凝胶胶过过滤滤、、超超过过滤滤)
浓缩(超超过过滤滤)
2
精制( 结结晶晶、、干干燥燥)
第二章 发酵液的预处理和
固液分离
第一讲
3
预处理和固液分离内容
Fig The effect on filtrate volume of pH
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四 加入助滤剂（filter aids）
? 一种不可压缩的多孔微粒， ? 在发酵液中加入固体助滤剂，则
菌体 可吸附于助滤剂微粒上，助 滤剂就作为胶体粒子的载体，均 匀地分布于滤饼层中，降低了滤 饼的可压缩性，减小了过滤阻力。 ? 目前生物工业中常用的助滤剂是 硅藻土，其次是珍珠岩粉、活性 炭、石英砂、石棉粉、纤维素、 白土等。
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胶体双电层结构
不同界面上形成不同 的电位: ?胶核表面的电位 φs 是整个双电层的电位 ; ?Stern平面上的电位 为φd; ?滑移面上的电位为 ζ, 称ζ电位（电动电 位）。
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ζ电位的计算：
? D — 水的介电常数； ? q — 胶体的电动电荷密度，即滑移面上的
电荷密度； δ— 扩散层的有效厚度，即为吸附层和扩 散层界面处电位φd降低到其值为1/e处的距 离，不能直接测定.
? 2）加热使蛋白质变性凝固
变性蛋白质的溶解度小。如柠檬酸发酵液加热至 80℃以上，可使蛋白质变性凝固，过滤速度加快。
? 加热处理只适用于对热较稳定的液体。注意加热温 度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。
?
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三 预处理-调节pH
pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调 节pH值可改善其过滤特性。
? 对于胞内产物，首先富集菌体，再进行细胞破 碎和碎片分离，然后提取胞内产物。
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2.1 发酵液的预处理
（Pretreatment ）
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为何要对发酵液进行预处理？
发酵液的基本特性
?发酵产物浓度较低，大多为 1-10%， ?悬浮物颗粒小，细胞的相对密度与培养液相似。 ?悬浮状态稳定：双电层、水化膜、布朗运动 ?液相粘度大 ?可压缩性
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预处理的目的
促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液 分离的效率 ：
? ⑴改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒 子的尺寸，降低液体黏度。
? ⑵ 相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离 子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。
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预处理的方法
? 凝聚和絮凝 Coagulation and flocculation ? 加热法 Heating ? 调节悬浮液的pH值 Regulation of pH ? 杂蛋白的去除 Removal of useless protein ? 高价无机离子的去除 Removal of inorganic ion ? 助滤剂Filter aids和反应剂 Reactant
? 微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂， ? 一类由微生物或其分泌物产生的具有絮凝细胞功能
的代谢产物。 ? 包括直接利用微生物细胞的絮凝剂、利用微生物细
胞壁代谢产物的絮凝剂和克隆技术所获得的絮凝剂 ? 主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分
子物质。 ? 微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相
双电层与凝聚
? 由式（14－1）和式（14一2）可知，ζ电 位与扩散层厚度δ和电动电荷密度q成正比， 而扩散层厚度又与溶液中反离子强度和电 荷成反比。
? 对带负电性菌体的发酵液，高价阳离子的 存在，可压缩扩散层的厚度，促使ζ电位 迅速降低，而且化合价越高，这种影响越 显著。
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凝聚价或凝聚值
? 在发酵液中加入具有 高价阳离子 的电解质，能 脱除胶粒表面的水化膜，降低 ζ电位，使双电 层的排斥力减少，当不足以抗衡胶粒间的范德 华引力时，由于热运动的结果导致胶粒的互相 碰撞而聚集起来。
比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境 。
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微生物絮凝剂
1、微生物絮凝剂的商业化生产始于 20世纪90年代，
如红平红球菌及由此制成的NOC-1是目前发现的最佳微生物 絮凝剂
2、微生物絮凝剂或将大部分替代普通絮凝剂 3、浮游藻类、草分枝杆茵、硅酸盐芽孢杆菌。
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絮凝的影响因素
? 发酵液的性质（细胞浓度，表面电荷）； ? 絮凝剂的浓度，最佳用量为粒子表面积约有一
滤饼：[filter cake]液体通过过滤器后保留在滤器上的原液所含的 固体物质;如通过净化甘蔗汁滤出的可用作肥料的杂质残渣 。
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五、发酵液的相对纯化
发酵液中的杂质
A.高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）
? 在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。
B.杂蛋白
?常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞，影响过滤效率。 ?采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力， ?有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化，使两相分离不清。
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一 凝聚和絮凝在发酵液预处理中的应用
? 凝聚与絮凝处理过程就是将化学药剂预先投 加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等 胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使其 聚集起来 ,增大体积以便固液分离。
? 凝聚和絮凝技术常用于菌体细小而且黏度大 的发酵液的预处理中。
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凝聚和絮凝
凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。
因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。
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（一）高价无机离子的去除方法
1. Ca2+ ——草酸、草酸钠， →形成草酸钙沉淀 （注 意回收草酸） ；
2. Mg2+——三聚磷酸钠， →形成三聚磷酸钠镁可 溶性络合物；