分子荧光分析法经典PPT课件
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分子荧光分析法
1.荧光效率
能发射荧光物质条件： ①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。 ②分子必须有较高的荧光效率。 ③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
第五章 分子荧光分析法
2.分子结构与荧光的关系 （1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键
脂肪烃π-π激 （2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增
标作图E荧-λ激 （2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ荧
第五章 分子荧光分析法
4．激发光谱和荧光光谱的关系： （1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改
变。因此荧光光谱只有一个谱带。 （2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
第五章 分子荧光分析法
二、分子结构与荧光关系
第五章 分子荧光分析法
2．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射 跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动 能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能 级，这种光称为荧光。
3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础 （1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
能发射荧光物质条件： ①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。 ②分子必须有较高的荧光效率。 ③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
第五章 分子荧光分析法
2.分子结构与荧光的关系 （1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键
脂肪烃π-π激 （2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增
标作图E荧-λ激 （2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ荧
第五章 分子荧光分析法
4．激发光谱和荧光光谱的关系： （1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改
变。因此荧光光谱只有一个谱带。 （2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
第五章 分子荧光分析法
二、分子结构与荧光关系
第五章 分子荧光分析法
2．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射 跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动 能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能 级，这种光称为荧光。
3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础 （1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
第十一章荧光分析法.ppt
散射光干扰及消除
散射光：当一束平行光投射在液体试样上，大部分 被吸收或透过，小部分由于光子和物质分子相碰撞， 使光子的运动方向改变，而向不同方向散射形成的 光。
散射光包括瑞利散射光和拉曼光
瑞利散射光：无能量的交换，λ散射≈λ激发
拉曼光： 有能量转移， λ散射> <λ激发
干扰的消除
1）改变激发光的波长；
单色器1
样品池
单色器2
垂直方向
放大 与
记录
检测器
荧光仪特点
与分光光度计的主要差别
① 垂直测量方式, 消除透射光影响 ② 两个单色器，激发和发射，常用光栅
1 光源 A、白炽灯：钨灯、卤钨灯 B、气体放电灯：氢、氙、汞，
常用氙灯（波长： 250-700nm） C、激光光源 2 单色器
闪耀光栅
3 检测器 光电倍增管
5.弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成 强荧光衍生物以提高测量灵敏度。
故药物中的胺类、抗菌素、维生素、甾体类均可 用荧光法测定。该法在体内药物定量分析中应用甚 广。
思考题
• 1.荧光和磷光在产生机制上有什么不同？
• 2.何谓荧光量子效率？哪些结构物质有较高荧光效率？
• 3.以下物质中可能有最强荧光的物质是（ ）。
6.（）荧光光谱形状与激发光的波长无关。
7. 荧光光谱的特征？
1. 所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射 出比入射光( )。
A. 波长长的光线
B. 波长短的光线
C. 能量大的光线
D. 频率高的光线
2. 下列说法正确的是(
)
A 荧光发射波长永远大于激发波长
B 荧光发射波长永远小于激发波长
荧光分析法ppt课件
特点：发生在激发态的最低振动能级和基态之间；所需时间约 为10-7～10-9秒。
结果：导致荧光或磷光减弱，甚至熄灭
或
19
续前
返回2 返2回0
11.2.2 激发光谱与发射（荧光）光谱
——荧光物质分子的两个特征光谱
发射波长
激发波长
激发光谱(excitation spectrum)： F~ ex 荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ em
3
续前 荧光分析法分类：根据光源不同进行分类
激发光源
紫外－可见光
X射线
原子特征谱线
荧光分析法
分子荧光法（Molecular Fluorometry) X射线荧光法（X-ray Fluorometry) 原子荧光法（Atomic Fluorometry)
荧光分析法与可见紫外吸收光谱比较
相同点
本质
不同点
过程：当两个电子的能级非常靠近，以致其振动能级有重叠 时，电子常常由高电子能级以非辐射跃迁方式转移至低 电子能级，这种过程称为内部能量转换
特点：发生在非常靠近的两个电子能级间，他们的振动能级有 重叠；时间约10-1～10-13秒。
或
11
续前
注：
➢ 处于激发态的电子，通过振动弛豫和内部能量 转换，均回到第一激发态的最低振动能级
➢激发光谱与荧光光谱上的λmax是定性定量的依据
荧光
磷光
9
续前 1、振动弛豫（vibrational relexation）
过程：从电子激发态的某一振动能级以非辐射跃迁的方式， 回到同一电子激发态的最低振动能级的过程为振动驰豫
特点：发生在同一个电子能级内不同振动能级间的跃迁；时 间约10-12秒。
结果：导致荧光或磷光减弱，甚至熄灭
或
19
续前
返回2 返2回0
11.2.2 激发光谱与发射（荧光）光谱
——荧光物质分子的两个特征光谱
发射波长
激发波长
激发光谱(excitation spectrum)： F~ ex 荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ em
3
续前 荧光分析法分类：根据光源不同进行分类
激发光源
紫外－可见光
X射线
原子特征谱线
荧光分析法
分子荧光法（Molecular Fluorometry) X射线荧光法（X-ray Fluorometry) 原子荧光法（Atomic Fluorometry)
荧光分析法与可见紫外吸收光谱比较
相同点
本质
不同点
过程：当两个电子的能级非常靠近，以致其振动能级有重叠 时，电子常常由高电子能级以非辐射跃迁方式转移至低 电子能级，这种过程称为内部能量转换
特点：发生在非常靠近的两个电子能级间，他们的振动能级有 重叠；时间约10-1～10-13秒。
或
11
续前
注：
➢ 处于激发态的电子，通过振动弛豫和内部能量 转换，均回到第一激发态的最低振动能级
➢激发光谱与荧光光谱上的λmax是定性定量的依据
荧光
磷光
9
续前 1、振动弛豫（vibrational relexation）
过程：从电子激发态的某一振动能级以非辐射跃迁的方式， 回到同一电子激发态的最低振动能级的过程为振动驰豫
特点：发生在同一个电子能级内不同振动能级间的跃迁；时 间约10-12秒。
《分子荧光分析法》PPT课件
• 磷光是来自最低激发三重态的辐射跃迁过 程所伴随的发光现象，发光过程的速率常 数小，激发寿命相比照较长。
16
复习： 荧光的产生
hv
基态分子
激发态
回到基态，如何回去？
17
分子的吸收情况 S2
T1 S1
S0
l2
l1
18
S2
S0 l2
振动弛豫：在同一电子能级〔激发态〕… T1
S1 特点：无辐射；速率快 〔10-14～10-12 s内完成〕
O Mg N
8-羟基喹啉镁
45
➢ 空间位阻使分子共平面性下降，荧光减弱。
SO3Na
H3C N CH3
H3C SO3Na N CH3
①1-二甲胺基萘-7-磺酸盐 ②1-二甲胺基萘-8-磺酸 盐
f＝0.75
f＝0.03
➢ 顺反异构体：反式分子有荧光，而顺式分子没 有荧光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反 式有强烈荧光，而顺式无荧光。
• 波长关系：激发光＜荧光＜磷光。
12
➢无辐射失活
a.振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的 较高振动能级转至较低振动能级的过程，其 效率较高
b.内转换：当两个电子能级非常接近以致其振 动能级有重叠时，电子由高能级回到低能级 的过程。
13
➢无辐射失活
c.外转换：激发态分子与溶剂、溶质分子之间 发生相互碰撞而失去能量的过程。
─(CH=CH)2─
φ=0.28
─(CH=CH)3─
φ=0.68
32
2. 刚性构造和共平面效应
-O
O -O
C COO-
O
O
C COO-
酚酞(无荧光)
荧光黄
N O-
16
复习： 荧光的产生
hv
基态分子
激发态
回到基态，如何回去？
17
分子的吸收情况 S2
T1 S1
S0
l2
l1
18
S2
S0 l2
振动弛豫：在同一电子能级〔激发态〕… T1
S1 特点：无辐射；速率快 〔10-14～10-12 s内完成〕
O Mg N
8-羟基喹啉镁
45
➢ 空间位阻使分子共平面性下降，荧光减弱。
SO3Na
H3C N CH3
H3C SO3Na N CH3
①1-二甲胺基萘-7-磺酸盐 ②1-二甲胺基萘-8-磺酸 盐
f＝0.75
f＝0.03
➢ 顺反异构体：反式分子有荧光，而顺式分子没 有荧光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反 式有强烈荧光，而顺式无荧光。
• 波长关系：激发光＜荧光＜磷光。
12
➢无辐射失活
a.振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的 较高振动能级转至较低振动能级的过程，其 效率较高
b.内转换：当两个电子能级非常接近以致其振 动能级有重叠时，电子由高能级回到低能级 的过程。
13
➢无辐射失活
c.外转换：激发态分子与溶剂、溶质分子之间 发生相互碰撞而失去能量的过程。
─(CH=CH)2─
φ=0.28
─(CH=CH)3─
φ=0.68
32
2. 刚性构造和共平面效应
-O
O -O
C COO-
O
O
C COO-
酚酞(无荧光)
荧光黄
N O-
第十三章-荧光分析法PPT课件
内部能量转换
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
.
24
三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
.
21
（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团 －NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移
•
• • • •
cx
cs
.
34
二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
.
24
三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
.
21
（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团 －NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移
•
• • • •
cx
cs
.
34
二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs
分子荧光光谱法 ppt课件
分子荧光光谱法
Molecular Fluorescence Spectroscopy
ppt课件
1
荧光是指一种光致发光的冷发光现象。
当某种常温物质经某种波长的入射光 （通常是紫外线）照射，吸收光能后 进入激发态，并且立即退激发并发出 比入射光的的波长长的出射光（通常 波长在可见光波段）；而且一旦停止 入射光，发光现象也随之立即消失。 具有这种性质的出射光就被称之为荧 光。
3!
ppt课件
26
溶液浓度较低时：
F K I 0 2.303bc
当入射光的λ1 和 I0一定时 ： F=Kc
即： 在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质
的浓度成正比。 ————这是荧光法定量的基础。ppt课件 Nhomakorabea27
7.影响荧光强度的因素
（1）内部因素
自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
40
2.激发光谱与发射光谱的关系
（1）镜像规则 荧光光谱的形状与基态中振动能级的分布有
关，而激发光谱的形状反映了第一激发态单重态 中的振动能级的分布。一般情况下，基态和第一 激发单重态中的振动能级分布是相似的，通常荧 光光谱与激发光谱大致呈镜像对称。
ppt课件
41
ppt课件
42
（2）Stokes位移 Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程（系 间窜越、外转换、内转换）的速率常数减小的因 素（环境因素和结构因素）都可使荧光增强。
ppt课件
24
6. 荧光强度与浓度的关系
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度 （F）与
Molecular Fluorescence Spectroscopy
ppt课件
1
荧光是指一种光致发光的冷发光现象。
当某种常温物质经某种波长的入射光 （通常是紫外线）照射，吸收光能后 进入激发态，并且立即退激发并发出 比入射光的的波长长的出射光（通常 波长在可见光波段）；而且一旦停止 入射光，发光现象也随之立即消失。 具有这种性质的出射光就被称之为荧 光。
3!
ppt课件
26
溶液浓度较低时：
F K I 0 2.303bc
当入射光的λ1 和 I0一定时 ： F=Kc
即： 在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质
的浓度成正比。 ————这是荧光法定量的基础。ppt课件 Nhomakorabea27
7.影响荧光强度的因素
（1）内部因素
自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
40
2.激发光谱与发射光谱的关系
（1）镜像规则 荧光光谱的形状与基态中振动能级的分布有
关，而激发光谱的形状反映了第一激发态单重态 中的振动能级的分布。一般情况下，基态和第一 激发单重态中的振动能级分布是相似的，通常荧 光光谱与激发光谱大致呈镜像对称。
ppt课件
41
ppt课件
42
（2）Stokes位移 Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程（系 间窜越、外转换、内转换）的速率常数减小的因 素（环境因素和结构因素）都可使荧光增强。
ppt课件
24
6. 荧光强度与浓度的关系
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度 （F）与
分析化学课件-荧光分析法基本原理
仪器的校正
灵敏度 以能被检出的最低信号来表示
波长
在选定条件下用稳定荧光物质校正 用汞灯标准谱线校正
激发光谱和荧光光谱
双光束仪器时，误差可抵消
二、其他荧光分析技术简介
1.激光荧光分析 2.时间分辨荧光 3.同步荧光分析 4.胶束增敏荧光
谢谢
溶剂
水 乙醇 环己烷 CCl4 CHCl3
激 发 光（nm） 248 313 365 405 436 271 350 416 469 511 267 344 409 459 500 267 344 408 458 499 —— 320 375 418 450 —— 346 410 461 502
第二节 荧光定量分析方法
荧光分析法基本原理
一、分子荧光
（一）分子荧光的产生 1．分子的电子能级与激发过程
hc =
E
S0
S1*
T1*
电子能级的多重性 M＝2s＋1
振动驰豫
内转换 体系间跨越
磷光
吸收
荧光
外转换
（二）激发光谱与发射光谱
excitation spectrum
横坐标ex，纵坐标 发射光强度
fluorescence spectrum
一、荧光强度与物质浓度的关系
F=K’(I0-I) I=I010-ECL
F= K’I0(1-10-ECL) = K’I0(1-e-2.3ECL) 若c很小，Ecl ≤0.05 则
F=2.3K’I0Ecl=Kc
F=2.3K’I0ECL=KC
ECl≤0.05 F C ECl >0.05 F 与C不成正比
荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法
荧光法
F
分析化学课件 PPT讲义 荧光分析法
药物分析教研室
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.3 影响荧光强度的外部因素
▪ 温度 ▪ 溶剂 ▪ pH值 ▪ 荧光熄灭剂 ▪ 散射光
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.3 影响荧光强度的外部因素
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b)
荧光光谱
激发 320nm
激发350nm
荧光448nm
§2.1 荧光强度与物质浓度的关系
荧光分析法与UV-vis定量测定时仪器校正的区别
UV-vis
0
100%
T=0，A=∞
T=100%，A=0
关闭光闸，光不透 空白溶液，光全透
过，全吸收
过，不吸收
荧光分析法
F=0 空白溶液，不发射
荧光
F=100% 对照品溶液Cmax
F=50%(Cmid)
药物分析教研室
的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间。用f表示。
• 荧光效率(fluorescence efficiemcy)：又称荧光量子产率
(fluorescence quantum yield)是指激发态分子发射荧光的光子数 与基态分子吸收激发光的光子数之比。f
• 荧光寿命和荧光效率是荧光物质的重要参数！
分析化学 Analytical Chemistry
药物分析教研室
药物分析教研室
概述
• 发光(phosphorescence)：物质受到一定波长的光照射后， 外层电子跃迁后返回基态时，以光辐射的形式释放能量，这 种现象称为发光。(荧光、磷光)
• 荧光(fluorescence)：物质分子接受光子能量被激发后，从 激发态的最低振动能级返回基万言书时发射出的光。
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.3 影响荧光强度的外部因素
▪ 温度 ▪ 溶剂 ▪ pH值 ▪ 荧光熄灭剂 ▪ 散射光
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.3 影响荧光强度的外部因素
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b)
荧光光谱
激发 320nm
激发350nm
荧光448nm
§2.1 荧光强度与物质浓度的关系
荧光分析法与UV-vis定量测定时仪器校正的区别
UV-vis
0
100%
T=0，A=∞
T=100%，A=0
关闭光闸，光不透 空白溶液，光全透
过，全吸收
过，不吸收
荧光分析法
F=0 空白溶液，不发射
荧光
F=100% 对照品溶液Cmax
F=50%(Cmid)
药物分析教研室
的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间。用f表示。
• 荧光效率(fluorescence efficiemcy)：又称荧光量子产率
(fluorescence quantum yield)是指激发态分子发射荧光的光子数 与基态分子吸收激发光的光子数之比。f
• 荧光寿命和荧光效率是荧光物质的重要参数！
分析化学 Analytical Chemistry
药物分析教研室
药物分析教研室
概述
• 发光(phosphorescence)：物质受到一定波长的光照射后， 外层电子跃迁后返回基态时，以光辐射的形式释放能量，这 种现象称为发光。(荧光、磷光)
• 荧光(fluorescence)：物质分子接受光子能量被激发后，从 激发态的最低振动能级返回基万言书时发射出的光。
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激发光谱的形状与发射波长也无关
21:59:23
c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称 关系。
➢基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似； ➢基态上的零振动能级与第一激发态的各振动能级之间的跃迁和反跃迁几率相等
4 3 2 1
4 3 2 1
21:59:23
荧光强度(I f ) 吸收的光强度(Ia
)
f
kf
kf
ki
影响因素：荧光产生过程中， 辐射和无辐射过程； 与每一过程的速率常数有关；
kf 分子结构决定（内因）；
主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。
21:59:23
（1）跃迁类型：具有电子跃迁类型的结构
激发
荧光
n
振动弛豫
n
跃迁是产生荧光的主要跃迁类型
S2
反的自旋方向，即自旋配对。
S1
单重态: 如果分子中全部轨道里的
电子都是自旋配对的, s=0, M=1
三重态：电子在跃迁过程中还伴
随着自旋方向的改变，s=1,M=3
S0
21:59:23
T1 T2
3.1 荧光分析的基本原理
3.1.1分子发光的产生
振动驰豫 非
辐 射
内转换
跃
迁
系间跨越
化
去
学
活
反
化
应
外转换 熄灭或猝灭
(nm)
278~310
285~365
310~405
280~390
285~345
相对荧光强度
10
18
20
20
20
2）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光 —C=0， — COOH ， —NO2
不产生 p →π共轭
O
NO2
硝基苯：不产生荧光、弱磷光
21:59:23
二苯甲酮：弱荧光、强磷光 S1 →T1的系间窜跃产率接近1
ex =290nm (MAX)
em= 620nm(MAX)
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
21:59:23
3.1.3 荧光与分子结构的关系 分子荧光产生的必备条件
分子必须能够吸收激发光 分子必须具有一定的荧光量子产率
f
发射的光量子数 吸收的光量子数
3）取代基的位置
空间位阻对荧光发射的影响
-O3S
H3C N CH3
H3C N CH3 SO3-
F=0.75
立体异构体对荧光发射的影响
H C C H
反式二苯乙烯 强荧光物质
21:59:23
F=0.03
C CH H
顺式二苯乙烯 非荧光物质
（5）重原子取代基效应
—Cl， — Br ， —I
S1 →T1的系间窜跃由于重原子的存在增强 含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。
•较大的摩尔吸光系数 •较短的激发态寿命10-7~10-9s •串越至三重态几率小
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共轭度越大，荧光越强。
原因 ：共轭体系越大，离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易
产生。
化合物
苯萘
蒽
丁省
戊省
F
0.11 0.29
0.46
0.60
0.52
λexmax(nm) 205 286
365
390
580
λ max em
(nm)
278
322
400
480
642
21:59:23
0.92 1
21:59:23
0.18
（4）取代基效应
1）给电子取代剂加强荧光 —HN2， — NHR ， —NR2， — OH， — OR ， — CN
产生 p →π共轭
化合物
苯
苯酚 苯胺 苯基氰 苯甲醚
λ
em max
荧光分析的基本原理
1572：西班牙植物学家N.Monardes观察到荧光现象 1855：Stokes 研究荧光，提出作为一种分析手段 1865：Goppelsroder首次应用方法 1886：提出荧与化学结构关系的经验法则 1968：Jette和West 第一台光电荧光计 1956：第一台商品化的荧光分光光度计
b.发射光谱的形状与激发波长无关
分子被激发到高于S1的电子态的更高振动能级，然而由于内转换和 振动弛豫的速率很快，很快损失多余的能量而衰变到S1电子态的最低振 动能级
尽管分子受激到达不同能级的激发态，不管激发波长如何，电子都 是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层，而与 荧光体被激发至哪一个电子态无关。 无论激发波长是λ1还是λ2，荧光的波长都是λ΄2
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
21:59:23
单色器
吸收池
单色器
检测器
信号显 示系统
3.1.2 激发光谱和发射光谱
a.Stokes位移
在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为 Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液 中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发 射之间产生了能量损失。
特点：
1)灵敏度高（1-100 ppb)：有的可达0.01ppb； 2)选择性强； 3)方法简单快速，用样量少; 4)提供比较多的物理参数。
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分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学 和光能 等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态 返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。
荧光和磷光: 当紫外光照射某些物质时，由于这些物质结构的
发 射 光 子
21:59:23
荧光 磷光
激发光去除后，荧光立即消失 激发光去除后，磷光不会立即消失
激发光谱:固定测量波长(选最大 发射波长),化合物发射的荧光( 磷光)强度与照射光波长的关系 曲线 （图中曲线I ）
激发光谱形状与吸收光谱形状完全相 似，经校正后二者完全相同！
发射光谱：固定激发光波长(选 光源 最大激发波长), 化合物发射的荧 光(或磷光强度)与发射光波长关 系曲线(图中曲线II或III)。
特殊性，会发出比吸收波长更长的不同波长的可见光， 当紫外光照射停止时, 随之消失的光叫做荧光，不立 即消失的光叫磷光。
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3.1.1分子发光的产生
分子能级=电子能级(Ee)+振动能 级(Ev)+转动能级(Er)。
电子激发的多重度：M=2s+1
Pauli不相容原理：分子中同一轨
道所占据的两个电子必须具有相
S1
IF4800
4400
固定em=620nm(MAX)
1→ 4
固定ex=290nm (MAX)
1→1
4000
1→ 3
3600
3200
1→ 2
1→2
2800
1→4
2400
2000
1600
1200
1→4
800
S0
400
1→1Leabharlann 0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
21:59:23
c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称 关系。
➢基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似； ➢基态上的零振动能级与第一激发态的各振动能级之间的跃迁和反跃迁几率相等
4 3 2 1
4 3 2 1
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荧光强度(I f ) 吸收的光强度(Ia
)
f
kf
kf
ki
影响因素：荧光产生过程中， 辐射和无辐射过程； 与每一过程的速率常数有关；
kf 分子结构决定（内因）；
主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。
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（1）跃迁类型：具有电子跃迁类型的结构
激发
荧光
n
振动弛豫
n
跃迁是产生荧光的主要跃迁类型
S2
反的自旋方向，即自旋配对。
S1
单重态: 如果分子中全部轨道里的
电子都是自旋配对的, s=0, M=1
三重态：电子在跃迁过程中还伴
随着自旋方向的改变，s=1,M=3
S0
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T1 T2
3.1 荧光分析的基本原理
3.1.1分子发光的产生
振动驰豫 非
辐 射
内转换
跃
迁
系间跨越
化
去
学
活
反
化
应
外转换 熄灭或猝灭
(nm)
278~310
285~365
310~405
280~390
285~345
相对荧光强度
10
18
20
20
20
2）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光 —C=0， — COOH ， —NO2
不产生 p →π共轭
O
NO2
硝基苯：不产生荧光、弱磷光
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二苯甲酮：弱荧光、强磷光 S1 →T1的系间窜跃产率接近1
ex =290nm (MAX)
em= 620nm(MAX)
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
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3.1.3 荧光与分子结构的关系 分子荧光产生的必备条件
分子必须能够吸收激发光 分子必须具有一定的荧光量子产率
f
发射的光量子数 吸收的光量子数
3）取代基的位置
空间位阻对荧光发射的影响
-O3S
H3C N CH3
H3C N CH3 SO3-
F=0.75
立体异构体对荧光发射的影响
H C C H
反式二苯乙烯 强荧光物质
21:59:23
F=0.03
C CH H
顺式二苯乙烯 非荧光物质
（5）重原子取代基效应
—Cl， — Br ， —I
S1 →T1的系间窜跃由于重原子的存在增强 含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。
•较大的摩尔吸光系数 •较短的激发态寿命10-7~10-9s •串越至三重态几率小
21:59:23
共轭度越大，荧光越强。
原因 ：共轭体系越大，离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易
产生。
化合物
苯萘
蒽
丁省
戊省
F
0.11 0.29
0.46
0.60
0.52
λexmax(nm) 205 286
365
390
580
λ max em
(nm)
278
322
400
480
642
21:59:23
0.92 1
21:59:23
0.18
（4）取代基效应
1）给电子取代剂加强荧光 —HN2， — NHR ， —NR2， — OH， — OR ， — CN
产生 p →π共轭
化合物
苯
苯酚 苯胺 苯基氰 苯甲醚
λ
em max
荧光分析的基本原理
1572：西班牙植物学家N.Monardes观察到荧光现象 1855：Stokes 研究荧光，提出作为一种分析手段 1865：Goppelsroder首次应用方法 1886：提出荧与化学结构关系的经验法则 1968：Jette和West 第一台光电荧光计 1956：第一台商品化的荧光分光光度计
b.发射光谱的形状与激发波长无关
分子被激发到高于S1的电子态的更高振动能级，然而由于内转换和 振动弛豫的速率很快，很快损失多余的能量而衰变到S1电子态的最低振 动能级
尽管分子受激到达不同能级的激发态，不管激发波长如何，电子都 是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层，而与 荧光体被激发至哪一个电子态无关。 无论激发波长是λ1还是λ2，荧光的波长都是λ΄2
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
21:59:23
单色器
吸收池
单色器
检测器
信号显 示系统
3.1.2 激发光谱和发射光谱
a.Stokes位移
在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为 Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液 中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发 射之间产生了能量损失。
特点：
1)灵敏度高（1-100 ppb)：有的可达0.01ppb； 2)选择性强； 3)方法简单快速，用样量少; 4)提供比较多的物理参数。
21:59:23
分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学 和光能 等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态 返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。
荧光和磷光: 当紫外光照射某些物质时，由于这些物质结构的
发 射 光 子
21:59:23
荧光 磷光
激发光去除后，荧光立即消失 激发光去除后，磷光不会立即消失
激发光谱:固定测量波长(选最大 发射波长),化合物发射的荧光( 磷光)强度与照射光波长的关系 曲线 （图中曲线I ）
激发光谱形状与吸收光谱形状完全相 似，经校正后二者完全相同！
发射光谱：固定激发光波长(选 光源 最大激发波长), 化合物发射的荧 光(或磷光强度)与发射光波长关 系曲线(图中曲线II或III)。
特殊性，会发出比吸收波长更长的不同波长的可见光， 当紫外光照射停止时, 随之消失的光叫做荧光，不立 即消失的光叫磷光。
21:59:23
3.1.1分子发光的产生
分子能级=电子能级(Ee)+振动能 级(Ev)+转动能级(Er)。
电子激发的多重度：M=2s+1
Pauli不相容原理：分子中同一轨
道所占据的两个电子必须具有相
S1
IF4800
4400
固定em=620nm(MAX)
1→ 4
固定ex=290nm (MAX)
1→1
4000
1→ 3
3600
3200
1→ 2
1→2
2800
1→4
2400
2000
1600
1200
1→4
800
S0
400
1→1Leabharlann 0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900