微生物谷氨酰胺转胺酶的乳糖诱导表达与纯化_何冬兰

第31卷第3期中南民族大学学报（自然科学版）Vol．31No．32012年9月Journal of South-Central University for Nationalities （Nat．Sci．Edition ）Sep．2012收稿日期2012-01-08作者简介何冬兰（1964-），女，教授，研究方向：分子微生物学及酶学，E-mail ：ymhlh@yahoo．com．cn 基金项目湖北省自然科学基金资助项目（2010CDZ046）微生物谷氨酰胺转胺酶的乳糖诱导表达与纯化何冬兰，邵坤彦，叶程，黄俊，尚敏邦（中南民族大学生命科学院生物工程实验室，武汉430074）摘要对已构建的工程菌株pET22b-MTG /E．coli BL21（DE3）进行质粒酶切和PCR 鉴定，优化诱导温度、时间、pH 和乳糖浓度等反应条件，采用乳糖自诱导培养基培养重组菌．并将重组菌上清液经凝胶过滤，离子交换及镍柱亲和层析后，对谷氨酰胺转胺酶纯化和SDS-PAGE 电泳分析．结果表明：谷氨酰胺转胺酶在28ħ，添加乳糖为1．2g /L 诱导18h ，pH 为7．0，培养11．5h 时升温至50ħ诱导1h ，再放至28ħ培养，表达效果较好，超过IPTG 诱导效果．纯化后酶活为7．5U /mL ，比活力为10．9U /mg．关键词谷氨酰胺转胺酶；乳糖；表达；纯化中图分类号Q556文献标识码A文章编号1672-4321（2012）03-0026-07Lactose Induction Expression and Purification of Microbial TransglutaminaseHe Donglan ，Shao Kunyan ，Ye Cheng ，Huang Jun ，Shang Minbang（Laboratory of Bio-engineering ，College of Life Science ，South-Central University for Nationalities ，Wuhan 430074，China ）AbstractAn engineering strain pET22b-MTG /E．coli BL21（DE3）was constructed and identified by plasmid digestionand PCR．The lactose inducing temperature ，time ，pH ，concentration and other conditions were optimized to cultivate recombinant strain．Then its supernatant was purified by gel filtration ，ion exchange and Ni-affinity column chromatography and analysised by SDS-PAGE electrophoresis．The results indicateded that transglutaminase was expressed more than induced by IPTG under such condition ：28ħ，1．2g /L lactose ，inducing 18h ，pH 7．0，at 11．5h up to 50ħfor 1h ，then down to 28ħ．The activity of transglutaminase reached 7．5U /mL and specific activity was 10．9U /mg after purification.Keywordstransglutaminase ；lactose ；expression ；purification谷氨酰胺转胺酶（TG ）是一种能够催化蛋白质分子与分子间及分子内部酰基进行转移的酶［1］．它不仅是一种新型的食品添加剂，还能促进伤口愈合、表皮分化、毛囊蛋白质架桥、胰岛素分泌，诱导细胞分化，催化介导细胞凋亡，识别癌变细胞组织等［2-5］．源于微生物的谷氨酰胺转胺酶（MTG ）对底物特异性要求低，分子中无Ca 2+结合位点［6］，适用于工业化生产［7］．目前利用大肠杆菌PET 系统生产重组MTG 多在培养过程中添加IPTG （异丙基β-D-硫代半乳糖苷）诱导获得．但IPTG 有潜在的毒性且价格较贵，在大规模的发酵生产中应用受限．国内外研究者发现乳糖作为诱导剂表达大肠杆菌重组产物的优越性，Sarduy ［8］等利用乳糖诱导表达的恶性疟原虫半胱氨酸蛋白酶（falcipain-2）菌体密度是用IPTG 诱导表达的1．5倍，Yi ［9］等在优化T7系统控制的谷氨酸变位酶S 时发现乳糖比IPTG 更高效．本实验利用乳糖代替IPTG 诱导MTG 表达，优化适合重组MTG大肠杆菌pET22b-MTG /E．coli BL21（DE3）的诱导表达条件，证实了以乳糖作诱导剂，对T7lac 启动子控制的重组目的产物可获得很好的诱导表达效果，并利用亲和层析等技术实现了MTG蛋白的纯化．1材料与方法1．1材料与仪器pET22b-MTG/E．coli BL21（DE3）及PCR引物1972R，0317R由中南民族大学生命科学学院分子微生物学实验室保存．蛋白marker（美国Bio-Rad公司），Ni Sepharose resin（美国GE公司），DEAE Sephadex A-50（Amersham公司），Sephadex G-75（武汉生命科技公司），咪唑、TEMED（美国Sigma公司），GSH、GSSG、DTT、β-巯基乙醇（德国Merck公司），Bam HⅠ、Hin dⅢ（日本TAKARA公司），其余为国产分析纯．自动凝胶图像分析仪（JS-380A，上海培清科技公司），PCR仪（Biometra公司），垂直板电泳仪（DYCZ-24DN，北京六一仪器厂），超声波细胞破碎机（宁波新芝生物科技公司），HD-4电脑核酸蛋白检测仪、DBS-160电脑全自动部分收集器、HL-2B数显恒流泵（上海沪西分析仪器厂），LC-20AT HPLC （LC-20AT，日本岛津公司），扫描仪（Epson Perfection4990Photo，日本爱普生公司）．1．2方法1．2．1重组菌的鉴定取1年以上重组菌株，提取质粒，取3μL质粒DNA，加1μL10ˑK buffer，0．5μL Bam HⅠ，0．5μL Hin dⅢ，5μL ddH2O，37ħ酶切过夜，取5μL溶液用0．8%琼脂糖凝胶电泳检测．另取1μL重组质粒DNA，加入5μL PCR buffer，1μL dNTP，引物各0．5μL，0．3μL Taq DNA 聚合酶，18μL ddH2O．PCR条件为：94ħ预变性5 min；94ħ1min，56ħ1min，72ħ1min，循环29次；72ħ10min，4ħ保温40min．取3μL产物用0．8%琼脂糖凝胶电泳检测．1．2．2pET22b-MTG自诱导培养及条件的优化将1%（体积比）的pET22b-MTG接种在含100μg/mL氨苄的自诱导培养基［10］（含10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L NaCl，0．32g/L葡萄糖，一定含量的乳糖，4．4g/L甘油，25mmol/LKH2PO4，17．7mmol/L Na2HPO4，2mmol/L MgSO4）中，220r/min，26h，37ħ，发酵过夜，定时取样测定A600，初步确定菌株的生长曲线，并与IPTG诱导的生长曲线相比较．条件优化后取样作SDS-PAGE分析并测蛋白浓度：（1）最佳培养温度的确定：在乳糖自诱导条件下，分别将4个50mL的摇瓶置25，28，37，45ħ培养20h，取1．0mL菌液；（2）乳糖浓度的确定：分别配置含乳糖0，0．8，1．2，1．6g/L的乳糖自诱导培养基，接种1%pET22b-MTG，分别在18，20h时取样；（3）乳糖诱导时间的确定：从培养10h 起，隔2h取样一次；（4）诱导pH的确定：调整培养基的pH值分别为6．0，6．5，7．0，7．5，8．0，8．5，接种后18h取样．1．2．3升温诱导对pET22b-MTG的影响在8个50mL的乳糖诱导培养基中，同时接种1%的pET22b-MTG/E．coli BL21（DE3）．除对照瓶外，其余分别在0，10．5，11．5，12．5，13．5，14．5，15．5h时放入50ħ摇床热诱导1h，并于28ħ摇床培养至18h，取样检测．1．2．4目的蛋白定位在最优条件下诱导表达pET22b-MTG/E．coli BL21（DE3），取25mL发酵液，12000rpm离心15 min，用10mL洗涤液（140mmol/L NaCl，2．7mmol/ L KCl，10mmol/L Na2HPO4，1．8mmol/L KH2PO4，pH7．4）洗涤后，加2mL裂解液（50mmol/L Tris-HCl，0．5mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl，10%甘油，5mmol/L DTT，pH8．0），混匀1h，超声破碎仪破胞，离心取上清，沉淀用包涵体溶解液（50mmol/ L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，0．15mol/L NaCl，8 mol/L尿素，5mmol/L DTT，pH7．5）溶解．可溶性蛋白和包涵体蛋白分别作SDS-PAGE确定表达产物的分布．1．2．5表达产物的纯化收集可溶性蛋白50mL，0．22μm滤膜过滤，超声去气泡．用缓冲液（20mmol/L PBS，20mmol/L NaCl，pH6．5）冲洗Sephadex G-75柱子至基线水平后，上样，用同一缓冲液洗脱，收集A280洗脱峰检测．50mmol/L PBS缓冲液（pH7．5）冲洗DEAE Sephadex A-50柱，上样后依次用含0．05，0．10，0．15，0．20，0．30，0．50，0．80，1．00，2．00mol/L NaCl 的PBS缓冲液洗脱，收集A280洗脱峰检测．清洗HPLC通路，将Ni+葡聚糖凝胶柱与HPLC 连接，用脱气的二次水洗涤凝胶柱至基线水平．用上样缓冲液（20mmol/L Tris-HCl，0．5mol/L NaCl，pH 7．4）平衡后上样，再用上样缓冲液洗涤Ni柱，待基线水平后，进洗脱缓冲液（20mmol/L Tris-HCl，0．5mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH7．4），收集A280洗脱峰检测．72第3期何冬兰：微生物谷氨酰胺转胺酶的乳糖诱导表达与纯化1．2．6MTG 的酶活测定与蛋白质浓度测定按照Grosswicz ［11］等的方法测定纯化过程中酶活，37ħ时，每分钟催化产生1μmol L-谷氨酰-γ-单氧肟酸的酶量定义为一个单位谷氨酰胺转胺酶的酶活．2结果与分析2．1重组菌pET22b-MTG /E．coli BL21（DE3）的质粒双酶切鉴定与PCR 鉴定pET22b-MTG 的质粒提取后经电泳检测结果见图1．由图1可见，1、2、3泳道显示两条约6．7kb 和4．0kb 的电泳条带，pET22b-MTG 的质粒约6750bp．Lane1-3：重组质粒；M ：λDNA /Hin d Ⅲmarker图1pET22b-MTG /E．coli BL21（DE3）中重组质粒的电泳检测Fig．1Electrophoresis of recombinant plasmid in pET22b-MTG /E．coli BL21（DE3）质粒DNA 经Bam H I 、Hin d III 双酶切过夜孵育后结果见图2．由图2可见，1、2、3、4泳道出现两条约5．5kb 和1．3kb 的电泳条带．而pET22b 和MTG片段的大小分别为6750bp 和1257bp ，与电泳条带大小相符，证明MTG 基因已成功与pET22b 载体连接．pET22b-MTG 的质粒DNA 经PCR 扩增后（见图3），于1257bp 处呈亮带，证明重组菌中的MTG 目的片段已被成功插入载体．2．2诱导条件的优化2．2．1生长曲线的初步测定乳糖（0h 添加）和IPTG （14h 添加）诱导pET22b-MTG /E．coli BL21（DE3）菌株的生长曲线见图4．由图4可见，12h 前菌体生长均较缓慢，14h 添加IPTG ，此时菌株A 600=0．552．26h 时3组菌均进入稳定期，IPTG 诱导的菌株A 600=1．862，与对照（无诱导剂）A 600=1．702无明显差别；而乳糖诱导的菌株A 600=2．135，明显高于其他两组．2．2．2诱导温度的确定M ：λDNA /Hin d Ⅲmarker ；Lane 1 4：重组质粒图2pET22b-MTG /E．coli BL21（DE3）中重组质粒的酶切鉴定Fig．2Restriction enzyme identification of recombinant plasmid in pET22b-MTG /E．coli BL21（DE3）图3重组质粒PCR 电泳图Fig．3Electrophoresis of recombinant plasmids byPCRt /h图4不同诱导剂处理下的pET22b-MTG /E．coli BL21（DE3）生长曲线Fig．4pET22b-MTG /E．coli BL21（DE3）growth curves under different inducers不同温度下MTG 表达量的SDS-PAGE 结果见图5．经BandScan 5．0软件分析蛋白条带得MTG 相对表达量，用Bradford 法［12］测定总蛋白表达浓度，结果见图6．由图5可见，28ħ下（Lane 3）MTG 表达量最大．由图6可见，MTG 相对表达量与总蛋白表达量在28ħ时均有最大值；37ħ时，总蛋白的量较大，而MTG 的表达量不高，证明重组菌最佳诱导温度是28ħ．2．2．3乳糖浓度的确定82中南民族大学学报（自然科学版）第31卷M ：Protein marker ；Lane 1：45ħ；Lane 2：37ħ；Lane 3：28ħ；Lane 4：25ħ图5不同温度下MTG 表达的SDS-PAGE 电泳分析Fig．5Analysis of MTG protein by SDS-PAGE at differenttemperatures图6不同温度下的MTG 相对表达量和总蛋白浓度Fig．6MTG's relative expression quantity and total protein concentration at different tempratures20h 、18h 时不同浓度的乳糖诱导MTG 的SDS-PAGE 和总蛋白表达量的测定结果分别见图7、图8．由图7可见，当乳糖的浓度为1．2g /L ，培养18h（Lane 6）蛋白的表达量较高．由图8可见，MTG 最高相对表达量为20．4%，在18h 时总蛋白的表达量为12．5g/L．Lane 1：20h ，1．6g /L 乳糖；M ：Protein marker ；Lane 2 4：1．2，0．8，0g /L 乳糖（20h ）；Lane 5 8：1．6，1．2，0．8，0g /L 乳糖（18h ）图7不同乳糖浓度下MTG 蛋白的SDS-PAGE 电泳分析Fig．7Analysis of MTG protein by SDS-PAGE under different lactose concentrations2．2．3诱导时间的确定乳糖诱导不同时间后的MTG 的SDS-PAGE 和表达量分析结果分别见图9、图10．由图9、图10可图8不同乳糖浓度下的MTG 相对表达量和总蛋白浓度Fig．8MTG's relative expression quantity and total proteins concentration under different lactose concentrations见，18h （Lane 2）后，MTG 的表达量最高，其相对表达量为24%，此时总蛋白的浓度为18．69g/L．Lane 1 6：20，18，16，14，12，10h ；M ：Protein marker 图9不同诱导时间MTG 表达的SDS-PAGE 电泳分析Fig．9Analysis of MTG protein by SDS-PAGE at different inductiontime图10不同诱导时间下的MTG 相对表达量和总蛋白浓度Fig．10MTG's relative expression quantity and total protein concentration at different induction time2．2．4诱导pH 的确定在不同pH 值下菌株经乳糖诱导18h 后，SDS-PAGE 电泳结果和蛋白表达量分析见图11和图12．由图11、图12可见，当诱导的pH 为7．0（Lane 4）时，MTG 的相对表达量最大，为11．2%，此时总蛋白浓度是9．54g /L．2．2．5升温起始时间的确定在不同起始时间开始升温诱导MTG 表达，SDS-PAGE 电泳结果与蛋白表达分析见图13和图14．由图13、图14可见，当乳糖诱导培养11．5h （Lane 4）时，升温至50ħ诱导1h 再放入28ħ培养，MTG 表达量增大，其相对表达量为23．6%，总蛋白浓度为14．53g /L．2．2．6乳糖诱导与IPTG 诱导的比较92第3期何冬兰：微生物谷氨酰胺转胺酶的乳糖诱导表达与纯化M ：Protein marker ；Lane 1 6：pH 8．5，8．0，7．5，7．0，6．5，6．0图11不同pH 下MTG 蛋白的SDS-PAGE 电泳分析Fig．11Analysis of MTG protein by SDS-PAGE at differentpH图12不同pH 下的MTG 相对表达量和总蛋白浓度Fig．12MTG's relative expression quantity and total protein concentration at differentpHLane 1：对照；Lane 2 8：0，10．5，11．5，12．5，13．5，14．5，15．5h 时开始诱导1h ；M ：Protein marker 图13不同升温起始时间MTG 蛋白的SDS-PAGE 电泳分析Fig．13Analysis of MTG protein by SDS-PAGE at different heating starttime图14不同时刻升温MTG 相对表达量和总蛋白浓度Fig．14MTG's relative expression quantity and total protein concentration at different heating start time乳糖诱导与IPTG 诱导的比较结果见图15．由图15可见，乳糖诱导MTG 的表达量（Lane 2）明显高于IPTG 诱导MTG 的表达量（Lane 1），经软件分析前者是后者的3．7倍．同时测得IPTG 和乳糖诱导条件下的蛋白浓度分别为7．24g /L 和18．8g /L ，乳糖诱导的菌体总蛋白浓度是IPTG 诱导的2．6倍．说明可用乳糖替代IPTG 诱导本工程菌株．在50 75KD 之间出现了两个条带，是由于在升温过程中某些热激基因被激活．M ：Protein marker ；Lane 1：IPTG 诱导MTG ；Lane 2：乳糖诱导MTG图15乳糖诱导与IPTG 诱导MTG 的SDS-PAGE Fig．15MTG induced by lactose and IPTG by SDS-PAGE2．3MTG 的定位与纯化2．3．1MTG 的定位将全菌、可溶性蛋白与包涵体蛋白分别进行SDS-PAGE 电泳后结果见图16．由图16可见，MTG 主要存在于pET22b-MTG 上清液中（Lane 3），有利于进一步的纯化．Lane 1：pET22b-MTG 全菌；Lane 2：pET22b-MTG 包涵体溶解液；Lane 3：pET22b-MTG 上清蛋白；Lane 4：pET22b 全菌液；M ：Protein marker图16SDS-PAGE 分析pET22b-MTG /E．coli BL21（DE3）中MTG 蛋白的分布Fig．16Distribution of MTG protein inpET22b-MTG /E．coli BL21（DE3）by SDS-PAGE2．3．2MTG 的凝胶过滤分离将pET22b-MTG 上清溶液用一次性针头滤器过滤后，进行Sephadex G-75凝胶过滤层析，结果见图17．由图17可见两个洗脱峰，1、2洗脱峰为非均一3中南民族大学学报（自然科学版）第31卷对称的单峰．经酶活检测，MTG 位于2峰中．图17MTG 蛋白凝胶过滤洗脱谱图Fig．17Elution spectrum of MTG protein by gel filtration2．3．3MTG 的离子交换分离MTG 的离子交换分离的结果见图18．由图18可见，当洗脱溶液中的盐离子浓度为0．1，0．5，0．8，1．0，2．0mol /L 时均出现了洗脱峰，经酶活检测，0．8mol /L 的洗脱峰有酶活，收集并进行亲和层析分离．图18MTG 蛋白离子交换洗脱谱图Fig．18Elution spectrum of MTG protein by ion exchange2．3．4MTG 的亲和层析分离MTG 的亲和层析分离的结果见图19．由图19可见，用Ni 柱分离酶液时出现了单一峰，该峰曲线平滑且左右对称，证明该处洗脱的蛋白较纯．图19MTG 蛋白Ni 柱洗脱峰Fig．19Ni column elution peak of MTG protein2．3．5MTG 纯化后的检测MTG 经凝胶过滤、离子交换及亲和层析后，将多批次纯化的终酶液合并，取样进行SDD-PAGE 电泳，结果见图20．由图20可见，在47KD 处出现了单一条带，标志着MTG 已达到电泳纯状态．Lane 1：纯化后的酶液；M ：Protein marker 图20纯化后MTG 蛋白的SDS-PAGE 检测Fig．20Detection of purified MTG protein by SDS-PAGE2．4MTG 的酶活与蛋白浓度的测定取超声破碎后上清，凝胶过滤、离子交换、Ni 柱纯化后酶液测定结果见表1．由表1可知，凝胶过滤后的酶液由于稀释倍数大，酶活为0．66U /mL ，低于上清中的酶活；但比活力（1．05U /mg ）为上清（0．16U /mg ）的6．5倍．随着酶蛋白溶液的逐次纯化，比活力值逐渐升高，终酶液的比活力为10．91U /mg ，纯化倍数为初始上清的68．2倍．表1MTG 蛋白纯化情况Tab．1Purification conditions of MTG protein样品酶活/（U /mL ）蛋白含量/（mg /mL ）比活力/（U /mg ）纯化倍数超声破碎后上清1．247．550．161．00凝胶过滤后酶液0．660．631．056．56离子交换后酶液3．850．755．1332．06Ni 柱纯化后酶液7．530．6910．9168．213讨论本文对重组MTG 工程菌pET22b-MTG /E．coli BL21（DE3）的乳糖诱导条件进行优化，确定了适合重组菌生长和MTG 蛋白表达的条件，其中乳糖浓度为1．2g /L ，pH 为7．0，在28ħ诱导18h ，培养11．5h 时升温表达量最大．培养过程中采取28ħ→50ħ→28ħ的变温模式，最终获得了浓度为18．8g /L 的表达产物．13第3期何冬兰：微生物谷氨酰胺转胺酶的乳糖诱导表达与纯化常规的温度诱导模式是：当菌体生长到一定密度时，将培养条件从30ħ升高至42ħ，由于42ħ时cI857基因失活，解除阻遏后的启动子开始启动外源基因的表达［13］．而谷氨酰胺转胺酶本身具有较高的热稳定性，最适温度为50ħ左右，在45 55ħ范围内都具有较高的活性．丁满生［14］等在研究温度诱导模式对重组大肠杆菌质粒拷贝数的影响时确立了二次升温诱导模式，发现二次升温诱导与一次升温诱导相比表达量提高了80%．本文对重组菌乳糖诱导后，提取可溶性蛋白溶液，再经凝胶过滤、离子交换、亲和层析，获得纯度较高的MTG，与最初有活性的酶液相比，纯化了近70倍．但由于只研究了一步升温诱导对重组菌pET22b-MTG/E．coli BL21（DE3）的影响，不同温度诱导模式对重组菌的影响可待进一步的研究．参考文献［1］王书平，刘俊华．谷氨酰胺转胺酶的研究进展［J］．湖南农业科学，2010，（15）：41-43．［2］Verma A，Mehta K．Tissue transglutaminase-mediated chemoresistance in cancer cells．Drug Res Update［J］．2007，10（4）：144-151．［3］Han I，Park H J，Seong S C，et al．Role of transglutaminase2 in apoptosis induced by hydrogen peroxide in humanchondrocytes［J］．J Orthop Res，2011，29（2）：252-257．［4］Griffin M，Casadio R，Bergamini C M．Transglutaminases：nature’s biological glues［J］．J 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