胞浆异柠檬酸脱氢酶(ICDHc)活性检测试剂盒说明书 微量法

胞浆异柠檬酸脱氢酶（ICDHc）活性检测试剂盒说明书微量法

注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

货号：BC0405

规格：100T/96S

产品内容：

提取液：液体120mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存；用时加入20mL提取液溶解；

试剂二：粉剂×1支，4℃保存；用时每支加275μL双蒸水充分溶解备用；

试剂三：粉剂×1支，4℃保存；用时每支加275μL双蒸水充分溶解备用；

产品说明：

ICDHc（EC1.1.1.42）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化异柠檬酸脱氢脱羧生成α-酮戊二酸，同时还原NADP+生成NADPH。ICDHc是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种NADPH重要来源，在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。

利用ICDHc催化NADP+还原成NADPH反应，在340nm下测定NADPH浓度的增加。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV 板）、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本的前处理：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

二、测定步骤：

1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，蒸馏水调零。

2、工作液配制：将试剂一、试剂二、试剂三按85：1：1的比例混合。

3、按下表步骤加样：

试剂名称（μL）测定管

工作液（μL）190

样本（μL）10

将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/石英96孔板中，加样本的同时开始计时，在340nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1；迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃水浴中，准确反应2分钟；迅速取出比色皿并擦干，记录2分20秒时的吸光度A2。计算ΔA=A2-A1。

注意事项：

1、若A2-A1大于0.5，需将酶液用提取液稀释，使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。若初始值A1大于0.5可尝试将酶液用提取液稀释。

2、实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活；工作液37℃水浴放置。

3、比色皿中反应液的温度必须保持37℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

4、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

三、ICDHc活力单位的计算：

a、按微量石英比色皿计算：

1、血清（浆）ICDHc活力的计算:

单位的定义：每mL血清（浆）在反应体系中每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

ICDHc（U/mL）＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样本÷T=1608×ΔA

2、组织中ICDHc活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

ICDHc（U/mg prot）＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样本×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

ICDHc（U/g鲜重）＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V样本)÷T=1608×ΔA÷W

3、细菌或培养细胞中ICDHc活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

ICDHc（U/mg prot）＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样本×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。ICDHc（U/104Cell）＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样本×500)÷T=3.2×ΔA V反总：反应总体积，2×10-4L；

ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/moL/cm；

d：石英比色皿光径，1cm；

V样本：加入样本体积，0.01mL；

V提取：加入提取液体积，1mL；

Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；

W：样本鲜重，g；

T：反应时间，2min；

500：细菌或细胞数量，500万。

b、按石英96孔板计算：

将上述公式中光径d-96孔板光径改为0.6cm。